Examen cuantitativo de susceptibilidad antibiótica de Neisseria gonorrhoeae utilización del ATP utilizando agregados comerciales ensayos y manchas de vivos/muertos

Resumen

Un simple análisis de la medición de ATP y live/dead tinción fueron utilizados para cuantificar y visualizar Neisseria gonorrhoeae supervivencia después del tratamiento con ceftriaxona. Este protocolo puede ser extendido para examinar los efectos antimicrobianos de cualquier antibiótico y puede usarse para definir la concentración inhibitoria mínima de antibióticos en biopelículas bacterianas.

Resumen

La aparición de resistencia a antibióticos Neisseria gonorrhoeae (GC) es una amenaza para la salud en todo el mundo y destaca la necesidad de identificar a las personas que no tratamiento. Esta bacteria gram negativa causa gonorrea exclusivamente en los seres humanos. Durante la infección, son capaces de formar agregados o biofilms. La prueba de la concentración mínima inhibitoria (CMI) se utiliza para determinar la susceptibilidad a los antibióticos y para definir el tratamiento adecuado. Sin embargo, se desconoce el mecanismo de la erradicación en vivo y su relación con resultados de laboratorio. Se desarrolló un método que examina cómo la agregación GC afecta la sensibilidad a los antibióticos y muestra la relación entre el tamaño total y sensibilidad a los antibióticos. Cuando agregado de GC, son más resistentes a los antibióticos matanza, con las bacterias en el centro de sobrevivir ceftriaxona tratamiento mejor que los de la periferia. Los datos indican que la agregación de N. gonorrhoeae puede reducir su susceptibilidad a la ceftriaxona, que no se ve reflejado mediante los métodos de micro basados en placa de agar estándar. El método utilizado en este estudio permitirá a los investigadores probar susceptibilidad bacteriana bajo condiciones clínicamente relevantes.

Introducción

La gonorrea es que una común de transmisión sexual de infecciones (ITS)¹. Neisseria gonorrhoeae (GC), una bacteria gram negativa de la diplococcal, es el agente causal de esta enfermedad. Los síntomas de la infección genital pueden resultar en dolor durante la micción, generalizado dolor genital y secreción uretral. La infección suele ser asintomática^2,3,4,5, y esto permite la colonización extendida. Estas infecciones no tratadas son un problema de salud importante, ya que tienen el potencial para facilitar la transmisión del organismo y esto puede llevar a complicaciones como enfermedad pélvica inflamatoria (EPI) y diseminada infección gonocócica (DGI)⁶. Gonorrea resistente a los antibióticos es una crisis de salud pública importante y un aumento de la carga socioeconómica⁷. Reducida susceptibilidad a las cefalosporinas ha producido cambio de régimen de tratamiento de un antibiótico único a la terapia dual, que combina la azitromicina o doxiciclina con ceftriaxona⁸. El mayor fracaso de ceftriaxona y azitromicina^9,10, en combinación con infecciones asintomáticas, destaca la necesidad de entender los fracasos de tratamiento de la gonorrea.

La prueba de la concentración mínima inhibitoria (CMI), incluyendo agar dilución y disco pruebas de difusión, se ha utilizado como la prueba médica estándar para la identificación de resistencia a un antibiótico. Sin embargo, no está claro si la prueba MIC refleja resistencia antibiótica bacteriana in vivo. La formación de biofilms bacterianos contribuye a la supervivencia de las bacterias en presencia de concentraciones bactericidas de antibiótico: la prueba de MIC es incapaz de detectar este efecto¹¹. Porque la GC puede formar biofilms en superficies de la mucosa¹², presumimos que antibiótico susceptibilidad dentro de agregados sería distinta al visto en GC individual. Además, los estudios han demostrado que las moléculas de superficie variable, Pili, opacidad asociada a proteina (Opa) de tres fases, y lipooligosaccharides (LOS), que regulan las interacciones entre bacterias, conducen a diferentes agregados tamaño^{13, 14 , 15}. la contribución de estos componentes para resistencia a los antibióticos no ha sido examinada por la falta de métodos adecuados.

Actualmente, existen varios métodos para medir la eliminación del biofilm. El método cuantitativo más utilizado es mediante la medición de los cambios en la biomasa usando cristal violeta¹⁶la coloración. Sin embargo, el método requiere manipulación experimental importante, que potencialmente puede generar errores en el experimento se repite¹⁷. El método de coloración en vivo/muerto aquí permite la visualización de bacterias vivas y muertas y su distribución dentro de la biopelícula. Sin embargo, la estructura del biofilm puede plantear como una barrera física que reduce la penetración del tinte. Por lo tanto, para cuantificar las bacterias muertas o vivir dentro de un grupo, la tinción se limita a pequeñas biofilms o su precursor microcolonias o agregaciones. Otros métodos, incluyendo los agar dilución y disco pruebas de difusión, no son capaces de medir los efectos de la agregación. Para examinar la susceptibilidad de la GC dentro de la agregación después de la exposición a antibióticos, un método ideal necesitan tener tanto un ensayo que puede medir viven bacterias y visualizar su distribución.

El procedimiento descrito aquí combina una medida de la utilización del ATP y un vivo/muerto tinción análisis cuantitativo a y examinar visualmente la susceptibilidad de la GC dentro de agregados en presencia de antibióticos.

Protocolo

1. general mantenimiento de cepas de GC

1. Raya de cepas de N. gonorrhoeae en el agar de GCK con 1% Kellogg suplementos¹⁸ (tabla 1, tabla 2) de las existencias de congelador e incubar a 37 ° C con 5% CO₂ para 16-18 h. uso MS11 expresando fase variable Opa (MS11Opa +), no hay Opa (MS11ΔOpa), o a LOS truncada (MS11ΔLgtE).
2. Cuidadosamente escoge pili negativo (Colonia sin borde oscuro) o positivo (Colonia con borde oscuro) colonias de cada cepa basada en morfología de Colonia¹⁹ mediante una disección microscopio y raya en una nueva placa de GCK.
3. Incubar a 37 ° C con 5% CO₂ para 16-18 h antes de su uso.

2. cuantificación de viabilidad de agregaciones de GC

1. Recoger el GC mediante un aplicador estéril. Hisopo de GC de la placa y volver a suspender GC en caldo precalentado (GCP, tabla 3) había complementada con 4.2% de NaHCO₃ y 1% Kellogg soluciones¹⁸. Uso de espectrofotometría a una longitud de onda de 650 nm (un OD₆₅₀ de 1 = ~ 1 x 109 ufc/mL) para determinar la concentración de bacterias suspendidas.
2. Ajustar la concentración de GC ~ 1 x 10⁸ UFC/mL.
3. Añadir 99 μl de la suspensión ajustada de GC en los pocillos de una placa de 96 pocillos.
4. Incube la placa durante 6 h a 37 ° C con 5% CO₂ para permitir que las bacterias a agregado.
5. Añadir 1 μl de serie ceftriaxona diluida (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0.2 μg/mL) en cada pocillo. Dejar algunos pozos sin tratamiento como controles.
6. Incubar la placa de 24 h a 37 ° C con 5% CO₂.
7. Someter a ultrasonidos la suspensión 3 veces en cada pozo de 5 s en 144 W y 20 kHz.
8. Añada 100 μl de reactivo de resplandor de utilización de ATP disponible en el mercado en cada pozo, pipeta para arriba-abajo 3 veces e Incubar 15 min a 37 ° C con 5% CO₂.
9. Cuidadosamente transfiera 150 μL de mezcla de cada pozo en un nuevo pozo en una microplaca de 96 pozos negro y evitar la introducción de burbujas.
10. Medir la absorbancia de cada pocillo a 560 nm con el lector.
11. Calcular la tasa de supervivencia por la relación de la lectura obtenida después del tratamiento de ceftriaxona serial a la lectura de los pozos sin tratar.

3. análisis microscópico fluorescencia de vivos/muertos de agregados de GC

1. Recoger el GC mediante un aplicador estéril. GC de la torunda de la placa y GC vuelva a suspender en precalentado media BPC más 1% suplementos Kellogg.
2. Determinar el número de bacterias por espectrofotometría a una longitud de onda de 650 nm y ajustar la concentración de GC ~ 1 x 10⁷ UFC/mL.
3. Añadir 198 μl de suspensión de la GC en cámaras de 8-bien fondo cubreobjetos.
4. Incubar la cámara durante 6 h a 37 ° C con 5% CO₂ para permitir la formación de agregación.
5. Añadir 2 μl de ceftriaxone (100 μg/mL o varias diluciones) en cada pocillo dentro de cada estado de agregación. Incubar durante el tiempo deseado a 37 ° C con 5% CO₂.
6. Añadir 0,6 μl de live/dead coloración mezcla de solución en cada pocillo e incubar durante 20 min a 37 ° C con 5% CO₂.
7. Adquisición de imágenes de la serie Z utilizando un microscopio confocal (un microscopio equivalente puede ser utilizado).
8. Analizar las imágenes utilizando el software ImageJ para medición del tamaño de agregados de la GC y la relación de intensidad de fluorescencia (FIR) de vivo a muerto la coloración en cada agregado.

4. Análisis de la imagen

1. Estimación del tamaño de agregados bacterianos.
   1. Abra ImageJ y abra una imagen arrastrando un archivo de imagen raw a la barra de menú de ImageJ.
   2. Haga clic en Las líneas a mano alzada en la barra de menú de ImageJ y el área de cada agregación en la imagen del círculo.
   3. Haga clic en analizar | Medida en la barra de menú de ImageJ.
   4. Obtener el número en una nueva ventana en la columna de la zona .
2. Cuantificación del porcentaje de vivo a muerto de agregaciones
   1. Abra ImageJ y abra una imagen arrastrando un archivo de imagen raw a la barra de menú de ImageJ.
   2. Haga clic en analizar | Establecer las medidas en la barra de menú de ImageJ.
   3. Comprobar la densidad integrada en la ventana emergente y haga clic en Aceptar.
   4. Haga clic en imagen | Color | Herramienta de los canales en la barra de menú y seleccionar el Color.
   5. Ver canal 1 como la fluorescencia de la tinción de bacterias vivas.
   6. Haga clic en Las líneas a mano alzada en la barra de menú de ImageJ y el área de cada agregación del círculo.
   7. Haga clic en analizar | Medida en la barra de menú de ImageJ.
   8. Obtener el número en la columna de IntDen .
   9. Ver canal 2 como la fluorescencia para la tinción de bacterias muertas. Repita los pasos 4.2.6-4.2.8.
   10. Obtener la relación de vivo a muerto dividiendo el número de paso 4.2.8 número de paso 4.2.9.
3. Análisis estadístico
   1. Abra GraphPad Prism y escriba los números obtenidos de ImageJ a la columna deseada.
   2. Haga clic en analizar y seleccionar pruebas t bajo análisis de la columna.
   3. Verifique la columna deseada para la comparación y haga clic en Aceptar.
   4. Obtener el valor de P en la ventana de análisis .
   5. Seleccione la Regresión lineal bajo análisis XY en el paso 4.3.3
   6. Obtener el R-cuadrado y el Valor de P debajo de la ventana de análisis.

Resultados

Dos métodos fueron empleados: un análisis de utilización de ATP y una prueba de tinción vivo/muerto. Los resultados pueden combinar o utilizar individualmente para estudiaron la supervivencia bacteriana en agregados después del tratamiento antibiótico. Ha demostrado el análisis de utilización de ATP para medir exactamente viables bacterias en biofilms de S. aureus ^20,21. Aquí, MS11Opa + Pil + cepa fue utilizado p...

Discusión

Las bacterias pueden formar biofilms durante la infección del ser humano. Prueba de MIC tradicionales puede no reflejar la concentración necesaria para erradicar las bacterias de la biopelícula. Para probar efectos antimicrobianos en un biofilm, métodos basados en la biomasa de biofilm como unidades formadoras de colonias de la galjanoplastia pueden ser erróneos debido al impacto de la estructura del biofilm. Por ejemplo, el método de placas sólo funciona si el biofilm puede ser interrumpido. Por lo tanto, la UFC ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Kellogg's supplement
Agar	United States Biological	A0930
BacTiter Assay	Promega	G8232
Ceftriaxone	TCI	C2226
Difco GC medium base	BD	228950
Ferric nitrate, nonahydrate	Sigma-Aldrich	254223-10G
Glucose	Thermo Fisher Scientific	BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder	Fisher Scientific	BP379-100
BacLight live/dead staining	Invitrogen	L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain			kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Fisher Scientific	P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Fisher Scientific	BP329-1
Proteose Peptone	BD Biosciences	211693
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S671-10
Soluble Starch	Sigma-Aldrich	S9765
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754-5G
Equipment
Petri Dishes	VWR	25384-302
8-well coverslip-bottom chamber	Thermo Fisher Scientific	155411
96-well tissue culture plates	Corning, Falcon	3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)	Nuaire	32776
CO2 Incubator	Fisher Scientific	Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber	Leica	SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate	Corning	3904
Glomax Illuminator	Promega	E6521
Pipette tips (0.1-10 µL)	Thermo Fisher Scientific	02-717-133
Pipette tips (1000 µL)	VWR	83007-382
Pipette tips (200 µL)	VWR	53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV	Pharmacia Biotech	80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes	VWR	21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL)	Sorenson BioScience	16070
Sterile polyester-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-122
Sonicator	Kontes	Equivelent to 9110001