Fractionnement de cellules des cellules U937 en l’Absence de Centrifugation à haute vitesse

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à isoler les membrane plasmique, cytoplasme et les mitochondries des cellules U937 sans l’utilisation de la centrifugation à grande vitesse. Cette technique peut servir à purifier les fractions subcellulaires pour un examen subséquent de la localisation de la protéine par immunoblotting.

Résumé

Dans ce protocole, nous détaillons une méthode pour obtenir des fractions subcellulaires des cellules U937 sans l’utilisation d’ultracentrifugation ou détergents sans discernement. Cette méthode utilise des tampons hypotoniques, digitonine, lyse mécanique et centrifugation différentielle pour isoler le cytoplasme, la mitochondrie et la membrane plasmique. Le processus peut être adapté pour répondre aux besoins des chercheurs, est peu coûteux et simple. Cette méthode permettra aux chercheurs de déterminer la localisation des protéines dans les cellules sans centrifugeuses spécialisés et sans l’utilisation de kits commerciaux, qui peuvent être prohibitifs. Nous avons utilisé avec succès cette méthode pour séparer cytosolique, la membrane plasmique et la protéines mitochondriales chez la lignée monocytaire humaine U937.

Introduction

Une identification fiable de la localisation de la protéine est souvent nécessaire lors de l’examen des voies moléculaires dans les cellules eucaryotes. Méthodes pour obtenir des fractions subcellulaires sont utilisés par les chercheurs à examiner de plus près les composants cellulaires d’intérêt.

La plupart des méthodes de fractionnement cellulaire existant tombe généralement dans deux grandes catégories, à base de détergent^1,2 et axée sur l’ultracentrifugation^3,4,5, qui peut être différenciés par la vitesse, de précision et de coût. Protocoles de base détergents reposent sur l’utilisation de tampons avec augmentation de la force de détergent pour solubiliser des composantes distinctes de la cellule. C’est une méthode rapide et pratique pour le traitement des échantillons et peut être rentable si le nombre et la taille des échantillons sont de petite taille. Détergent à base de produits peuvent être achetés pour isoler cytoplasmique, membrane/organelle (fraction mixte) et des fractions nucléaires des cellules. Cependant, plusieurs inconvénients liés à ces kits limitent leur utilité pour les chercheurs. Ils sont conçus pour isoler facilement un ou deux composants de la cellule, mais sont incapables d’isoler toutes les fractions auprès d’un échantillon en même temps. L’utilisation de détergents signifie que la membrane plasmique et l’enveloppe membranaire organites vont être tout aussi solubilisées et, par conséquent, impossible d’être séparés l’un de l’autre. Une complication supplémentaire vient les composants propriétaires dans ces kits, qui empêche les chercheurs de modifier les conditions pour des applications spécifiques. Enfin, ils sont limités en nombre d’utilisations et peuvent être prohibitifs pour des expériences à échelle plus grandes. Kits de base non détergente existent pour l’isolation des mitochondries, cependant, ils ne sont pas conçus pour isoler la membrane plasmique et le rendement de l’échantillon est nettement inférieure à celle de la centrifugation de densité basée isolement protocoles^6,7 .

Les méthodes qui utilisent l’ultracentrifugation pour obtenir des fractions sont plus prendrait beaucoup de temps, mais souvent le résultat dans les fractions plus purs que le détergent à base de produits. Pour isoler les membranes plasmiques des cellules sans premier solubilisation eux (entraînant la contamination avec les organites membranaires) doit pouvoir être lysées par une méthode non détergente suivie de la séparation des composants cellulaires via différentiel centrifugation — avec l’isolement de la membrane plasmique nécessitant des vitesses de 100 000 × g d’accomplir. Dans bien des cas, centrifugation différentielle doit être suivie d’une centrifugation gradient de densité isopycnique pour davantage de séparation des fractions cellulaires ou enlèvement de contaminants. Bien que ces méthodes soient approfondies et modifiable, les inconvénients incluent coût, consommation de temps et la nécessité d’une ultracentrifugeuse pour la séparation des fractions et autres purification par centrifugation gradient de densité. La plupart des centrifugeuses à grande vitesse sont à un coût qui est prohibitif pour les chercheurs individuels et sont souvent partagés, core équipement aux institutions académiques. Ainsi, la disponibilité ultracentrifugeuse devient prohibitive dans ces situations.

Dans ce protocole de fractionnement, nous démontrons l’isolement des fractions subcellulaires sans l’utilisation de détergents de solubilisation et sans centrifugation à haute vitesse. Cette méthode permettra aux chercheurs d’isoler la membrane plasmique, les mitochondries et les composants cytoplasmiques d’une cellule eucaryote avec contamination minime entre les fractions.

Protocole

1. Préparez les tampons et les réactifs

Remarque : Voir le tableau 1.

1. Préparer des solutions de tampons A, tampon de lyse B, tampon et digitonine.
   1. Préparer, tampon A en ajoutant 8,77 g de NaCl et 50 mL de HEPES (1 M, pH 7,4) à 900 mL d’eau désionisée, ajuster le volume final à 1 L avec de l’eau désionisée.
      Remarque : Les concentrations finales sont NaCl 150 mM et 50 mM HEPES.
   2. Préparer le tampon de lyse B en ajoutant 20 mL d’HEPES (1 M, pH 7,4), 0,75 g de KCl, 0,19 g de MgCl₂, 2 mL d’acide Tétraacétique (EDTA 0,5 M), 2 mL d’éthylène glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tétraacétique (0,5 M EGTA) , 38,26 g de mannitol et 23,96 g de saccharose dans 900 mL d’eau désionisée, ajuster le volume final à 1 L avec de l’eau désionisée.
      Remarque : Les concentrations finales sont 20 mM HEPES, KCl 10 mM, 2 mM MgCl₂, EDTA 1 mM, 1 mM EGTA, 210 mM de mannitol et saccharose de 70 mM.
   3. Préparer, solution tampon en ajoutant 0,01 g de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 mL de tampon tris salin (SCT) pour une concentration finale de 0,1 % SDS.
   4. Préparer une solution de digitonine en ajoutant 25 mg de digitonine dans 100 mL d’eau désionisée (concentration finale est 250 µg/mL).
   5. Stockez toutes les solutions tampon à 4 ° C et la digitonine à-20 ° C jusqu’au début de l’expérience.
2. Préparer des solutions fraîches des inhibiteurs de la protéase et la phosphatase à ajouter aux solutions tampons avant addition aux cellules.
   1. Préparer une solution de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF) en ajoutant des 17,4 mg de PMSF à 1 mL d’éthanol à 100 % (concentration finale est de 100 mM).
      Attention : Porter des équipements de protection appropriés et être prudent lorsque vous manipulez le PMSF. Le PMSF est dangereux en cas d’ingestion et légèrement dangereux en cas de contact cutané (irritant), contact avec les yeux (irritant) ou par inhalation ; Il est corrosif pour les yeux et la peau.
   2. Préparer un cocktail d’inhibiteur de protéase commercialement disponibles (100 ×) selon les instructions du fabricant (voir la Table des matières).
   3. Préparer une solution d’orthovanadate de sodium (SOV) en ajoutant des 92 mg de SOV à 1 mL d’eau désionisée (concentration finale est 500 mM).
      Attention : Porter des équipements de protection appropriés et soyez prudent lorsque vous manipulez. SOV est dangereux en cas de contact avec les yeux (irritant), par ingestion ou inhalation. Surexposition sévère peut entraîner la mort.

2. PBS lavage

1. Concentrer et laver les cellules dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant le fractionnement.
   1. Centrifuger la suspension cellulaire à une vitesse appropriée pour créer une boulette. Par exemple, centrifuger une suspension de cellules U937 à 400 × g pendant 10 min.
   2. Retirer le surnageant, resuspendre le culot dans du PBS à température ambiante à une concentration finale de 4 × 10⁶ cellules/mL et pipette doucement pour briser les mottes.
   3. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 × g pendant 10 min granuler des cellules.
   4. Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans glacée tampons A à une concentration finale de 2 × 10⁷ cellules/mL.
      Remarque : Toutes les étapes subséquentes devraient être effectuées à 4 ° C ou sur glace et tous les tampons doivent être préalablement réfrigérées.

3. cytosolique protéines isolement

1. Extraire des protéines cytosoliques par incubation avec la digitonine détergente.
   1. Juste avant la remise en suspension des cellules (étape 3.1.3) ajouter 10 µL de stock PMSF (100 mM), 10 µL de l’inhibiteur de protéase (× 100), 2 µL de stock SOV (500 mM) et 100 µL de stock digitonine (250 µg/mL) à 878 µL de tampons A (concentrations finales sont PMSF 1 mM , 1 × inhibiteur de la protéase, 1 mM SOV et 25 µg/mL digitonine ; ajuster le volume final selon le nombre de cellules utilisées). Conserver la solution sur la glace jusqu'à plus de culot.
   2. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 × g pendant 10 min et enlever le surnageant.
   3. Resuspendre le culot dans solution tampons A contenant des inhibiteurs et digitonine (préparé à l’étape 3.1.1) à une concentration finale de 2 × 10⁷ cellules/mL, pipette doucement pour briser les mottes.
   4. Incuber la suspension cellulaire sur une coiffe plus fin à 4 ° C pendant 20 min.
   5. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 × g pendant 10 min. à frais virés le surnageant et le placer dans un tube à centrifuger propre.
   6. Centrifuger le liquide surnageant collecté à 18 000 x g pendant 20 min granuler les débris cellulaires.
   7. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger propre.
   8. Répétez les étapes 3.1.5 et 3.1.6 jusqu'à ce qu’aucune granule n’est obtenu par centrifugation.
   9. Récupérer le surnageant contenant les protéines cytosoliques et le stocker à 4 ° C (courte durée) ou à-20 ° C (long terme).
2. Supprimer les excès digitonine et protéines cytosoliques par centrifugation.
   1. Resuspendre le culot de cellules perméabilisées à la digitonine (de l’étape 3.1.5) dans les tampons A à une concentration finale de 4 × 10⁶ cellules/mL et pipette doucement pour briser les mottes.
   2. Centrifuger la suspension de cellules perméabilisées de digitonine à 400 × g pendant 10 min et enlever le surnageant.
      Remarque : Les lavages répétés dans les tampons A peuvent être effectuées pour éliminer les contaminants cytosoliques excès.

4. cellule homogénéisation

1. Incuber les cellules sur la glace dans le tampon de lyse B et leur lyse par des moyens mécaniques.
   1. Juste avant la remise en suspension des cellules (étape 4.1.2) ajouter 10 µL de stock PMSF (100 mM) et 2 µL de stock SOV (500 mM) à 988 µL de tampon de lyse B (concentrations finales sont PMSF 1 mM et 1 mM SOV, ajuster le volume final, pour accueillir le nombre de cellules sont lysées) et garder les solu tion sur la glace jusqu'à plus de culot.
   2. Resuspendre le culot cellulaire (de l’étape 3.2.2) dans contenant PMSF et SOV (préparé à l’étape 4.1.1) à une concentration finale de 4 × 10⁶ cellules/mL de solution tampon B de lyse glaciale .
   3. Incuber la suspension cellulaire sur la glace pendant 30 min.
   4. Transférer la suspension cellulaire dans un homogénéisateur Dounce préalablement réfrigérée (avec un pilon de B serrés) sur la glace et effectuer 40 passes avec le pilon homogénéisateur en lent, même mouvements.
      Remarque : Utiliser alternativement autres moyens de la lyse de la mécanique cellulaire tel que décrit dans la section « discussion ».
   5. Recueillir l’homogénat et transférez-le dans un tube à centrifuger propre.
   6. Laver le homogénisateur pilon et le tube avec un petit volume (1 à 2 mL) de tampon de lyse B et ajoutez-le à l’homogénat.
   7. Centrifuger l’homogénat à 400 × g (ou la vitesse minimale requise pour granuler cellules ininterrompues) pendant 10 min.
   8. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger propre.
      Remarque : Si une pastille importante reste 4.1.4 par 4.1.6 pour augmenter le rendement des fractions comme répéter les étapes détaillées dans la section « discussion ». Le protocole peut être suspendu ici et l’homogénat stockés à 4 ° C à court terme (24 h).

5. différentielle Centrifugation

1. Centrifuger l’homogénat à l’augmentation de la vitesse pour enlever les débris cellulaires, les mitochondries isolat et les fractions membranaires.
   1. Centrifuger le surnageant (de l’étape 4.1.8) à 500 × g pendant 10 min. transfert surnageant dans un tube à centrifuger propre et éliminer toute pellet.
   2. Centrifuger surnageant (de l’étape 5.1.1) à 1 000 × g pendant 10 min. transfert le surnageant dans un tube à centrifuger propre et éliminer toute pellet.
   3. Centrifuger le surnageant (de l’étape 5.1.2) à 2 000 × g pendant 10 min. transfert le surnageant dans un tube à centrifuger propre et éliminer toute pellet.
   4. Centrifuger le surnageant (de l’étape 5.1.3) à 4 000 × g pendant 15 min. transfert surnageant dans un tube à centrifuger propre, garder des granulés contenant des mitochondries.
   5. Resuspendre le culot de mitochondries dans un petit volume (0.5\u20121 mL) de tampon de lyse B.
   6. Centrifuger le culot suspendu à 4 000 × g pendant 15 min. retirer le surnageant et remettre le mitochondrial culot dans le volume final désiré de solution tampon (par exemple, 250 et 500 µL, selon la taille de la pastille et désiré (concentration).
   7. Centrifuger le surnageant (de l’étape 5.1.4) à 4 000 × g pendant 15 min. transférer le liquide surnageant dans un tube à centrifuger propre. Répétez cette étape jusqu'à ce qu’aucune granule n’est obtenu par centrifugation.
   8. Faites tourner le surnageant à 18 000 × g pendant 3 h.
   9. Retirez le surnageant et garder le culot contenant des protéines de la membrane. Resuspendre le culot de membrane dans un petit volume (0,5 à 1 mL) de la lyse de la mémoire tampon B.
   10. Centrifuger le culot suspendu à 18 000 × g pendant 1 h.
   11. Retirez le surnageant et resuspendre le culot de membrane dans le volume final désiré de solution tampon (250 à 500 µL, selon la taille de la pastille et la concentration désirée).
2. Laisser agir les boulettes d’échantillon pour 3 s dans un bain de glace à un réglage de puissance de 5 (50 % de la puissance maximale de 125 W à 20 kHz, voir La Table des matières).
3. Stocker les échantillons à 4 ° C (courte durée) ou à-20 ° C (long terme).
4. Examiner les échantillons pour la pureté de fractionnement en effectuant une tache occidentale utilisant des anticorps dirigés contre des marqueurs protéiques dans les compartiments de cytoplasme, mitochondries et la membrane de la cellule (reportez-vous à la section résultats représentatifs).

Résultats

Succès le fractionnement des indifférenciées U937⁸ cellules cultivées en suspension a été accompli en utilisant le protocole indiqué ci-dessus et illustré à la Figure 1. Les échantillons obtenus avec cette méthode ont été soumis à western blotting⁹ utilisant une méthode de transfert humide sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF). La membrane a été sondée par la suite avec des ant...

Discussion

L’élaboration du présent protocole est née de l’incapacité de séparer les mitochondries et les échantillons de membrane, utilisant des kits disponibles dans le commerce, pour l’analyse de la localisation des protéines au cours de la necroptosis¹⁴. Les limitations primaires de kits préfabriqués sont leur incapacité à être adapté aux besoins des chercheurs individuels, leur coût par échantillon et le nombre limité d’échantillons peuvent être traitées. La méthode présent?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digitonin	TCI Chemicals	D0540	For Cytoplasm Extraction
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125	For Lysis buffer B
Dounce homogenizer	VWR	22877-282	For Homogenization
end-over-end rotator	Barnstead	N/A	For Cytoplasm Extraction
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Alfa Aesar	J61721	For Lysis buffer B
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E7889	For Lysis buffer B
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118	For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000
HEPES	VWR	J848	For Lysis buffers A and B
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	For Lysis buffer B
MgCl2	Alfa Aesar	12315	For Lysis buffer B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565	For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	For Lysis buffer A
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	VWR	M145	For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer
probe sonicator	Qsonica	Q125-110	For Final Samples
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML	For Cytoplasm Extraction
refrigerated centrifuge	Beckman-Coulter	N/A
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	VWR	227	For Sample buffer
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma-Aldrich	450243	For Lysis buffers A and B
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	For Lysis buffer B
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	788	For Sample buffer
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661	For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000