高速离心条件下 u937 细胞的细胞分裂

摘要

在这里, 我们提出了一个在不使用高速离心的情况下分离 u937 细胞的质膜、细胞质和线粒体的方案。该技术可用于纯化亚细胞组分, 以便随后通过免疫印迹检查蛋白质定位。

摘要

在该协议中, 我们详细介绍了在不使用超离心或不滥用洗涤剂的情况下获取 u937 细胞亚细胞分数的方法。该方法利用低渗缓冲液、数字素、机械裂解和差动离心分离细胞质、线粒体和质膜。这个过程可以扩大规模, 以满足研究人员的需求, 既便宜又直接。这种方法将使研究人员能够在没有专门离心机和商业试剂盒的情况下确定细胞中蛋白质的定位, 这两种方法的成本都高得令人望而却步。我们已经成功地使用这种方法分离人单细胞系 u937 中的细胞质、质膜和线粒体蛋白。

引言

在检查真核细胞中的分子途径时, 通常需要可靠地识别蛋白质定位。研究人员利用获得亚细胞组分的方法来更仔细地检查感兴趣的细胞成分。

大多数现有的细胞分馏方法一般分为两大类, 即基于洗涤剂^{的 1、2}和基于超离心的^{3、4、5, 它们}可以是以速度、精度和成本为区别。基于洗涤剂的协议依赖于使用具有不断增加的洗涤剂强度的缓冲液来溶解细胞的不同成分。这是一种快速方便的样品处理方法, 如果样品数量和大小较小, 则具有成本效益。以洗涤剂为基础的试剂盒可以从细胞中分离细胞质、膜细胞器 (混合组分) 和核组分。然而, 与这些试剂盒相关的一些缺点限制了他们对研究人员的有用性。它们旨在轻松分离单元的一个或两个组件, 但无法同时从样本中分离所有分数。洗涤剂的使用意味着质膜和膜封闭的细胞器将同样溶解, 因此, 无法相互分离。另一个复杂因素来自于这些试剂盒中的专有组件, 这些组件阻止研究人员更改特定应用的条件。最后, 它们的用途有限, 对于规模较大的实验来说可能费用高得令人望而却步。非洗涤剂为基础的试剂盒存在于线粒体的分离, 但是, 它们不是用来分离质膜的, 样品的收率明显低于密度离心分离协议^6,7.

利用超离心获得分数的方法比基于洗涤剂的试剂盒更耗时, 但往往会产生更纯净的组分。要在不首先溶解细胞的情况下从细胞中分离等离子体膜 (导致膜细胞器污染), 需要用非洗涤剂方法对其进行裂解, 然后通过差异分离细胞成分离心--质膜分离需要 100, 000xg 的速度才能完成。在许多情况下, 差动离心之后必须进行等温密度梯度离心, 以进一步分离细胞组分或去除污染物。虽然这些方法是彻底和可修改的, 缺点包括成本, 时间消耗, 以及需要一个超离心分离的分数和进一步纯化通过密度梯度离心。大多数高速离心机的费用对个别调查人员来说是令人望而却步的, 而且往往是学术机构共享的核心设备。因此, 在这些情况下, 超离心机的可用性变得令人望而却步。

在这个分馏协议中, 我们证明了在不使用溶解性洗涤剂和不高速离心的情况下分离亚细胞分数。这种方法将使研究人员能够分离真核细胞的质膜、线粒体和细胞质成分, 并将分数之间的污染降至最低。

研究方案

1. 准备缓冲器和试剂

注: 请参见表 1。

1. 准备缓冲液 a、裂解缓冲液 b、样品缓冲液和数字宁的溶液。
   1. 加入 8.77 g 的氯化钠和50毫升的 hepes (1 m, ph 7.4) 到900毫升去离子水, 用去离子水将最终体积调整为1升。
      注: 最终浓度为 150 mm 氯化钠和 50 mm hepes。
   2. 加入20毫升的 hepes (1 m, ph 7.4) 制备裂解缓冲液 b, kcl 0.75 g, mgcl₂, 2 ml 乙二胺四乙酸 (0.5 m edta), 2 毫升乙二醇乙基乙基 (β-氨基乙醚)-n, n, n '-四乙酸 (0.5 m egta), 38.26 克甘露醇和23.96 克蔗糖至900毫升去离子水, 用去离子水将最终体积调整为1升。
      注: 最终浓度为 20 mm hepes、10 mm kcl、2 mm mgcl 2、1mm edta、1 mm egta、210 mm 甘露醇和 70 mm 蔗糖。
   3. 将 0.01 g 十二烷基硫酸钠 (sds) 加入10毫升的三缓冲盐水 (tbs), 最终浓度为 0.1% sds, 从而制备样品缓冲液。
   4. 在去离子水的100毫升中加入25毫克的数字素 (最终浓度为 250μg/ml), 准备一个数字素的库存溶液。
   5. 将所有缓冲液存储在 4°c, 将数字素存储在-20°c, 直到实验开始。
2. 准备新的蛋白酶和磷酸酶抑制剂的解决方案, 添加到缓冲溶液之前添加到细胞。
   1. 将17.4 毫克的 pmsf 添加到100% 乙醇的1毫升 (最终浓度为 100 mm), 制备苯甲磺酰氟化硫 (pmsf) 的库存溶液。
      注意: 在处理 pmsf 时, 请佩戴适当的防护设备并谨慎行事。私营军事和废物管理基金在摄入时具有危险性, 在皮肤接触 (刺激性)、眼神接触 (刺激性) 或吸入的情况下具有轻微危险;它对眼睛和皮肤有腐蚀性。
   2. 根据制造商的说明准备一种市售的蛋白酶抑制剂鸡尾酒 (100x) (参见材料表)。
   3. 在去离子水的1毫升中加入92毫克的 sov (最终浓度为 500 mm), 制备正奥瓦酸钠 (sov) 的库存溶液。
      注意: 请佩戴适当的防护设备, 并在操作时小心操作。在眼睛接触 (刺激物)、摄入或吸入的情况下, sov 是危险的。严重的过度接触会导致死亡。

2. 公共安全

1. 在分馏前, 在磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中浓缩和清洗细胞。
   1. 以适当的速度离心细胞悬浮液, 以形成颗粒。例如, 离心机将 u937 细胞悬浮在400xg 下 10分钟。
   2. 取出上清液, 在室温 pbs 中重新悬浮细胞颗粒, 最终浓度为 4x10⁶ cells/mL, 轻轻将移液器分解团块。
   3. 以400xg 离心细胞悬浮液 10分钟以植入细胞。
   4. 在最终浓度为 2x10^{7 细胞}的情况下, 取出上清液并在冰冷缓冲液 a 中重新悬浮细胞颗粒。
      注: 所有后续步骤应在4°c或冰上执行, 所有缓冲器应预先冷却。

3. 细胞蛋白分离

1. 用洗涤剂的数字素孵育提取细胞质蛋白。
   1. 紧接细胞重新悬浮之前 (步骤 3.1.3) 添加10μl 的库存永磁同步体 (100 mm), 10μl 蛋白酶抑制剂 (100x)、2μl 股票 sov (500 mm) 和100μl 的股票数尼宁 (250μg/ml) 至878μl 缓冲液 a (最终浓度为 1 mm pmsf), 1x 蛋白酶抑制剂, 1mm sov 和25μgml 数联宁;根据所使用的单元格数调整最终卷)。将溶液放在冰上, 直到细胞颗粒的加入。
   2. 将细胞悬浮液在 400xg下离心 10分钟, 并去除上清液。
   3. 在液相缓冲液中重新注射细胞颗粒含有抑制剂和数字素 (3.1.1 步骤制备) 的溶液, 最终浓度为 2x10^{7 细胞}, 轻轻地将移液器分解团块。
   4. 在4°c 下将细胞悬浮液在端端旋转器上培养20分钟。
   5. 将细胞悬浮液以400xg 离心 10分钟, 收集上清液, 并将其放入干净的离心管中。
   6. 以 18, 000xg 离心收集的上清液 20分钟, 以颗粒细胞碎片。
   7. 将上清液转移到干净的离心管中。
   8. 重复步骤3.1.5 和 3.1.6, 直到离心后没有获得颗粒。
   9. 收集含有细胞质蛋白的上清液, 并将其储存在 4°c (短期) 或-20°c (长期)。
2. 通过离心去除多余的数字蛋白和细胞质蛋白。
   1. 在最终浓度为 4x10 6 细胞的情况下, 将具有数字渗透性的细胞颗粒 (从步骤 3.1.5⁾重新注入缓冲液 a 中, 轻轻将团块分解。
   2. 将数字渗透电池悬浮液在 400xg下离心 10分钟, 并去除上清液。
      注: 可以在缓冲液 a 中重复清洗, 以去除多余的细胞质污染物。

4. 细胞同质化

1. 将细胞在冰上的裂解缓冲液 b 中培养, 并通过机械方法裂解。
   1. 在细胞重新悬浮之前 (步骤 4.1.2), 将10μl 的库存 pmsf (100 mm) 和2μl 的库存 sv (500 mm) 添加到988μl 的裂解缓冲液 b (最终浓度为 1 mm pmsf 和 1 mm sov; 调整最终体积, 以适应被裂解的细胞数量), 并保持独奏在冰上, 直到细胞颗粒的补充。
   2. 在含有 pmsf 和 sov 的冰冷裂解缓冲液 b 溶液中, 在 14x10^{6 细胞}的最终浓度下, 将细胞颗粒 (从步骤 3.2.2) 重新沉淀。
   3. 在冰上培养细胞悬浮液30分钟。
   4. 将细胞悬浮液转移到冰上的预冷的盎司均质机 (带紧固的 b 穿山甲), 并使用缓慢、均匀的行程与均质机穿手一起执行40次传球。
      注: 或者利用讨论部分详述的其他机械细胞裂解方法。
   5. 收集均质, 并将其转移到一个干净的离心管。
   6. 用小体积 (1 至2毫升) 的裂解缓冲液 b 清洗均质机的孔和管, 并将其添加到均质化体中。
   7. 以 400xg (或颗粒未碎细胞所需的最小速度) 离心均匀度10分钟。
   8. 将上清液转移到干净的离心管中。
      注意: 如果一个重要的颗粒仍然重复步骤4.1.4 通过 4.1.6, 以提高分数的产量, 详见讨论部分。协议可以在这里暂停, 在4°c 下短期 (24小时) 储存。

5. 差动离心

1. 以越来越快的速度离心均质体, 以去除细胞碎片, 分离线粒体和膜组分。
   1. 将上清液 (从步骤 4.1.8) 以500xg 离心 10分钟 , 将上清液转移到干净的离心管中, 并丢弃任何颗粒。
   2. 以 1, 000x g离心上清液 (从步骤 5.1.1) 10分钟, 将上清液转移到干净的离心管中, 并丢弃任何颗粒。
   3. 将上清液 (从步骤 5.1.2 )以 2, 000xg 离心 10分钟, 将上清液转移到干净的离心管中, 并丢弃任何颗粒。
   4. 将上清液 (从步骤 5.1.3 )以 4, 000xg 离心 15分钟, 将上清液转移到干净的离心管中,保持颗粒中含有线粒体。
   5. 在小体积 (0.5 \ e20120121 ml) 的裂解缓冲液 b 中再利用线粒体颗粒。
   6. 以 4, 000xg 离心悬浮颗粒 15分钟 , 取出上清液, 并在所需的最后粒量样品缓冲液中重新悬浮线粒体颗粒 (例如, 250 至 500μl, 视颗粒的大小和所需的颗粒大小而定浓度)。
   7. 将上清液 (从步骤 5.1.4) 以 4, 000xg 离心 15分钟, 将上清液转移到干净的离心管中。重复此步骤, 直到离心后没有获得颗粒。
   8. 旋转上清液在 18, 000xg 3小时。
   9. 去除上清液, 并保持颗粒含有膜蛋白。将膜颗粒重新循环到小体积 (0.5–1 ml) 的裂解缓冲液 b 中。
   10. 以 18, 000xg 离心悬浮颗粒 1小时 。
   11. 取出上清液, 并在所需的最终样品缓冲液体积 (250 至 500μl, 取决于颗粒的大小和所需的浓度) 中重新悬浮膜颗粒。
2. 在功率设置为 5 (20千赫的 125 w 最大功率的 50%, 见材料表) 的情况下, 在冰浴中对样品颗粒进行3秒的取样。
3. 将样品存放在 4°c (短期) 或-20°c (长期)。
4. 通过对细胞的细胞质、线粒体和膜隔间中的蛋白质标记物进行抗体检测样品的纯度 (参见具有代表性的结果部分)。

结果

利用上面详细的协议和图 1^所示的协议, 成功地完成了悬浮液中生长的未分化 u937 8 细胞的成功分馏。用这种方法获得的样品采用湿法转移到聚偏氟乙烯 (pvdf) 膜上进行了西方印迹⁹ 。随后用细胞质、线粒体和膜局部蛋白标记抗体对膜进行了检测 (图 2,图 3,?...

讨论

该方案的发展源于无法分离线粒体和膜样本, 使用商业上可获得的试剂盒, 以分析在坏死14期间的蛋白质定位.预制试剂盒的主要局限性是, 它们无法适应个别研究人员的需要, 每个样本的费用有限, 能够加工的样品数量有限。这里介绍的方法可以在不使用昂贵的试剂的情况下进行, 也不需要昂贵的设备。这种方法可以进行缩放, 以容纳任意数量的细胞, 并能够进行修改, 以适应研究人?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digitonin	TCI Chemicals	D0540	For Cytoplasm Extraction
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125	For Lysis buffer B
Dounce homogenizer	VWR	22877-282	For Homogenization
end-over-end rotator	Barnstead	N/A	For Cytoplasm Extraction
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Alfa Aesar	J61721	For Lysis buffer B
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E7889	For Lysis buffer B
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118	For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000
HEPES	VWR	J848	For Lysis buffers A and B
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	For Lysis buffer B
MgCl2	Alfa Aesar	12315	For Lysis buffer B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565	For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	For Lysis buffer A
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	VWR	M145	For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer
probe sonicator	Qsonica	Q125-110	For Final Samples
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML	For Cytoplasm Extraction
refrigerated centrifuge	Beckman-Coulter	N/A
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	VWR	227	For Sample buffer
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma-Aldrich	450243	For Lysis buffers A and B
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	For Lysis buffer B
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	788	For Sample buffer
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661	For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000