Zelle Fraktionierung von U937 Zellen in der Abwesenheit von High-Speed-Zentrifugation

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Plasmamembran, Zytoplasma und Mitochondrien von U937 Zellen ohne den Einsatz von High-Speed-Zentrifugation zu isolieren. Diese Technik lässt sich subzelluläre Fraktionen für die anschließende Untersuchung des Proteins Lokalisierung über Immunoblotting zu reinigen.

Zusammenfassung

In diesem Protokoll zeigen wir eine Methode, subzelluläre Bruchteile von U937 Zellen ohne den Einsatz von Ultrazentrifugation oder wahllose Reinigungsmittel zu erhalten. Diese Methode nutzt hypotone Puffer, Digitonin, mechanische lyse und differentielle Zentrifugation, Zytoplasma, Mitochondrien und Plasmamembran zu isolieren. Der Prozess kann skaliert werden, um den Bedürfnissen der Forscher, ist preiswert und unkompliziert. Diese Methode ermöglicht abschätzen, Protein-Lokalisierung in Zellen ohne spezielle Zentrifugen und ohne den Einsatz von kommerziellen Kits, die teuer werden können. Wir haben erfolgreich diese Methode cytosolischen trennen, Plasmamembran und mitochondrialen Proteine in die menschliche Monocyte-Zellinie U937 verwendet.

Einleitung

Zuverlässige Identifikation von Protein-Lokalisierung ist oft notwendig, bei der Prüfung, molekulare Signalwege in eukaryotischen Zellen. Methoden, subzelluläre Brüche zu erhalten sind übernommen werden Forscher zelluläre Komponenten von Interesse näher zu untersuchen.

Die Mehrzahl der bestehenden Zelle Fraktionierung Methoden fällt in der Regel in zwei große Kategorien, Waschmittel-basierte^1,2 und Ultrazentrifugation basierende^3,4,5, die sein kann unterscheiden sich durch Schnelligkeit, Präzision und Kosten. Waschmittel je Protokolle verlassen sich auf die Verwendung von Puffern mit zunehmender Waschmittel Stärke um verschiedene Komponenten der Zelle zu solubilisieren. Dies kann ist eine schnelle und bequeme Methode für die Verarbeitung von Proben und kostengünstig, wenn die Anzahl und Größe der Proben klein sind. Waschmittel-basierte Kits können erworben werden, um cytoplasmatischen Membran/Organellen (Gemischter Bruch) und nukleare Fraktionen aus Zellen zu isolieren. Jedoch begrenzen einige Nachteile verbunden mit diesen Kits ihre Nützlichkeit für Forscher. Sie sind entworfen, um einfach ein oder zwei Komponenten der Zelle zu isolieren, aber nicht in der Lage alle Fraktionen aus einer Probe gleichzeitig zu isolieren. Die Verwendung von Reinigungsmitteln bedeutet, dass die Plasmamembran und Membran umhüllten Organellen ebenso solubilisiert werden werden und somit voneinander getrennt werden. Eine zusätzliche Schwierigkeit ergibt sich aus der proprietären Komponenten in diesen Kits, die verhindert, dass Forscher Bedingungen für spezifische Anwendungen zu verändern. Schließlich, sie sind in der Anzahl der Nutzungen eingeschränkt und möglicherweise unerschwinglich für größere Skala Experimente. Non-Reinigungsmittel basierend Kits gibt es für die Isolation von Mitochondrien, aber sie sollen nicht die Plasmamembran zu isolieren und die Probenausbeute ist deutlich geringer als die von Dichte Zentrifugierung isoliert Protokolle^6,7 .

Methoden, die Ultrazentrifugation zu nutzen, um Brüche zu erhalten sind mehr zeitaufwendig, aber oft führen zu reiner Brüche als Waschmittel-basierte Kits. Um die Plasmamembranen von Zellen zu isolieren, ohne erste Gefäss-sie (was zu Kontaminationen mit Membran Organellen) verlangt, dass sie durch eine nicht-Reinigungsmittel-Methode, gefolgt von Trennung der zellulären Komponenten über differentielle lysiert werden Zentrifugation – mit der Plasmamembran Isolation erfordern Geschwindigkeiten von 100.000 × g zu erreichen. In vielen Fällen muss Isopycnic Dichte Gradienten Zentrifugation für weitere Trennung von zellulären Brüche oder Entfernung von Verunreinigungen differentielle Zentrifugation folgt. Während diese Methoden gründlich und veränderbar sind, gehören Nachteile, Kosten, Zeitaufwand und die Notwendigkeit einer Ultrazentrifuge zur Trennung von Fraktionen und weitere Reinigung über Dichte Steigung Zentrifugierung. Die meisten High-Speed-Zentrifugen sind Kosten, die für einzelne Ermittler und sind oft geteilt, Ausrüstung an Hochschulen core unerschwinglich ist. Auf diese Weise wird Ultrazentrifugen Verfügbarkeit in diesen Situationen unerschwinglich.

In diesem Protokoll Fraktionierung demonstrieren wir die Isolation der subzellularen Brüche ohne die Verwendung von Reinigungsmitteln Gefäss- und high-Speed Zentrifugation. Diese Methode erlaubt Forschern, die Plasmamembran, Mitochondrien und cytoplasmatische Komponenten einer eukaryotischen Zelle mit minimalen Kontamination zwischen den Fraktionen zu isolieren.

Protokoll

1. bereiten Sie Puffer und Reagenzien

Hinweis: Siehe Tabelle 1.

1. Lösungen von Puffer A, Lyse Puffer B, Probenpuffer und Digitonin vorzubereiten.
   1. Bereiten Sie Puffer A durch Zugabe von 8,77 g NaCl und 50 mL HEPES (1 M, pH 7,4), 900 mL entionisiertem Wasser, Anpassung Endvolumen bis 1 L mit entionisiertem Wasser.
      Hinweis: Endkonzentrationen sind 150 mM NaCl und 50 mM HEPES.
   2. Bereiten Sie Lyse Puffer B durch Zugabe von 20 mL HEPES (1 M, pH 7,4), 0,75 g KCl, MgCl₂, 2 mL Ethylenediaminetetraacetic Säure (0,5 M EDTA), 0,19 g 2 mL Ethylenglykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Tetraacetic Säure (0,5 M EGTA) , 38,26 g Mannit und 23,96 g Saccharose zu 900 mL entionisiertem Wasser anpassen Endvolumen bis 1 L mit entionisiertem Wasser.
      Hinweis: Endkonzentrationen sind 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, Mannit 210 mM und 70 mM Saccharose.
   3. Bereiten Sie Probenpuffer durch Zugabe von 0,01 g Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) auf 10 mL Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) auf eine Endkonzentration von 0,1 % SDS.
   4. Bereiten Sie eine Stammlösung Digitonin durch Zugabe von 25 mg Digitonin, 100 mL entionisiertem Wasser (Endkonzentration ist 250 µg/mL).
   5. Speichern Sie alle Pufferlösungen bei 4 ° C und Digitonin bei-20 ° C bis zum Beginn des Experiments.
2. Bereiten Sie frische Lösungen von Protease und Phosphatase-Inhibitoren, Pufferlösungen vor der Zugabe zu Zellen hinzugefügt werden soll.
   1. Bereiten Sie eine Stammlösung Phenylmethanesulfonyl Fluorid (PMSF) durch Zugabe von 17,4 mg PMSF zu 1 mL 100 % Ethanol (Endkonzentration ist 100 mM).
      Achtung: Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung und Vorsicht beim Umgang mit PMSF. PMSF ist gefährlich, wenn eingenommen und leicht gefährlich bei Hautkontakt (reizend), Augenkontakt (reizend) oder Inhalation; Es ist ätzend auf Augen und Haut.
   2. Bereiten Sie einen handelsüblichen Protease Inhibitor Cocktail (100 ×) entsprechend den Anweisungen des Herstellers (siehe die Tabelle der Materialien).
   3. Bereiten Sie eine Stammlösung Natrium Orthovanadate (SOV) durch Zugabe von 92 mg SOV zu 1 mL entionisiertem Wasser (Endkonzentration beträgt 500 mM).
      Achtung: Tragen Sie geeignetsten Schutzausrüstung und Vorsicht beim Umgang mit. SOV ist gefährlich bei Augenkontakt (reizend), verschlucken oder einatmen. Schweren Überbelichtung kann zu Tod führen.

2. PBS waschen

1. Konzentrieren und Zellen in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor der Fraktionierung waschen.
   1. Zentrifuge Zellsuspension mit einer entsprechenden Geschwindigkeit ein Pellet zu erstellen. Zum Beispiel Zentrifugieren Sie eine Aussetzung der U937 Zellen bei 400 × g für 10 min.
   2. Entfernen des Überstands, Aufschwemmen Zelle Pellet mit Raumtemperatur PBS-Puffer auf eine Endkonzentration von 4 × 10⁶ Zellen/mL und Pipette vorsichtig zu Klumpen brechen.
   3. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 400 × g für 10 min bis zum pellet-Zellen.
   4. Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen Sie Zelle Pellet im eiskalten Puffer A auf eine Endkonzentration von 2 × 10⁷ Zellen/mL.
      Hinweis: Alle weiteren Schritte sollten bei 4 ° C durchgeführt werden oder auf Eis und alle Puffer sollte vorab gekühlt.

(3) zytosolischen Proteins Isolation

1. Cytosolischen Proteine durch Inkubation mit dem Waschmittel Digitonin zu extrahieren.
   1. Unmittelbar vor der Wiederfreisetzung Zellen (Schritt 3.1.3) fügen Sie 10 µL des Bestandes PMSF (100 mM), 10 µL Protease Inhibitor (100 ×), 2 µL des Bestandes SOV (500 mM) und 100 µL Lager Digitonin (250 µg/mL), 878 µL Puffer A (Endkonzentrationen sind 1 mM PMSF , 1 × Protease-Inhibitor, 1 mM SOV und 25 µg/mL Digitonin; passen Sie das Endvolumen nach der Anzahl der verwendeten Zellen). Halten Sie die Lösung auf Eis bis zu Zelle Pellet.
   2. Die Zellsuspension bei 400 × g für 10 min Zentrifugieren und den Überstand zu entfernen.
   3. Aufschwemmen der Zelle Pellet in A Pufferlösung mit Inhibitoren und Digitonin (vorbereitet in Schritt 3.1.1) auf eine Endkonzentration von 2 × 10⁷ Zellen/mL Pipette vorsichtig zu Klumpen brechen.
   4. Inkubieren Sie die Zellsuspension auf eine durchgängige über Rotator bei 4 ° C für 20 min.
   5. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 400 × g für 10 min. sammeln überstand und legen Sie sie in eine saubere Zentrifugenröhrchen.
   6. Zentrifugieren des gesammelten Überstands bei 18.000 × g für 20 min, Zelltrümmer pellet.
   7. Übertragen Sie den Überstand auf eine saubere Zentrifugenröhrchen.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.5 und 3.1.6, bis kein Pellet nach Zentrifugation gewonnen wird.
   9. Erfassen des Überstands, der cytosolischen Proteine enthalten und speichern es bei 4 ° C (kurzfristig) oder-20 ° C (langfristig).
2. Entfernen Sie überschüssiges Digitonin und cytosolischen Proteine durch Zentrifugation.
   1. Aufzuwirbeln Sie das Digitonin-permeabilized Zelle Pellet (aus Schritt 3.1.5) in Puffer A auf eine Endkonzentration von 4 × 10⁶ Zellen/mL und Pipette vorsichtig zu Klumpen brechen.
   2. Die Digitonin-permeabilized Zellsuspension bei 400 × g für 10 min Zentrifugieren und den Überstand zu entfernen.
      Hinweis: Wiederholte Waschungen in Puffer A können durchgeführt werden, um überschüssige cytosolischen Verunreinigungen zu entfernen.

(4) Zelle Homogenisierung

1. Brüten Sie die Zellen auf dem Eis in Lyse Puffer B und lösen Sie sie mit mechanischen Mitteln.
   1. Unmittelbar vor der Wiederfreisetzung Zellen (Schritt 4.1.2) hinzufügen 10 µL des Bestandes PMSF (100 mM) und 2 µL des Bestandes SOV (500 mM) 988 µL Lyse Puffer B (Endkonzentrationen sind 1 mM PMSF und 1 mM SOV; letzte Lautstärke für Anzahl von Zellen lysiert werden) und halten Sie Solu Tion auf Eis bis zu Zelle Pellet.
   2. Aufschwemmen der Zelle Pellet (aus Schritt 3.2.2) in eiskalten Lyse B Pufferlösung mit PMSF und SOV (vorbereitet in Schritt 4.1.1) auf eine Endkonzentration von 4 × 10⁶ Zellen/mL.
   3. Inkubieren Sie die Zellsuspension auf Eis für 30 min.
   4. Übertragen der Zellsuspension auf eine vorgekühlt Dounce-Homogenisator (mit einem eng anliegenden B Stößel) auf Eis und 40 Pässe mit den Homogenisator Stößel mit langsam, auch Schläge ausführen.
      Hinweis: Alternativ nutzen Sie andere Mittel der mechanischen Zelle Lyse wie beschrieben im Diskussionsteil.
   5. Sammeln Sie das Homogenat und übertragen Sie es auf eine saubere Zentrifugenröhrchen.
   6. Waschen Sie den Homogenisator Stößel und Rohr mit einem kleinen Volumen (1 bis 2 mL) der Lyse Puffer B und das Homogenat hinzufügen.
   7. Zentrifugieren Sie das Homogenat in 400 × g (oder die Mindestgeschwindigkeit erforderlich, um ununterbrochene Zellen pellet) für 10 min.
   8. Übertragen Sie den Überstand auf eine saubere Zentrifugenröhrchen.
      Hinweis: Bleibt ein bedeutender Pellet wiederholen Sie die Schritte 4.1.4 durch 4.1.6 erhöhen den Ertrag der Brüche als detailliert im Abschnitt Diskussion. Das Protokoll kann hier angehalten, und das Homogenat kurzfristig (24 h) bei 4 ° C gelagert.

(5) differentielle Zentrifugation

1. Zentrifugieren Sie das Homogenat mit steigender Geschwindigkeit, Zelltrümmer, isolieren Mitochondrien und Membran Brüche zu entfernen.
   1. Zentrifugieren des Überstands (aus Schritt 4.1.8) bei 500 × g für 10 min. Transfer Überstand auf eine saubere Zentrifugenröhrchen, und verwerfen alle Pellet.
   2. Zentrifugieren Sie überstand (aus Schritt 5.1.1) bei 1.000 × g für 10 min. Transfer des Überstands auf eine saubere Zentrifugenröhrchen, und verwerfen Sie alle Pellet.
   3. Zentrifugieren des Überstands (aus Schritt 5.1.2) bei 2.000 × g für 10 min. Transfer der Überstand auf eine saubere Zentrifugenröhrchen, und verwerfen alle Pellet.
   4. Zentrifugieren des Überstands (aus Schritt 5.1.3) bei 4.000 × g für 15 min. Transfer Überstand auf eine saubere Zentrifugenröhrchen, halten Pellet mit Mitochondrien.
   5. Aufschwemmen der Mitochondrien Pellet in einem kleinen Volumen (0.5\u20121 mL) der Lyse Puffer B.
   6. Zentrifugieren der suspendierten Pellet bei 4.000 × g für 15 min. Entfernen des Überstandes und Aufschwemmen der mitochondrialen Pellet in das gewünschte Endvolumen Probenpuffer (z.B., 250 bis 500 µL, je nach Größe des Pellet- und auf Wunsch (Konzentration).
   7. Zentrifuge des Überstands (aus Schritt 5.1.4) bei 4.000 × g für 15 min. Überstand auf eine saubere Zentrifugenröhrchen übertragen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis keine Pellets nach Zentrifugation gewonnen wird.
   8. Drehen Sie den Überstand bei 18.000 × g 3 h.
   9. Entfernen Sie den Überstand zu, und halten Sie das Pellet, Membranproteine enthalten. Aufschwemmen der Membran-Pellets in einem kleinen Volumen (0,5-1 mL) der Lyse Puffer B.
   10. Zentrifugieren der suspendierten Pellets bei 18.000 × g für 1 h.
   11. Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Membran Pellet in das gewünschte Endvolumen Probenpuffer (250 bis 500 µL, abhängig von der Größe der Pellets und der gewünschten Konzentration).
2. Beschallen Sie die Probe-Pellets für 3 s im Eisbad bei einer Leistung von 5 (50 % von 125 W maximale Leistung bei 20 kHz, siehe Die Tabelle Materialien).
3. Speichern Sie die Proben bei 4 ° C (kurzfristig) oder-20 ° C (langfristig).
4. Die Proben für die Reinheit der Fraktionierung zu untersuchen, indem Sie ein western-Blot mit Antikörper gegen Protein Marker gefunden in den Zytoplasma, Mitochondrien und Membran der Zelle durchführen (siehe Abschnitt "repräsentative Ergebnisse").

Ergebnisse

Erfolgreiche Fraktionierung der undifferenzierten U937⁸ Zellen in Suspension angebaut wurde durchgeführt unter Verwendung des Protokolls genannten und in Abbildung 1dargestellt. Die Proben, die mit dieser Methode wurden westlichen befleckenden⁹ Nutzung eine nasse Übertragungsmethode auf eine Membran Polyvinylidene Fluorid (PVDF) unterzogen. Die Membran wurde anschließend mit Antikörpern gegen sondiert zytopl...

Diskussion

Die Entwicklung dieses Protokolls entstand aus einer Unfähigkeit, mitochondriale trennen und Membran-Proben, mit handelsüblichen Kits für die Analyse von Protein-Lokalisierung während Necroptosis¹⁴. Die primäre Einschränkungen von vorgefertigten Kits sind ihre Unfähigkeit, auf die Bedürfnisse des einzelnen Forschers angepasst werden die Kosten pro Probe und begrenzte Anzahl von Proben können verarbeitet werden. Die hier vorgestellte Methode kann ohne den Einsatz von teuren Reagenzien und ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digitonin	TCI Chemicals	D0540	For Cytoplasm Extraction
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125	For Lysis buffer B
Dounce homogenizer	VWR	22877-282	For Homogenization
end-over-end rotator	Barnstead	N/A	For Cytoplasm Extraction
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Alfa Aesar	J61721	For Lysis buffer B
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E7889	For Lysis buffer B
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118	For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000
HEPES	VWR	J848	For Lysis buffers A and B
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	For Lysis buffer B
MgCl2	Alfa Aesar	12315	For Lysis buffer B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565	For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	For Lysis buffer A
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	VWR	M145	For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer
probe sonicator	Qsonica	Q125-110	For Final Samples
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML	For Cytoplasm Extraction
refrigerated centrifuge	Beckman-Coulter	N/A
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	VWR	227	For Sample buffer
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma-Aldrich	450243	For Lysis buffers A and B
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	For Lysis buffer B
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	788	For Sample buffer
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661	For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000