Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لعزل غشاء البلازما والسيتوبلازم والميتوكوندريا U937 الخلايا دون استخدام الطرد المركزي عالية السرعة. يمكن استخدام هذا الأسلوب لتنقية الكسور سوبسيلولار لدراسة لاحقة للتعريب البروتين عن طريق إيمونوبلوتينج.

Abstract

في هذا البروتوكول أننا بالتفصيل طريقة الحصول على كسور سوبسيلولار U937 الخلايا دون استخدام تنبيذ فائق أو المنظفات عشوائية. ويستخدم هذا الأسلوب المخازن المؤقتة ناقص التوتر، ديجيتونين، وتحلل الميكانيكية والطرد المركزي التفاضلي لعزل السيتوبلازم، الميتوكوندريا وغشاء البلازما. العملية يمكن تحجيمها لاستيعاب احتياجات الباحثين، وهي غير مكلفة وبسيطة. سيسمح هذا الأسلوب الباحثين لتحديد التعريب البروتين في الخلايا دون المتخصصة أجهزة الطرد المركزي، ودون استخدام مجموعات تجارية، والتي يمكن أن تكون باهظة التكاليف. أننا استخدمت بنجاح هذا الأسلوب لفصل سيتوسوليك وغشاء البلازما والبروتينات المتقدرية في خط الخلية الوحيدات البشرية U937.

Introduction

الهوية موثوقة للتعريب البروتين ضروري غالباً عند دراسة مسارات الجزيئية في الخلايا حقيقية النواة. وتستخدم أساليب الحصول على كسور سوبسيلولار من الباحثين بدراسة المكونات الخلوية من اهتمام أوثق.

معظم أساليب تجزئة الخلية الحالية عموما تندرج في فئتين عريضتين، تستند إلى المنظفات1،2 و على أساس تنبيذ فائق3،4،5، التي يمكن أن تكون متباينة بالسرعة والدقة والتكلفة. المنظفات البروتوكولات استناداً إلى الاعتماد على استخدام المخازن المؤقتة مع زيادة قوة المنظفات جعل العناصر المتميزة للخلية. وهذا هو طريقة سريعة وملائمة لتجهيز العينات، ويمكن أن تكون فعالة من حيث التكلفة إذا كان عدد وحجم العينات الصغيرة. يمكن شراء مجموعات تستند إلى مواد التنظيف لعزل هيولى والغشاء/عضية (الكسر مختلطة) والكسور النووي من الخلايا. ومع ذلك، تحد عيوباً عديدة ترتبط بهذه المجموعات فائدتها للباحثين. تهدف إلى عزل عناصر واحد أو اثنين من الخلية بسهولة ولكنهم غير قادرين على عزل جميع الكسور من عينة في نفس الوقت. استخدام المنظفات يعني أن الغشاء البلازمية والعضيات محاطة الغشاء سوف سولوبيليزيد على قدم المساواة، ومن ثم غير قادر على يمكن فصلها عن بعضها البعض. مضاعفات إضافية تنشأ عن مكونات الملكية في هذه المجموعات مما يمنع الباحثين من تغيير الظروف لتطبيقات محددة. وأخيراً، أنها محدودة في عدد من الاستخدامات وقد يكون باهظ التكلفة لإجراء التجارب على نطاق أكبر. توجد مجموعات استناداً إلى عدم-المنظفات لعزل الميتوكوندريا، بيد أنها لم تصمم لعزل غشاء البلازما وعينه العائد إلى حد كبير أقل من كثافة استخدام الطرد المركزي القائمة على عزل البروتوكولات6،7 .

الأساليب التي تستخدم تنبيذ فائق للحصول على الكسور هي أكثر وقتاً طويلاً، لكن كثيرا ما تؤدي الكسور أنقى من مجموعات تستند إلى مواد التنظيف. لعزل الأغشية البلازمية من الخلايا دون سولوبيليزينج الأولى لهم (الذي ينتج عنه تلوث بغشاء العضيات) يتطلب منها أن يكون تفكيك بأسلوب غير المنظفات متبوعاً بالفصل بين المكونات الخلوية عبر التفاضلية الطرد المركزي – مع غشاء البلازما العزلة التي تتطلب سرعة 100,000 × ز لإنجاز. في كثير من الحالات، يجب أن يتبعها الطرد المركزي التفاضلي إيسوبيكنيك الكثافة المتدرجة الطرد المركزي لمزيد من الانفصال كسور الخلوية أو إزالة الملوثات. في حين أن هذه الأساليب شاملة وقابلة للتعديل، تشمل عيوب التكلفة واستهلاك الوقت، والحاجة أولتراسينتريفوجي للفصل بين الكسور وكذلك تنقية عبر الكثافة المتدرجة الطرد المركزي. على معظم أجهزة الطرد المركزي عالية السرعة بتكلفة باهظة للمحققين الفردية، وهي غالباً ما يشارك، الأساسية للمعدات في المؤسسات الأكاديمية. وهكذا، يصبح توافر ultracentrifuge الباهظة في هذه الحالات.

في هذا البروتوكول تجزئة نظهر عزلة الكسور سوبسيلولار دون استخدام المنظفات سولوبيليزينج ودون استخدام الطرد المركزي عالية السرعة. سيسمح هذا الأسلوب الباحثون عزل غشاء البلازما والميتوكوندريا ومكونات هيولى الخلية حقيقية النواة مع الحد الأدنى من التلوث بين الكسور.

Protocol

1. إعداد المخازن المؤقتة والمواد الكاشفة

ملاحظة: انظر الجدول 1.

  1. إعداد الحلول من المخزن المؤقت A والعينة المخزن المؤقت وتحلل المخزن المؤقت ب ديجيتونين.
    1. إعداد المخزن المؤقت A بإضافة 8.77 غرام من كلوريد الصوديوم و 50 مل من حبيس (1 م، ودرجة الحموضة 7.4) إلى 900 مل منزوع الماء، ضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر مع المياه.
      ملاحظة: التركيزات النهائية هي كلوريد الصوديوم 150 و 50 ملم حبيس.
    2. إعداد تحلل المخزن المؤقت ب بإضافة 20 مل حبيس (1 م، ودرجة الحموضة 7.4) ز 0.75 من بوكل، ز 0.19 مجكل2، 2 مل حمض الإيثيلين (0.5 م يدتا)، 2 مل من جليكول-bis(β-aminoethyl ether)-N، N، N '، ن'--حمض tetraacetic (0.5 م عطا) ، ز 38.26 من المانيتول و 23.96 ز السكروز إلى 900 مل مياه، ضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر مع المياه.
      ملاحظة: هي تركيزات النهائي 20 مم هيبيس، 10 مم بوكل، 2 مم مجكل2، يدتا 1 مم، 1 مم اجتا، المانيتول 210 ملم والسكروز 70 ملم.
    3. إعداد عينة المخزن المؤقت عن طريق إضافة 0.01 غرام من دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) إلى 10 مل من المحلول الملحي مخزنة تريس (تبس) لتركيز نهائي من الحزب الديمقراطي الصربي 0.1%.
    4. إعداد حل أسهم من ديجيتونين عن طريق إضافة 25 ملغ ديجيتونين إلى 100 مل مياه (التركيز النهائي 250 ميكروغرام/مل).
    5. تخزين كافة الحلول المخزن المؤقت عند 4 درجة مئوية وديجيتونين في-20 درجة مئوية حتى بداية التجربة.
  2. إعداد حلول جديدة لمثبطات البروتياز والفوسفاتيز المراد إضافتها إلى المخزن المؤقت الحلول قبل بالإضافة إلى الخلايا.
    1. إعداد حل أسهم من فلوريد فينيلميثانيسولفونيل (بمسف) عن طريق إضافة 17.4 ملغ بمسف إلى 1 مل إيثانول 100% (تركيز النهائي 100 ملم).
      تنبيه: ارتداء معدات الوقاية المناسبة وممارسة الحذر عند التعامل مع بمسف. بمسف خطرة إذا بلعها وخطرة قليلاً في حالة تماس الجلد (مهيجة)، والاتصال بالعين (مهيجة) أو الاستنشاق؛ أنها أكالة للجلد والعيون.
    2. إعداد كوكتيل مثبط البروتياز متاحة تجارياً (100 ×) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
    3. إعداد حل أسهم من أورثوفاناداتي الصوديوم (SOV) عن طريق إضافة 92 ملغ SOV إلى 1 مل مياه (التركيز النهائي 500 ملم).
      تنبيه: ارتداء معدات الوقاية المناسبة وتوخي الحذر عند التعامل. SOV الخطرة في حالة الاتصال بالعين (مهيجة) أو الابتلاع أو الاستنشاق. شديدة التعرض المفرط يمكن أن يؤدي إلى الوفاة.

2-برنامج تلفزيوني الغسيل

  1. التركيز وغسل الخلايا في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) قبل تجزئة.
    1. تعليق خلية الطرد المركزي بسرعة مناسبة لإنشاء بيليه. على سبيل المثال، الطرد المركزي تعليق الخلايا U937 في 400 × ز لمدة 10 دقائق.
    2. إزالة المادة طافية، ريسوسبيند بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة بتركيز نهائي 4 × 106 خلايا/مل وماصة بلطف تفتيت كتل.
    3. الطرد المركزي بتعليق خلية في 400 × ز لمدة 10 دقائق بيليه الخلايا.
    4. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في المخزن الجليد الباردة A بتركيز نهائي 2 × 107 خلايا/مل.
      ملاحظة: جميع الخطوات اللاحقة ينبغي أن يتم في 4 درجات مئوية أو على الجليد وكافة المخازن المؤقتة يجب أن تكون مبردة مسبقاً.

3-عزل بروتين سيتوسوليك

  1. استخراج البروتينات سيتوسوليك بالحضانة مع ديجيتونين المنظفات.
    1. فورا قبل استثارة الخلايا (الخطوة 3.1.3) إضافة 10 ميليلتر للأوراق المالية بمسف (100 ملم)، 10 ميليلتر من مبطلات المانع (× 100)، 2 ميليلتر للأوراق المالية SOV (500 مم) و 100 ميليلتر من الأسهم ديجيتونين (250 ميكروغرام/مل) إلى 878 ميليلتر من المخزن المؤقت A (تركيزات النهائية 1 مم بمسف ، 1 × "مثبط البروتياز"، 1 مم SOV و 25 ميكروغرام/مل ديجيتونين؛ ضبط وحدة التخزين النهائي وفقا لعدد الخلايا المستخدمة). يبقى الحل على الجليد حتى بالإضافة إلى الخلية بيليه.
    2. الطرد المركزي من تعليق خلية في 400 × ز لمدة 10 دقائق وإزالة المادة طافية.
    3. ريسوسبيند بيليه الخلية في المخزن المؤقت بمحلول يحتوي على مثبطات وديجيتونين (أعد الخطوة 3.1.1) بتركيز نهائي 2 × 107 خلايا/مل، ماصة بلطف تفتيت كتل.
    4. احتضان تعليق خلية في دوار أكثر من النهاية عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    5. الطرد المركزي من تعليق خلية في 400 × ز لأدنى 10 جمع المادة طافية ووضعه في أنبوب نظيف أجهزة الطرد مركزي.
    6. الطرد المركزي جمع المادة طافية في × 18,000 ز لمدة 20 دقيقة بيليه الحطام الخلوية.
    7. نقل المادة طافية إلى أنبوب تنظيف أجهزة الطرد مركزي.
    8. كرر الخطوتين 3.1.5 و 3.1.6 حتى يتم الحصول على لا بيليه عقب الطرد المركزي.
    9. جمع المادة طافية تحتوي على بروتينات سيتوسوليك وتخزينها في 4 درجات مئوية (قصيرة الأجل) أو-20 درجة مئوية (طويلة الأجل).
  2. إزالة ديجيتونين الزائدة والبروتينات سيتوسوليك بالطرد المركزي.
    1. ريسوسبيند بيليه خلية بيرميبيليزيد ديجيتونين (من الخطوة 3.1.5) في المخزن المؤقت A بتركيز نهائي 4 × 106 خلايا/مل وماصة بلطف تفتيت كتل.
    2. الطرد المركزي من تعليق خلية بيرميبيليزيد ديجيتونين في 400 × ز لمدة 10 دقائق وإزالة المادة طافية.
      ملاحظة: يمكن أن يؤديها يغسل المتكررة في المخزن المؤقت A إزالة الملوثات سيتوسوليك الزائدة.

4-خلية التجانس

  1. احتضان الخلايا على الجليد في تحلل المخزن المؤقت ب ولهم بالوسائل الميكانيكية.
    1. فورا قبل استثارة الخلايا (الخطوة 4.1.2) إضافة 10 ميليلتر للأوراق المالية بمسف (100 مم) و 2 ميليلتر للأوراق المالية SOV (500 مم) إلى 988 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت ب (تركيزات النهائية هي بمسف 1 و 1 ملم SOV؛ وضبط الحجم النهائي لاستيعاب عدد الخلايا يجري تفكيك) وإبقاء solu نشوئها في الثلج حتى بالإضافة إلى الخلية بيليه.
    2. ريسوسبيند بيليه الخلية (من الخطوة 3.2.2) في تفسخ الجليد الباردة المخزن المؤقت ب حل الذي يحتوي على بمسف و SOV (أعد الخطوة 4.1.1) بتركيز نهائي6 × 10 4 خلايا/مل.
    3. احتضان تعليق خلية على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    4. نقل تعليق خلية الخالطون دونس مبردة مسبقاً (مع مدقة ب ضيقة) على الجليد وأداء يمر 40 مع مدقة الخالطون استخدام بطيئة، حتى السكتات الدماغية.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك استخدام وسائل أخرى لتحلل الخلية الميكانيكية كما هو مفصل في قسم المناقشة.
    5. جمع هوموجيناتي وأنه نقل إلى أنبوب تنظيف أجهزة الطرد مركزي.
    6. أغسل الخالطون مدقة وأنبوب بحجم صغير (1 إلى 2 مل) تحلل المخزن المؤقت ب وإضافته إلى هوموجيناتي.
    7. الطرد المركزي هوموجيناتي 400 × ز (أو السرعة الدنيا المطلوبة لبيليه الخلايا غير منقطعة) لمدة 10 دقائق.
    8. نقل المادة طافية إلى أنبوب تنظيف أجهزة الطرد مركزي.
      ملاحظة: إذا كان لا يزال بيليه كبيرة كرر الخطوات 4.1.4 عن طريق 4.1.6 لزيادة عائد الكسور مفصلة في جزء المناقشة. يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا، والمخزنة هوموجيناتي عند 4 درجة مئوية للمدى القصير (24 ساعة).

5-التفاضلية الطرد المركزي

  1. الطرد المركزي هوموجيناتي في تزايد بسرعة لإزالة الحطام الخلوية وعزل الميتوكوندريا والغشاء الكسور.
    1. الطرد المركزي المادة طافية (من الخطوة 4.1.8) في 500 × ز للحد الأدنى 10 نقل المادة طافية على أنبوب تنظيف أجهزة الطرد مركزي، وتجاهل أي بيليه.
    2. الطرد المركزي المادة طافية (من الخطوة 5.1.1) في 1,000 × ز 10 دقيقة نقل المادة طافية على أنبوب تنظيف أجهزة الطرد مركزي، وتجاهل أي بيليه.
    3. الطرد المركزي المادة طافية (من الخطوة 5.1.2) في 2,000 × ز 10 دقيقة نقل المادة طافية على أنبوب تنظيف أجهزة الطرد مركزي، وتجاهل أي بيليه.
    4. الطرد المركزي المادة طافية (من الخطوة 5.1.3) في 4,000 × ز للمادة 15 دقيقة نقل طافية على أنبوب الطرد مركزي نظيفة، تبقى بيليه الذي يحتوي على الميتوكوندريا.
    5. ريسوسبيند بيليه الميتوكوندريا في وحدة تخزين صغيرة (0.5\u20121 مل) تحلل المخزن المؤقت ب
    6. الطرد المركزي بيليه مع وقف التنفيذ في 4,000 × ز 15 دقيقة إزالة المادة طافية وريسوسبيند الميتوكوندريا بيليه في حجم المخزن المؤقت للعينة (مثلاً، 250 إلى 500 ميليلتر، تبعاً لحجم بيليه والمطلوب النهائي المطلوب تركيز).
    7. أجهزة الطرد المركزي المادة طافية (من الخطوة 5.1.4) في 4,000 × ز عن 15 دقيقة نقل المادة طافية إلى أنبوب تنظيف أجهزة الطرد مركزي. كرر هذه الخطوة حتى يتم الحصول على لا بيليه عقب الطرد المركزي.
    8. تدور المادة طافية في × 18,000 ز ح 3.
    9. إزالة المادة طافية، وإبقاء بيليه التي تحتوي على بروتينات الغشاء. ريسوسبيند بيليه الغشاء في كمية صغيرة (0.5-1 مل) من تحلل المخزن المؤقت ب
    10. الطرد المركزي بيليه مع وقف التنفيذ في 18,000 × ز ح 1.
    11. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الغشاء في الحجم النهائي المطلوب من المخزن المؤقت للعينة (250 إلى 500 ميليلتر، تبعاً لحجم بيليه والتركيز المطلوب).
  2. Sonicate الكريات عينة 3 s في حمام الثلج في تحديد سلطة من 5 (50% من 125 واط على أقصى قدر من السلطة في 20 كيلوهرتز، انظر الجدول للمواد).
  3. تخزين العينات في 4 درجات مئوية (قصيرة الأجل) أو-20 درجة مئوية (طويلة الأجل).
  4. فحص العينات للنقاء وجود قبل تنفيذ وصمة عار غربية استخدام الأجسام المضادة ضد علامات البروتين التي وجدت في المقصورات السيتوبلازم، الميتوكوندريا، وغشاء الخلية (راجع مقطع تمثيلي النتائج).

النتائج

وأنجزت تجزئة ناجحة من خلايا غير متمايزة من8 U937 تزرع في تعليق استخدام بروتوكول المفصلة أعلاه، وهو موضح في الشكل 1. العينات التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة قد تعرضوا لغربي النشاف9 استخدام أسلوب نقل رطب لغشاء الفينيليدن فلوريد (PVDF)...

Discussion

وضع هذا البروتوكول قد نشأت من عدم قدرة على فصل mitochondrial وعينات الغشاء، باستخدام مجموعات المتاحة تجارياً، بتحليل للتعريب البروتين خلال نيكروبتوسيس14. القيود الأساسية لمجموعات premade هي قدرتها على أن تتكيف مع احتياجات الباحثين من الأفراد، التكلفة لكل عينة وعدد محدود من العينات قا...

Disclosures

الكتاب يعلن عدم تضارب المصالح

Acknowledgements

وأيده عمل المعاهد الوطنية للصحة-1R15HL135675-01 إلى تيموثي ج. لاروككا

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DigitoninTCI ChemicalsD0540For Cytoplasm Extraction
D-MannitolSigma-AldrichM4125For Lysis buffer B
Dounce homogenizerVWR22877-282For Homogenization
end-over-end rotatorBarnsteadN/AFor Cytoplasm Extraction
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)Alfa AesarJ61721For Lysis buffer B
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichE7889For Lysis buffer B
GAPDH (14C10)Cell Signalling Technologies2118For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000
HEPESVWRJ848For Lysis buffers A and B
KClSigma-AldrichP9541For Lysis buffer B
MgCl2Alfa Aesar12315For Lysis buffer B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)Cell Signalling Technologies23565For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000
NaClSigma-Aldrich793566For Lysis buffer A
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)VWRM145For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer
probe sonicatorQsonicaQ125-110For Final Samples
Protease Inhibitor Cocktail, General UseVWRM221-1MLFor Cytoplasm Extraction
refrigerated centrifugeBeckman-CoulterN/A
Sodium dodecyl sulfate (SDS)VWR227For Sample buffer
sodium orthovanadate (SOV)Sigma-Aldrich450243For Lysis buffers A and B
SucroseSigma-AldrichS0389For Lysis buffer B
Tris-buffered Saline (TBS)VWR788For Sample buffer
VDAC (D73D12)Cell Signalling Technologies4661For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000

References

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
  2. Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
  4. Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
  5. Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
  6. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  7. Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, (2015).
  8. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  9. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  10. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  11. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  12. Therien, a. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
  13. Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
  14. McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
  15. Simpson, R. J. Homogenization of Mammalian Tissue. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143 U937

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved