Exame quantitativos de susceptibilidade antibiótica de Neisseria gonorrhoeae agregados usando ATP-utilização comercial ensaios e coloração Live/mortos

Resumo

Um simples ensaio de medição da ATP e método de coloração ao vivo/morto foram usados para quantificar e Visualizar Neisseria gonorrhoeae sobrevivência após o tratamento com ceftriaxona. Este protocolo pode ser estendido para examinar os efeitos antimicrobianos de qualquer antibiótico e pode ser usado para definir a concentração inibitória mínima dos antibióticos em biofilmes bacterianos.

Resumo

O surgimento de resistentes aos antibióticos Neisseria gonorrhoeae (GC) é uma ameaça para a saúde no mundo e destaca a necessidade de identificar as pessoas que não o tratamento. Esta bactéria Gram-negativa causa a gonorreia exclusivamente em seres humanos. Durante a infecção, é capaz de agregados de forma e/ou biofilmes. O teste de concentração inibitória mínima (CIM) é usado para determinar a susceptibilidade aos antibióticos e definir o tratamento adequado. No entanto, o mecanismo de erradicação em vivo e sua relação com os resultados de laboratório não são conhecidos. Foi desenvolvido um método que examina como GC agregação afeta a susceptibilidade aos antibióticos e mostra a relação entre tamanho de agregação e suscetibilidade aos antibióticos. Quando agregado de GC, são mais resistentes ao antibiótico matar, com bactérias no centro sobrevivendo ceftriaxona tratamento melhor do que aqueles na periferia. Os dados indicam que a agregação de N. gonorrhoeae pode reduzir sua susceptibilidade à Ceftriaxona, que não é reflectida usando os métodos MIC de baseados em placa de ágar padrão. O método utilizado neste estudo permitirá aos pesquisadores testar susceptibilidade bacteriana em condições clinicamente relevantes.

Introdução

Gonorreia é que um comum sexualmente transmissíveis infecção (STI)¹. Neisseria gonorrhoeae (GC), uma bactéria Gram-negativa de diplococcal, é o agente causador da doença. Sintomas de infecção genital podem resultar em dor durante a micção, dor genital generalizada e descarga uretral. Infecção é frequentemente assintomática^2,3,4,5, e isto permite a colonização estendida. Estas infecções não tratadas são uma preocupação de saúde importantes, como eles têm o potencial para facilitar a transmissão do organismo e isto pode levar a complicações como doença inflamatória pélvica (DIP) e disseminado de Infecção gonocócica (DGI)⁶. Resistentes aos antibióticos gonorreia é uma crise de saúde pública e um crescente fardo socioeconômico⁷. Suscetibilidade reduzida às cefalosporinas, resultou em mudança de regime de tratamento de um único antibiótico a terapia dupla, que combina a azitromicina ou doxiciclina com ceftriaxone⁸. O maior fracasso de ceftriaxona e azitromicina^9,10, em combinação com infecções assintomáticas, destaca a necessidade de compreender as falhas do tratamento de gonorreia.

O teste de concentração inibitória mínima (CIM), incluindo o ágar diluição e disco difusão testes, tem sido usado como o exame médico padrão para a identificação de resistência a um antibiótico. No entanto, não está claro se o MIC teste reflete a resistência antibiótica bacteriana in vivo. A formação de biofilmes bacterianos contribui para a sobrevivência de bactérias na presença de concentrações bactericidas de antibiótico: testando o MIC é incapaz de detectar este efeito¹¹. Porque o GC pode formar biofilmes sobre superfícies mucosas¹², nós hypothesize que antibiótico suscetibilidade dentro agregados seria diferente daquele visto no GC individual. Além disso, estudos têm mostrado que trifásico moléculas de superfície variável, Pili, associada a opacidade da proteína (Opa), e lipooligosaccharides (LOS), que regulam interações inter bactérias, conduzir a diferentes agregados tamanho^{13, 14 , 15}. a contribuição destes componentes de resistência aos antibióticos não tem sido examinada devido à falta de métodos apropriados.

Atualmente, existem vários métodos para medir a erradicação do biofilme. O método quantitativo mais amplamente utilizado é medindo as mudanças na biomassa usando cristal violeta mancha¹⁶. No entanto, o método requer manipulação experimental significativa, que potencialmente pode gerar erros no experimento repetições¹⁷. O método de coloração ao vivo/morto usado aqui permite a visualização de bactérias vivas e mortas e sua distribuição dentro do biofilme. No entanto, a estrutura do biofilme pode posar como uma barreira física que reduz a penetração do corante. Portanto, para quantificar as bactérias ao vivo/morto dentro de um grupo, a coloração é limitada a pequenas biofilmes seu precursor-microcolonies ou agregações. Outros métodos, incluindo os testes de difusão diluição e disco de ágar, não são capazes de medir os efeitos de agregação. Para examinar a susceptibilidade de GC dentro de agregação após a exposição aos antibióticos, um método ideal seria preciso ter ambos um ensaio quantitativo que pode medir vivem bactérias e visualizar sua distribuição.

O procedimento descrito aqui combina uma medição de utilização de ATP e ao vivo/morto coloração do ensaio para quantitativamente e examinar visualmente a susceptibilidade de GC dentro agregados na presença de antibióticos.

Protocolo

1. manutenção de cepas de GC

1. Raia de cepas de N. gonorrhoeae em ágar GCK com 1% Kellogg suplementos¹⁸ (tabela 1, tabela 2) dos estoques de congelador e incubar a 37 ° C com 5% de CO₂ para 16-18 h. uso MS11 expressando Opa de fase variável (MS11Opa +), nenhuma Opa (MS11ΔOpa), ou um LOS truncado (MS11ΔLgtE).
2. Escolha cuidadosamente pili negativo (colônia sem borda escura) ou positivo (colônia com borda escura) colónias de cada estirpe baseado na colônia morfologia¹⁹ usando um microscópio de luz dissecação e raia em uma nova placa GCK.
3. Incube a 37 ° C com 5% de CO₂ para 16-18 h antes do uso.

2. quantificação de viabilidade de agregações de GC

1. Recolha o GC usando um aplicador estéril. Cotonete GC da placa e ressuspender GC em caldo previamente aquecido (GCP, tabela 3) suplementado com 4,2% NaHCO₃ e 1% de soluções Kellogg¹⁸. Usar espectrofotometria a um comprimento de onda de 650 nm (uma OD₆₅₀ de 1 = ~ 1 x 109 UFC/mL) para determinar a concentração de bactérias suspensas.
2. Ajustar a concentração de GC para ~ 1 x 10⁸ UFC/mL.
3. Adicione 99 µ l de suspensão de GC ajustado em poços de uma placa de 96 poços.
4. Incubar a placa de 6 h a 37 ° C com 5% de CO₂ para permitir que as bactérias para agregar.
5. Adicione 1 µ l de serial ceftriaxona diluída (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0,2 µ g/mL) em cada poço. Embora alguns poços não tratados para servir como controles.
6. Incube a placa por 24 h a 37 ° C com 5% de CO₂.
7. Proceda à sonicação a suspensão 3 vezes em cada poço para 5 s em 144 W e 20 kHz.
8. Adicione 100 µ l de reagente de brilho disponível comercialmente ATP utilização em cada poço, pipetar acima- e abaixo por 3 vezes e incube por 15 min a 37 ° C com 5% de CO₂.
9. Com cuidado transferir 150 µ l de mistura de cada poço em um novo poço em uma microplaca de 96 poços negro e evitar a introdução de bolhas.
10. Medir a absorvância de cada poço em 560 nm, utilizando o leitor de placa.
11. Calcule a taxa de sobrevivência pela relação da leitura obtida após o tratamento de ceftriaxona serial para a leitura de poços não tratados.

3. a análise microscópica de Live/mortos dos agregados de GC fluorescência

1. Recolha o GC usando um aplicador estéril. Cotonete GC da placa e ressuspender GC na mídia GCP previamente aquecido além de 1% Kellogg suplementos.
2. Determinar o número de bactérias por espectrofotometria a um comprimento de onda de 650 nm e ajustar a concentração de GC para ~ 1 x 10⁷ UFC/mL.
3. Adicione 198 µ l de suspensão de GC em câmaras de 8 poços lamela-inferior.
4. Incube a câmara para 6 h a 37 ° C com 5% de CO₂ para permitir a formação de agregação.
5. Adicione 2 µ l de ceftriaxona (100 µ g/mL ou várias diluições) em cada poço dentro de cada condição de agregação. Incube a 37 ° C com 5% de CO₂, o tempo desejado.
6. Adicionar 0,6 µ l de mistura de solução coloração viva/morta em cada poço e incube por 20 min a 37 ° C com 5% de CO₂.
7. Adquira imagens de Z-series, usando um microscópio confocal (um microscópio equivalente pode ser usado).
8. Analise as imagens usando o software ImageJ para medição do tamanho de agregados de GC e a relação de intensidade de fluorescência (FIR) de viver-mortos coloração em cada agregado.

4. análise de imagens

1. Estimativa do tamanho de agregados de bactérias.
   1. Abra o ImageJ e abra uma imagem arrastando um arquivo de imagem raw para a barra de menus do ImageJ.
   2. Clique em Linhas à mão livre na barra de menus do ImageJ e um círculo no local de cada agregação na imagem.
   3. Clique em analisar | Medida na barra de menus do ImageJ.
   4. Obter o número em uma nova janela na coluna de área .
2. Quantificação da relação ao vivo-mortos de agregações
   1. Abra o ImageJ e abra uma imagem arrastando um arquivo de imagem raw para a barra de menus do ImageJ.
   2. Clique em analisar | Definir medidas na barra de menus do ImageJ.
   3. Verifique a densidade integrada na janela pop-up e clique Okey.
   4. Clique na imagem | Cor | Ferramenta de canais na barra de menu e selecione uma cor.
   5. Verifique o canal 1 como a fluorescência para coloração de bactérias vivas.
   6. Clique em Linhas à mão livre na barra de menus do ImageJ e um círculo no local de cada agregação.
   7. Clique em analisar | Medida na barra de menus do ImageJ.
   8. Obter o número na coluna IntDen .
   9. Verifique o canal 2 como a fluorescência para a mancha bacteriana morto. Repita as etapas 4.2.6-4.2.8.
   10. Obter a relação de viver-mortos, dividindo o número da etapa 4.2.8 pelo número da etapa 4.2.9.
3. Análise estatística
   1. Abra o GraphPad Prism e digite os números obtidos do ImageJ para a coluna desejada.
   2. Clique em analisar e selecionar testes t sob análises de coluna.
   3. Verifique a coluna desejada para comparação e clique Okey.
   4. Obter o P-valor sob a janela de análise .
   5. Selecione a Regressão Linear , sob análises XY da etapa 4.3.3
   6. Obter o R-quadrado e o P-valor sob a janela de análise.

Resultados

Foram utilizados dois métodos: um ensaio de utilização do ATP e um ensaio de coloração ao vivo/morto. Os resultados podem ser combinados ou usados individualmente pela análise de sobrevivência bacteriana dentro agregados após tratamento com antibióticos. O ensaio de utilização de ATP foi mostrado para medir com precisão viáveis bactérias S. aureus biofilmes^20,21. Aqui, MS11Opa + Pil + estirpe foi usado para ...

Discussão

As bactérias podem formar biofilmes durante a infecção do organismo humano. Teste de MIC tradicional pode não refletir a concentração necessária para erradicar as bactérias em um biofilme. Para testar os efeitos de agentes antimicrobianos em um biofilme, métodos baseados em biomassa de biofilme, bem como do chapeamento CFUs podem ser errôneos devido ao impacto da estrutura do biofilme. Por exemplo, o método de chapeamento só funciona se o biofilme pode ser interrompido. Daí, o UFC obtida pode ser menor que o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Kellogg's supplement
Agar	United States Biological	A0930
BacTiter Assay	Promega	G8232
Ceftriaxone	TCI	C2226
Difco GC medium base	BD	228950
Ferric nitrate, nonahydrate	Sigma-Aldrich	254223-10G
Glucose	Thermo Fisher Scientific	BP350-1
L-glutamine Crystalline Powder	Fisher Scientific	BP379-100
BacLight live/dead staining	Invitrogen	L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae strain			kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research
Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)	Fisher Scientific	P290-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Fisher Scientific	BP329-1
Proteose Peptone	BD Biosciences	211693
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S671-10
Soluble Starch	Sigma-Aldrich	S9765
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754-5G
Equipment
Petri Dishes	VWR	25384-302
8-well coverslip-bottom chamber	Thermo Fisher Scientific	155411
96-well tissue culture plates	Corning, Falcon	3370
Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood)	Nuaire	32776
CO2 Incubator	Fisher Scientific	Model 3530
Confocal microscope equipped with live imaging chamber	Leica	SP5X
Corning  96 Well Black Polystyrene Microplate	Corning	3904
Glomax Illuminator	Promega	E6521
Pipette tips (0.1-10 µL)	Thermo Fisher Scientific	02-717-133
Pipette tips (1000 µL)	VWR	83007-382
Pipette tips (200 µL)	VWR	53509-007
Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV	Pharmacia Biotech	80-2106-00
Sterile 15 ml conical tubes	VWR	21008-216
Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL)	Sorenson BioScience	16070
Sterile polyester-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-122
Sonicator	Kontes	Equivelent to 9110001