בחינה כמותית של רגישות לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae ATP-ניצול אגרגטים באמצעות מבחני מסחרי, חי/מת מכתים

Summary

Assay ATP-מדידה פשוטה של חיים/מתים מכתים שיטת שימשו כדי לכמת והמחש Neisseria gonorrhoeae הישרדות לאחר הטיפול עם צפטריאקסון. פרוטוקול זה ניתן להרחיב לבחון את ההשפעות מיקרוביאלית של כל אנטיביוטיקה, ניתן להשתמש כדי להגדיר את הריכוז המעכב מינימלי של אנטיביוטיקה biofilms חיידקי.

Abstract

הופעתה של עמידים לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae (GC) איום בריאותי ברחבי העולם, מדגיש את הצורך לזהות אנשים נכשלים טיפול. חיידק גראם שליליים זה גורם זיבה באופן בלעדי אצל בני אדם. במהלך זיהום, הוא מסוגל טופס אגרגטים ו/או biofilms. הבדיקה הריכוז המעכב המינימלי (MIC) משמש כדי לקבוע את הרגישות לאנטיביוטיקה וכדי להגדיר את הטיפול המתאים. עם זאת, המנגנון של בהשמדה ויוו ויחסה תוצאות מעבדה לא ידועים. פותחה שיטה זה בוחן כיצד GC צבירת משפיע על רגישות לאנטיביוטיקה ואת מציגה את הקשר בין גודל צבירה של רגישות לאנטיביוטיקה. כאשר הצבירה GC, הם עמידים יותר בפני אנטיביוטיקה להרוג, עם חיידקים במרכז ששרדו צפטריאקסון טיפול טובים יותר מאלו בפריפריה. הנתונים מצביעים כי צבירת gonorrhoeae ש יכול להפחית את הרגישות צפטריאקסון, אשר אינה משתקפת באמצעות השיטות מיקרופון המבוסס על צלחת אגר רגיל. השיטה שבה נעשה שימוש במחקר זה יאפשר לחוקרים לבדוק את הרגישות בקטריאלי בתנאים הרלוונטית קלינית.

Introduction

זיבה היא שנפוצה במגע מיני זיהום (STI)¹. Neisseria gonorrhoeae (GC), diplococcal חיידק גראם שליליים, הוא סוכן סיבתי של המחלה. סימפטומים של זיהום הגניטלי עלולה לגרום לכאב במהלך מתן שתן מוכללת מכאבים באברי המין, הפרשות השופכה. זיהום לעיתים קרובות ללא תסמינים^2,3,4,5, זה מאפשר קולוניזציה המורחבת. זיהומים אלה ללא טיפול הם דאגה בריאות קשות, הן בעלות פוטנציאל כדי להקל על שידור של האורגניזם, זה יכול לגרום לסיבוכים כגון מחלה דלקתית של האגן (PID), והופץ על ידי זיבה הזיהום (DGI)⁶. זיבה עמידים לאנטיביוטיקה היא משבר בריאות הציבור העיקריים של הגדלת נטל חברתי-כלכלי⁷. הרגישות מופחתת צפלוספורינים הביא שינוי משטר טיפול אנטיביוטיקה יחיד לטיפול כפול, המשלב azithromycin או דוקסיציקלין עם צפטריאקסון⁸. הכשל מוגברת של צפטריאקסון, azithromycin^9,10, בשילוב עם זיהומים אסימפטומטיים, מדגיש את הצורך להבנת כשלים טיפול בזיבה.

המבחן הריכוז המעכב המינימלי (MIC), כולל אגר דילול ולדיסק דיפוזיה בדיקות, שימשה הבדיקה הרפואית סטנדרטי לזיהוי עמידות בפני אנטיביוטיקה. עם זאת, לא ברור אם הבדיקה מיקרופון משקף חיידקים עמידות לאנטיביוטיקה ויוו. היווצרות biofilms חיידקי תורמת ההישרדות של החיידקים בנוכחות ריכוזים אחרים של אנטיביוטיקה: הבדיקה מיקרופון אין אפשרות לזהות את אפקט¹¹. כי GC יכול ליצור biofilms על משטחים הרירית¹², אנחנו משערים אנטיביוטיקה זה הרגישות בתוך אגרגטים יהיה שונה כי ראיתי ב- GC בודדים. בנוסף, מחקרים הראו כי שלב שלוש מולקולות על פני משתנה, פילי, חלבונים הקשורים אטימות (אופה), lipooligosaccharides (לוס), המסדירים את האינטראקציות הבין-חיידק, להוביל אגרגטים בגדלים שונים^{13, 14 , 15}. התרומה של רכיבים אלה כדי עמידות לאנטיביוטיקה לא נבדקה עקב המחסור של שיטות נאותה.

כיום, ישנן מספר שיטות למדידת biofilm מיגור. כמותיים השיטה הנפוצה ביותר היא על ידי מדידת שינויים ביומסה באמצעות קריסטל ויולט מכתים¹⁶. עם זאת, השיטה דורשת משמעותי מניפולציה ניסויית, אשר יכולים ליצור פוטנציאל שגיאות ניסוי חזרה¹⁷. שיטת צביעת חי/מת המשמשת כאן מאפשר הדמיה של חיידקים מתים וחיים והפצה שלהם בתוך biofilm. עם זאת, המבנה biofilm יכול להוות מכשול פיסי אשר מפחית את צבען חדירה. לכן, לכמת חיידקים חיים/מתים בתוך קבוצה, ההכתמה היא מוגבלת biofilms קטן או קודמן-microcolonies או הסיכומים שלה. שיטות אחרות, לרבות אגר דילול ולדיסק דיפוזיה הבדיקות, אינם יכולים למדוד את ההשפעות של צבירה. לבחון GC הרגישות תוך צבירת לאחר חשיפה לאנטיביוטיקה, שיטה אידיאלית צריך לקיים את שניהם assay כמותיים שיכול למדוד לחיות חיידקים והמחש ההפצה שלהם.

ההליך המתואר כאן משלב המדידה של ATP-ניצול, חי/מת מכתים הנועד באופן כמותי, בחנו ויזואלית GC הרגישות בתוך אגרגטים בנוכחות אנטיביוטיקה.

Protocol

תחזוקה כללית של זנים GC

1. פסים gonorrhoeae ש זנים על אגר חוזרת עם 1% קלוג תוספי תזונה¹⁸ (טבלה 1, בטבלה 2) ממניות מקפיא, דגירה 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 16-18 ח' שימוש MS11 לבטא משתנה-שלב Opa (MS11Opa +), לא אופה (MS11ΔOpa), או לוס קטום (MS11ΔLgtE).
2. בזהירות לבחור pili שלילי (המושבה ללא קצה כהה) או חיובית (המושבה עם קצה כהה) מושבות מהמאמץ כל מבוסס על המושבה מורפולוגיה¹⁹ באמצעות מיקרוסקופ אור ויבתר פס על גבי צלחת חוזרת חדשה.
3. דגירה ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 16-18 שעות לפני השימוש.

2. הכדאיות כימות של הצטברויות של GC

1. לאסוף GC באמצעות של המוליך סטרילי. ספוגית GC מהצלחת ו- GC להשעות מחדש במרק ומחוממת מראש (GCP, טבלה 3) בתוספת NaHCO 4.2%₃ ו- 1% קלוג פתרונות¹⁸. השתמש ספקטרופוטומטר באורך-גל של 650 nm (OD₆₅₀ 1 = ~ 1 x CFU 109/mL) כדי לקבוע ריכוז חיידקים על תנאי.
2. התאם את הריכוז של GC ~ 1 x 10⁸ CFU/mL.
3. להוסיף µL 99 של השעיה GC מנוכי עונתיות לתוך בארות של צלחת 96-ובכן.
4. דגירה את הצלחת. בשביל 6-אייץ ' ב 37 ° C עם 5% CO₂ כדי לאפשר את החיידקים להפעיל עליה פונקציית צבירה.
5. להוסיף 1 µL של טורי צפטריאקסון מדולל (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0.2 µg/mL) כל טוב. להשאיר מספר בארות לא מטופל לשמש כפקדי.
6. דגירה את הצלחת במשך 24 שעות ביממה ב 37 ° C עם 5% CO₂.
7. Sonicate התליה 3 פעמים ב מכל קידוח עבור 5 s ב 144 W ו-20 קילו-הרץ.
8. להוסיף 100 µL של ניצול ATP זמינים מסחרית, זוהר ריאגנט לבאר כל, פיפטה למעלה-למטה עבור 3 פעמים, ואת תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 ° C עם 5% CO₂.
9. בזהירות להעביר µL 150 של תערובת מכל קידוח לתוך באר חדשה ב microplate שחור 96-ובכן ולהימנע היכרות עם בועות.
10. למדוד את ספיגת כל הבאר-560 nm באמצעות קורא צלחת.
11. לחשב שיעור ההישרדות לפי היחס של הקריאה שהושג לאחר הטיפול צפטריאקסון טורי לקריאת מבארות ללא טיפול.

3. קרינה פלואורסצנטית ניתוח מיקרוסקופי של חי/מת האגרגטים GC

1. לאסוף GC באמצעות של המוליך סטרילי. ספוגית GC מהצלחת ו- GC מחדש להשעות מראש ומחוממת GCP מדיה בתוספת 1% קלוג תוספי תזונה.
2. לקבוע את מספר החיידקים על ידי ספקטרופוטומטר באורך-גל של 650 nm ולהתאים את הריכוז של GC ~ 1 x 10⁷ CFU/mL.
3. להוסיף µL 198 GC השעיה לתוך צ'יימברס 8-ובכן coverslip למטה.
4. דגירה התא עבור 6-אייץ ' ב 37 ° C עם 5% CO₂ כדי לאפשר היווצרות צבירה.
5. להוסיף 2 µL של צפטריאקסון (µg 100/mL או דילולים שונים) כל טוב בתוך בכל מצב צבירה. תקופת דגירה של הזמן המבוקש ב 37 ° C עם 5% CO₂.
6. הוסף µL 0.6 תערובת פתרון מכתימים חי/מת לבאר כל ' תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 ° C עם 5% CO₂.
7. רוכשים את Z-סדרת תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (מיקרוסקופ המקביל יכול לשמש).
8. לנתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ למדידת גודל אגרגטים GC היחס עוצמת קרינה פלואורסצנטית (FIR) של חיים-אל-מת מכתים במצטבר לכל.

4. תמונות ניתוח

1. הערכה של גודל האגרגטים חיידקי.
   1. פתח ImageJ ופתח תמונה על-ידי גרירת קובץ תמונה מסוג raw לשורת התפריטים ImageJ.
   2. לחץ על קווים חופשיים בשורת התפריטים ImageJ ותזיזו את האזור של כל מצבור בתמונה.
   3. לחץ על ניתוח | מדד בשורת התפריטים ImageJ.
   4. להשיג את המספר בחלון חדש תחת העמודה באזור .
2. כימות של חיים-אל-מת יחס של הסיכומים
   1. פתח ImageJ ופתח תמונה על-ידי גרירת קובץ תמונה מסוג raw לשורת התפריטים ImageJ.
   2. לחץ על ניתוח | לקבוע מידות בשורת התפריטים ImageJ.
   3. בדוק את צפיפות משולבים בחלון המוקפץ ' ולחץ על ' אישור'.
   4. לחץ על התמונה | צבע | ערוצי כלי שורת התפריטים, בחר צבע.
   5. בדוק בערוץ 1 כמו זריחה על חיידקים חיים מכתים.
   6. לחץ על קווים חופשיים בשורת התפריטים ImageJ ותזיזו את האזור של כל מצבור.
   7. לחץ על ניתוח | מדד בשורת התפריטים ImageJ.
   8. להשיג את המספר תחת העמודה IntDen .
   9. בדוק בערוץ 2 כמו זריחה על צביעת חיידקים מתים. חזור על שלבים 4.2.6-4.2.8.
   10. להשיג את היחס לחיות-אל-מת על-ידי חלוקת מספר מהשלב 4.2.8 לפי מספר מהשלב 4.2.9.
3. ניתוח סטטיסטי
   1. פתח GraphPad מנסרה, הזן את המספרים המתקבלים ImageJ אל העמודה הרצויה.
   2. לחץ על Analyze ובחר t בדיקות תחת העמודה ניתוחים.
   3. בדוק את העמודה הרצויה עבור השוואה ' ולחץ על ' אישור'.
   4. להשיג ערך P מתחת לחלון ניתוח .
   5. בחר את הרגרסיה הליניארית תחת ניתוחים XY מ שלב 4.3.3
   6. להשיג את R בריבוע ואת ערך-P מתחת לחלון ניתוח.

תוצאות

שתי שיטות הועסקו: assay ניצול של ATP ואת וזמינותו מוכתמים חי/מת. התוצאות ניתן להיות משולב או בנפרד המשמש לבחינת הישרדות חיידקי בתוך אגרגטים לאחר טיפול אנטיביוטי. ATP הניצול וזמינותו הוכח כדי למדוד במדויק קיימא חיידקים S. aureus biofilms^20,21. כאן, פיל...

Discussion

חיידקים יכולים ליצור biofilms במהלך זיהום של הגוף האנושי. בדיקת מיקרופון מסורתיות אינן משקפות בהכרח את הריכוז הדרוש כדי למגר חיידקים ממבנה biofilm. כדי לבדוק את ההשפעות antimicrobials על ממבנה biofilm, שיטות בהתבסס על biofilm ביומסה, כמו גם plating CFUs יכול להיות מוטעים עקב ההשפעה של מבנה biofilm. לדוגמה, שיטת ציפוי פוע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Kellogg's supplement
Agar	United States Biological	A0930
BacTiter Assay	Promega	G8232
Ceftriaxone	TCI	C2226
Difco GC medium base	BD	228950
Ferric nitrate, nonahydrate	Sigma-Aldrich	254223-10G
Glucose	Thermo Fisher Scientific	BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder	Fisher Scientific	BP379-100
BacLight live/dead staining	Invitrogen	L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain			kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Fisher Scientific	P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Fisher Scientific	BP329-1
Proteose Peptone	BD Biosciences	211693
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S671-10
Soluble Starch	Sigma-Aldrich	S9765
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754-5G
Equipment
Petri Dishes	VWR	25384-302
8-well coverslip-bottom chamber	Thermo Fisher Scientific	155411
96-well tissue culture plates	Corning, Falcon	3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)	Nuaire	32776
CO2 Incubator	Fisher Scientific	Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber	Leica	SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate	Corning	3904
Glomax Illuminator	Promega	E6521
Pipette tips (0.1-10 µL)	Thermo Fisher Scientific	02-717-133
Pipette tips (1000 µL)	VWR	83007-382
Pipette tips (200 µL)	VWR	53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV	Pharmacia Biotech	80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes	VWR	21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL)	Sorenson BioScience	16070
Sterile polyester-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-122
Sonicator	Kontes	Equivelent to 9110001