Quantitative Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeit von Neisseria Gonorrhoeae Aggregate verwenden ATP-Auslastung kommerziellen Assays und Live/Dead Färbung

Zusammenfassung

Eine einfache Messung der ATP Assay und lebenden/Toten Färbung Methode dienten zu quantifizieren und zu visualisieren, Neisseria Gonorrhoeae Überleben nach Behandlung mit Ceftriaxon. Dieses Protokoll kann verlängert werden, um die antimikrobielle Wirkung der jedes Antibiotikum zu untersuchen und kann verwendet werden, um die minimalen inhibitorischen Konzentration der Antibiotika bei bakteriellen Biofilmen definieren.

Zusammenfassung

Die Entstehung von Antibiotika-resistenten Neisseria Gonorrhoeae (GC) ist ein weltweit Gesundheitsrisiko dar und unterstreicht die Notwendigkeit, Personen zu identifizieren, die Behandlung nicht. Dieses gramnegatives Bakterium verursacht Gonorrhoe ausschließlich beim Menschen. Während der Infektion ist es in der Lage, Form Aggregate und/oder Biofilme. Der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) Test dient für Anfälligkeit gegen Antibiotika zu bestimmen und entsprechenden Behandlung zu definieren. Der Mechanismus der die Beseitigung der in-vivo und ihre Beziehung zur Laborergebnisse sind nicht bekannt. Eine Methode, die untersucht, wie GC Aggregation Antibiotikaempfindlichkeit beeinflusst und zeigt die Beziehung zwischen aggregierte Größe und Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika wurde entwickelt. Wenn GC Aggregat sie resistenter gegen Antibiotika töten sind, überleben mit Bakterien im Zentrum Ceftriaxon-Behandlung besser als in der Peripherie. Die Daten zeigen, dass N. Gonorrhoeae Aggregation seiner Anfälligkeit für Ceftriaxon, reduzieren kann, was nicht mit den standard Agar-Platte-basierte MIC Methoden widerspiegelt. In dieser Studie verwendete Methode ermöglicht es Forschern, bakterielle Anfälligkeit unter klinisch relevanten Bedingungen zu testen.

Einleitung

Gonorrhoe ist eine gemeinsame sexuell übertragbare Infektionen (STI)¹. Neisseria gonorrhoeae (GC), ein gramnegatives diplococcal Bakterium ist der Erreger dieser Krankheit. Symptome der genitalen Infektion führt zu Schmerzen beim Wasserlassen, generalisierte genitale Schmerzen und Harnröhre entladen. Infektion ist oft asymptomatisch^2,3,4,5, und dies ermöglicht eine erweiterte Kolonisation. Diese unbehandelten Infektionen sind ein großes gesundheitliches Problem, da sie das Potenzial, die Übertragung des Organismus zu erleichtern und dies kann zu Komplikationen wie Adnexitis (PID) und verbreitet Gonokokken-Infektion (DGI)⁶. Antibiotika-resistenten Tripper ist eine Krise des öffentlichen Gesundheitswesens und eine zunehmende sozioökonomische Last⁷. Geringere Anfälligkeit für Cephalosporine führte Behandlung Therapie Wechsel von ein einziges Antibiotikum zur dualen Therapie verbindet Azithromycin oder Doxycyclin mit Ceftriaxon⁸. Das erhöhte Scheitern von Ceftriaxon und Azithromycin^9,10, in Kombination mit asymptomatische Infektionen, unterstreicht die Notwendigkeit der Gonorrhoe Behandlungsversagen zu verstehen.

Der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC)-Test, einschließlich der Agar-Verdünnung und Disc-Diffusion-Tests, wurde als der standard medizinischer Test zur Identifizierung von Widerstand gegen ein Antibiotikum eingesetzt. Es ist jedoch unklar, ob der MIC Test bakterielle Resistenz gegen Antibiotika in-vivo widerspiegelt. Die Entstehung von bakteriellen Biofilmen trägt für das Überleben der Bakterien im Beisein von bakterizide Konzentrationen des Antibiotikums: die MIC-Tests sind nicht in der Lage, diesen Effekt¹¹zu erkennen. Weil GC auf Schleimhaut-Oberflächen¹²Biofilme bilden kann, wir stellen die Hypothese auf, dass Antibiotikum Anfälligkeit innerhalb Aggregate wäre anders als in einzelnen GC gesehen. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass drei--Variable Oberflächenmoleküle, Pili, Deckkraft-assoziierten Protein (Opa Phasen) und Lipooligosaccharides (LOS), die Inter Bakterie Interaktionen regulieren, zu verschiedenen großen Aggregate^13, führen ^{14 , 15}. der Beitrag dieser Komponenten zu Antibiotika-Resistenz wurde nicht durch den Mangel an geeigneten Methoden geprüft.

Derzeit gibt es mehrere Methoden, um die Beseitigung der Biofilm zu messen. Die am weitesten verbreitete quantitative Methode ist durch Messung der Biomasse mit Kristallviolett¹⁶Färbung. Die Methode erfordert jedoch erhebliche experimentelle Manipulation, die möglicherweise Fehler im Experiment wiederholt¹⁷erzeugen kann. Die lebenden/Toten Färbung Methode hier ermöglicht die Visualisierung von lebenden und toten Bakterien und deren Verteilung innerhalb der Biofilm. Die Biofilm-Struktur kann jedoch als eine physikalische Barriere darstellen, die Farbstoff eindringen reduziert. Daher beschränkt sich um lebenden/Toten Bakterien innerhalb einer Gruppe zu quantifizieren, die Färbung auf kleine Biofilmen oder seine Vorläufer-Mikrokolonien oder Aggregationen. Andere Methoden, einschließlich der Agar Verdünnung und Disc Verbreitung Tests sind nicht in der Lage, die Auswirkungen der Aggregation zu messen. GC-Anfälligkeit in Aggregation nach antibiotische Belichtung, eine ideale Methode untersuchen brauchen haben beide ein quantitativen Assay, der messen kann lebende Bakterien und deren Verteilung zu visualisieren.

Das hier beschriebene Verfahren kombiniert eine ATP-Nutzung-Messung und einer lebenden/Toten Färbung quantitativ zu bestimmen und visuell prüfen GC Anfälligkeit innerhalb Aggregate in Anwesenheit von Antibiotika.

Protokoll

1. Allgemeine Wartung von GC-Stämme

1. N. Gonorrhoeae Stämme Streifen auf GCK-Agar mit 1 % Kellogg ergänzt¹⁸ (Tabelle 1, Tabelle 2) aus den Beständen der Gefrierschrank und inkubieren Sie 37 ° C mit 5 % CO₂ für 16-18 h Nutzung MS11 Ausdruck Phase-Variable Opa (MS11Opa +), keine Opa (MS11ΔOpa), oder einen abgeschnittenen LOS (MS11ΔLgtE).
2. Wählen Sie sorgfältig Pili negative (Kolonie ohne dunkle Kante) oder positiv (Kolonie mit dunklen Rand) Kolonien aus jedem Stamm basierend auf Kolonie Morphologie¹⁹ mit einem sezierenden Lichtmikroskop und Streifen auf einen neuen GCK-Teller.
3. Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO₂ für 16-18 Uhr vor dem Gebrauch.

(2) Lebensfähigkeit Quantifizierung der GC Aggregationen

1. GC mit einem sterilen Applikator zu sammeln. Tupfer GC aus der Platte und wieder auszusetzen GC in vorgewärmten Brühe (GCP, Tabelle 3) ergänzt mit 4,2 % Nahco3₃ und 1 % Kellogg Lösungen¹⁸. Verwenden Sie Spektrophotometrie bei einer Wellenlänge von 650 nm (ein OD-₆₅₀ 1 = ~ 1 x 109 KBE/mL) zur Bestimmung der Konzentration von Bakterien ausgesetzt.
2. Passen Sie die Konzentration der GC bis ~ 1 x 10⁸ KBE/mL.
3. Fügen Sie 99 µL bereinigte GC Suspension in Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
4. Inkubieren Sie die Platte für 6 h bei 37 ° C mit 5 % CO₂ , die Bakterien zu aggregieren.
5. Fügen Sie 1 µL serielle verdünnten Ceftriaxon (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6.2, 3.1, 1,5, 0,8, 0,4, 0,2 µg/mL) in jede Vertiefung. Lassen Sie einige Brunnen unbehandelt als Kontrollen dienen.
6. Inkubieren Sie die Platte für 24 h bei 37 ° C mit 5 % CO₂.
7. Beschallen Sie die Suspension 3 Mal in jede Vertiefung für 5 s 144 W und 20 kHz.
8. Fügen Sie 100 µL kommerziell verfügbare ATP Auslastung Glühen Reagenz in jede Vertiefung, pipette- und 3 Mal, und 15 min bei 37 ° C mit 5 % CO₂inkubieren.
9. Vorsichtig 150 µL Gemisch aus jedem Brunnen in einen neuen Brunnen in einer 96-Well schwarz Mikrotestplatte übertragen und Einführung von Luftblasen zu vermeiden.
10. Messen Sie die Absorption von jedem Bohrloch bei 560 nm mit dem Teller-Reader.
11. Berechnen Sie die Überlebensrate nach dem Verhältnis der Lesung Lesung aus unbehandelten Brunnen nach seriellen Ceftriaxon-Behandlung erhalten.

(3) Fluoreszenz mikroskopische Analyse der Live/Dead GC Aggregate

1. GC mit einem sterilen Applikator zu sammeln. Tupfer GC aus der Platte und wieder auszusetzen GC im vorgewärmten GCP Medien plus 1 % ergänzt Kellogg.
2. Bestimmen Sie die Anzahl der Bakterien durch Spektralphotometrie bei einer Wellenlänge von 650 nm und passen Sie die Konzentration der GC bis ~ 1 x 10⁷ KBE/mL.
3. 198 µL GC Suspension in in 8-Brunnen Deckglas-unten Kammern hinzufügen.
4. Inkubieren Sie die Kammer für 6 h bei 37 ° C mit 5 % CO₂ Aggregation Bildung zu ermöglichen.
5. Fügen Sie 2 µL Ceftriaxon (100 µg/mL oder verschiedenen Verdünnungen) in jede Vertiefung innerhalb jedes Aggregation Zustand. Die gewünschte Zeit bei 37 ° C mit 5 % CO₂inkubieren.
6. Fügen Sie 0,6 µL lebenden/Toten Färbung Lösung Mischung in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 20 min bei 37 ° C mit 5 % CO₂.
7. Z-Serie-Bilder mit einem konfokalen Mikroskop (ein Äquivalent Mikroskop einsetzbar) zu erwerben.
8. Analysieren Sie die Bilder mit ImageJ-Software zur Messung der Größe des GC-Aggregate und die Fluoreszenz Intensitätsverhältnis (FIR) der lebenden Toten Färbung in jedes Aggregat.

(4) Bildanalyse

1. Abschätzung der Größe der bakteriellen Aggregate.
   1. Öffnen Sie ImageJ und öffnen Sie ein Bild, indem Sie eine raw-Bild-Datei auf ImageJ-Menü-Leiste ziehen.
   2. Klicken Sie Freihandlinien in der Menüleiste ImageJ und Kreis Bereich jede Aggregation im Bild.
   3. Klicken Sie auf analysieren | Maßnahme in der Menüleiste ImageJ.
   4. Erhalten Sie die Zahl in einem neuen Fenster unter der Spalte Fläche .
2. Quantifizierung der lebenden Toten Verhältnis der Aggregationen
   1. Öffnen Sie ImageJ und öffnen Sie ein Bild, indem Sie eine raw-Bild-Datei auf ImageJ-Menü-Leiste ziehen.
   2. Klicken Sie auf analysieren | Legen Sie Messungen in der Menüleiste ImageJ.
   3. Überprüfen Sie die integrierte Dichte im Pop-up-Fenster und klicken Sie auf "OK".
   4. Klicken Sie auf Bild | Farbe | Werkzeug-Kanäle in der Menüleiste und wählen Sie Farbe.
   5. Aktivieren Sie Kanal 1 als die Fluoreszenz für lebende Bakterien Färbung.
   6. Klicken Sie Freihandlinien in der Menüleiste ImageJ und Kreis Bereich jede Aggregation.
   7. Klicken Sie auf analysieren | Maßnahme in der Menüleiste ImageJ.
   8. Ermittelt Anzahl unter IntDen Spalte.
   9. Kanal 2 als die Fluoreszenz für Tote bakterielle Verfärbungen zu überprüfen. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.6-4.2.8.
   10. Erhalten Sie das Verhältnis der lebenden Toten durch die Aufteilung der Zahl von Schritt 4.2.8 durch Zahl von Schritt 4.2.9.
3. Statistische Analyse
   1. Öffnen Sie GraphPad Prism zu und geben Sie die Nummern auf die gewünschte Spalte von ImageJ erhalten.
   2. Klicken Sie auf analysieren , und wählen Sie t-Tests unter Spalte Analysen.
   3. Überprüfen Sie die gewünschte Spalte für einen Vergleich und klicken Sie auf "OK".
   4. Erhalten Sie den P-Wert unter Analyse -Fenster.
   5. Wählen Sie die Lineare Regression unter XY Analysen aus Schritt 4.3.3
   6. Erhalten Sie R-Quadrat und der P-Wert unter dem Analyse-Fenster.

Ergebnisse

Zwei Methoden wurden eingesetzt: eine ATP-Nutzung-Assay und einen lebenden/Toten-Färbung-Assay. Die Ergebnisse können kombiniert oder einzeln verwendet für die Prüfung von bakteriellen überleben in Aggregate nach Behandlung mit Antibiotika. Der ATP-Nutzung-Test hat sich gezeigt, genau lebensfähige Bakterien in S. Aureus Biofilme^20,21messen. Hier, wurde MS11Opa + Pil + Stamm verwendet, um die Rolle der GC Aggregation...

Diskussion

Bakterien können Biofilme bilden, während der Infektion des menschlichen Körpers. Traditionelle kann MIC die Konzentration erforderlich, um die Beseitigung der Bakterien im Biofilm reflektieren nicht. Um Antibiotika Auswirkungen auf einen Biofilm zu testen, können Methoden auf Basis von Biofilm Biomasse sowie die Beschichtung KBE aufgrund der Auswirkungen der Biofilm Struktur fehlerhaft sein. Beispielsweise funktioniert die Beschichtung-Methode nur, wenn der Biofilm gestört werden kann. Daher kann die KBE erhalten n...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Kellogg's supplement
Agar	United States Biological	A0930
BacTiter Assay	Promega	G8232
Ceftriaxone	TCI	C2226
Difco GC medium base	BD	228950
Ferric nitrate, nonahydrate	Sigma-Aldrich	254223-10G
Glucose	Thermo Fisher Scientific	BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder	Fisher Scientific	BP379-100
BacLight live/dead staining	Invitrogen	L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain			kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Fisher Scientific	P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Fisher Scientific	BP329-1
Proteose Peptone	BD Biosciences	211693
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S671-10
Soluble Starch	Sigma-Aldrich	S9765
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754-5G
Equipment
Petri Dishes	VWR	25384-302
8-well coverslip-bottom chamber	Thermo Fisher Scientific	155411
96-well tissue culture plates	Corning, Falcon	3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)	Nuaire	32776
CO2 Incubator	Fisher Scientific	Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber	Leica	SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate	Corning	3904
Glomax Illuminator	Promega	E6521
Pipette tips (0.1-10 µL)	Thermo Fisher Scientific	02-717-133
Pipette tips (1000 µL)	VWR	83007-382
Pipette tips (200 µL)	VWR	53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV	Pharmacia Biotech	80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes	VWR	21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL)	Sorenson BioScience	16070
Sterile polyester-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-122
Sonicator	Kontes	Equivelent to 9110001