Fraccionamiento de la célula de las células U937 en ausencia de centrifugación de alta velocidad

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para aislar la membrana plasmática, citoplasma y mitocondrias de las células U937 sin el uso de la centrifugación de alta velocidad. Esta técnica se puede utilizar para purificar fracciones subcelulares para la examinación subsecuente de la localización de la proteína mediante immunoblotting.

Resumen

Este protocolo nos detalladamente un método para obtener fracciones subcelulares de las células U937 sin el uso de ultracentrifugación o indiscriminadas detergentes. Este método utiliza buffers hipotónicas, digitonin, lisis mecánica y centrifugación diferencial para aislar el citoplasma, mitocondrias y membrana plasmática. El proceso puede escalarse para satisfacer las necesidades de los investigadores, es barato y sencillo. Este método permitirá a los investigadores a determinar la localización de la proteína en células sin centrífugas especializadas y sin el uso de kits comerciales, los cuales pueden ser prohibitivos. Hemos utilizado con éxito este método para separar citosólica, membrana del plasma y proteínas mitocondriales en la línea de celular del monocito humana U937.

Introducción

Identificación confiable de la localización de la proteína es a menudo necesaria al examinar vías moleculares en las células eucariotas. Métodos para obtener fracciones subcelulares son utilizados por los investigadores a examinar más de cerca los componentes celulares de interés.

La mayoría de los métodos de fraccionamiento celular existentes cae generalmente en dos amplias categorías, a base de detergente^1,2 y basado en la ultracentrifugación^3,4,5, que puede ser diferenciados por la velocidad, precisión y costo. Detergentes basado en protocolos se basan en el uso de buffers con el aumento de fuerza detergente para solubilizar componentes distintos de la célula. Este es un método rápido y conveniente para el procesamiento de las muestras y puede ser rentable si el número y tamaño de las muestras son pequeñas. Base de detergente kits pueden comprarse para aislar citoplásmico membrana/organelo (fracción mixta) y fracciones nucleares de las células. Sin embargo, varios inconvenientes asociados con estos kits de limitan su utilidad a los investigadores. Están diseñados para aislar fácilmente uno o dos componentes de la célula, pero son incapaces de aislar todas las fracciones de una muestra al mismo tiempo. El uso de detergentes hace que la membrana plasmática y los organelos de membrana-incluido va ser solubilizados igualmente y, por tanto, no pueden ser separados uno del otro. Una complicación adicional surge de los componentes patentados en estos kits que impide que los investigadores alterar condiciones para aplicaciones específicas. Por último, ellos están limitados en número de aplicaciones y pueden ser prohibitivos para los experimentos de escala más grandes. Kits base detergente no existen para el aislamiento de mitocondrias, sin embargo, no están diseñados para aislar la membrana del plasma y el rendimiento de la muestra es significativamente menor que el de centrifugación de densidad basado en protocolos de aislamiento^6,7 .

Métodos que utilizan ultracentrifugación para obtener fracciones son más tiempo consumiendo, pero a menudo resultado en fracciones más que kits de detergente. Para aislar las membranas del plasma de las células sin primero solubilizando los (dando por resultado la contaminación con organelos de membrana) obliga a la lisis por un método sin detergente seguido de separación de componentes celulares mediante diferencial centrifugación, con aislamiento de membrana plasmática que requieren velocidades de 100.000 × g para llevar a cabo. En muchos casos, debe seguirse diferencial centrifugación isopicnica centrifugación gradiente de densidad para más separación de fracciones celulares o eliminación de contaminantes. Mientras que estos métodos son minuciosos y modificables, inconvenientes incluyen coste, el consumo de tiempo y la necesidad de una ultracentrífuga para la separación de fracciones y más purificación a través de densidad gradiente centrifugación. Centrifugadoras de alta velocidad la mayoría están en un costo prohibitivo para investigadores individuales y son a menudo compartidas, base de equipos en instituciones académicas. Así, la disponibilidad de la ultracentrífuga se convierte en prohibitiva en estas situaciones.

En este protocolo de fraccionamiento se demuestra el aislamiento de fracciones subcelulares sin el uso de detergentes de solubilización y sin centrifugación de alta velocidad. Este método permitirá a los investigadores aislar la membrana plasmática, las mitocondrias y componentes citoplasmáticos de una célula eucariota con mínima contaminación entre fracciones.

Protocolo

1. preparación de tampones y reactivos

Nota: Vea la tabla 1.

1. Preparar soluciones de tampón de lisis B, tampón, tampón A y digitonin.
   1. Preparar el tampón A agregando 8,77 g de NaCl y 50 mL de HEPES (1 M, pH 7,4) a 900 mL de agua desionizada, ajustar el volumen final de 1 L con agua desionizada.
      Nota: Concentraciones finales son 150 mM de NaCl y 50 mM HEPES.
   2. Preparar el tampón de lisis B añadiendo 20 mL de HEPES (1 M, pH 7.4), 0,75 g de KCl, 0,19 g de MgCl₂, 2 mL de ácido etilendiaminotetracético (EDTA de 0,5 M), 2 mL de etilenglicol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacético ácido (0.5 M EGTA) , 38,26 g de manitol y 23,96 g de sacarosa a 900 mL de agua desionizada, ajustar el volumen final de 1 L con agua desionizada.
      Nota: Concentraciones finales son 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM de MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, manitol de 210 mM y 70 mM sacarosa.
   3. Preparar el tampón de muestra mediante la adición de 0.01 g de sulfato de sodio dodecyl (SDS) a 10 mL de solución salina tamponada con tris (TBS) para una concentración final de 0.1% SDS.
   4. Prepare una solución de digitonin mediante la adición de 25 mg de digitonin a 100 mL de agua desionizada (concentración final es de 250 μg/mL).
   5. Guarde todas las soluciones tampón a 4 ° C y digitonin a-20 ° C hasta el comienzo del experimento.
2. Preparar soluciones frescas de inhibidores de la proteasa y fosfatasa a añadirse a soluciones antes de la adición a las células.
   1. Prepare una solución de phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF) añadiendo 17,4 mg de PMSF 1 ml de etanol al 100% (concentración final es 100 mM).
      PRECAUCIÓN: Use equipo de protección adecuado y tenga cuidado al manipular el PMSF. PMSF es peligroso si se ingiere y ligeramente peligroso en caso de contacto con la piel (irritante), contacto con los ojos (irritante) o por inhalación; es corrosivo para los ojos y la piel.
   2. Preparar un cóctel de inhibidor de la proteasa disponibles comercialmente (100 ×) según las instrucciones del fabricante (véase la Tabla de materiales).
   3. Preparar una solución stock de ortovanadato de sodio (SOV) mediante la adición de 92 mg de SOV a 1 mL de agua desionizada (concentración final es de 500 mM).
      PRECAUCIÓN: Use equipo de protección adecuado y tenga cuidado cuando maneje. SOV es peligroso en caso de contacto con los ojos (irritante), ingestión o inhalación. La sobreexposición severa puede causar la muerte.

2. PBS lavado

1. Concentrar y lavar las células en solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes del fraccionamiento.
   1. Centrifugue la suspensión celular a una velocidad adecuada para crear un diábolo. Por ejemplo, centrifugar una suspensión de células U937 en 400 × g por 10 min.
   2. Eliminar el sobrenadante, Resuspender el precipitado de células en PBS de la temperatura ambiente a una concentración final de 4 × 10⁶ células/mL y la pipeta suavemente para romper grumos.
   3. Centrifugue la suspensión de células a 400 x g durante 10 minutos para que sedimenten las células.
   4. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en solución tampón de hielo frío A en una concentración final de 2 × 10⁷ células/mL.
      Nota: Todos los pasos subsecuentes deben llevarse a cabo a 4 ° C o en hielo y todas las memorias intermedias deben ser previamente enfriada.

3. citosólica proteína aislamiento

1. Extracto de proteínas citosólicas por incubación con digitonin detergente.
   1. Inmediatamente antes de la resuspensión de las células (paso 3.1.3) Añadir 10 μl de caldo PMSF (100 mM), 10 μl de inhibidor de proteasa (× 100), 2 μl de caldo SOV (500 mM) y 100 μl de digitonin stock (250 μg/mL) a 878 μl de buffer A (concentraciones finales están de 1 mM PMSF , 1 x inhibidor de la proteasa, 1 mM SOV y 25 μg/mL digitonin; ajustar el volumen final según el número de células se utiliza). Mantenga la solución en el hielo hasta que además de pellets celulares.
   2. Centrifugar la suspensión celular en 400 × g por 10 min y retirar el sobrenadante.
   3. Resuspender el precipitado de células en solución buffer A inhibidores y digitonin (preparado en el paso 3.1.1) a una concentración final de 2 × 10⁷ células/mL, pipeta suavemente para romper grumos.
   4. Incubar la suspensión celular en un rotador de extremo a extremo a 4 ° C por 20 min.
   5. Centrifugar la suspensión celular en 400 × g durante 10 minutos recoge el sobrenadante y colocar en un tubo de centrífuga limpio.
   6. Centrifugar el sobrenadante recogido en 18.000 × g por 20 min para que sedimenten los detritos celulares.
   7. Transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio.
   8. Repita los pasos 3.1.5 y 3.1.6 hasta no pellet se obtiene tras centrifugación.
   9. Recoger el sobrenadante que contiene las proteínas citosólicas y almacenar a 4 ° C (corto plazo) o a-20 ° C (largo plazo).
2. Retire el exceso digitonin y proteínas citosólicas por centrifugación.
   1. Resuspender el precipitado celular permeabilized digitonin (de paso 3.1.5) en tampón A, a una concentración final de 4 × 10⁶ células/mL y la pipeta suavemente para romper grumos.
   2. Centrifugar la suspensión celular permeabilized digitonin en 400 × g por 10 min y retirar el sobrenadante.
      Nota: Repetidos lavados en tampón A pueden realizarse para eliminar el exceso de contaminantes citosólico.

4. homogeneización de la célula

1. Incubar las células en hielo en tampón de lisis B y lyse por medios mecánicos.
   1. Inmediatamente antes de la resuspensión de las células (paso 4.1.2) Añadir 10 μl del stock PMSF (100 mM) y 2 μl de caldo SOV (500 mM) a 988 μl de tampón de lisis B (concentraciones finales son 1 mM PMSF y 1 mM SOV, ajustar el volumen final para acomodar el número de células que lisis) y solu ción en el hielo hasta además de pellets celulares.
   2. Resuspender el precipitado de células (del paso 3.2.2) en solución de tampón B de lisis fria con PMSF y SOV (preparado en el paso 4.1.1) en una concentración final de 4 × 10⁶ células/mL.
   3. Incubar la suspensión celular en hielo durante 30 minutos.
   4. Transferir la suspensión de células a un homogeneizador de Dounce previamente enfriado (con un mortero de B ajustados) en hielo y realizar 40 pases con la mano del mortero homogeneizador con lento, incluso trazos.
      Nota: También puede utilizar otros medios de lisis celular mecánica tal como se detalla en la sección de discusión.
   5. Recoger el homogeneizado y transferirlo a un tubo de centrífuga limpio.
   6. Lave el mortero homogeneizador y el tubo con un pequeño volumen (1 a 2 mL) de tampón de lisis B y añadir al homogeneizado.
   7. Centrifugar el homogeneizado a 400 × g (o la velocidad mínima necesaria para que sedimenten las células intactas) durante 10 minutos.
   8. Transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio.
      Nota: Si una pelotilla significativa permanece 4.1.4 a través 4.1.6 para aumentar el rendimiento de fracciones como Repita los pasos detallados en la sección de discusión. El protocolo se puede detener aquí, y el homogenado almacenados a 4 ° C para el corto plazo (24 h).

5. diferencial centrifugación

1. Centrifugar el homogeneizado a aumentar la velocidad para eliminar los residuos celulares, mitocondrias aisladas y fracciones de la membrana.
   1. Centrifugar el sobrenadante (de paso 4.1.8) a 500 × g por 10 min transferencia sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y descartar cualquier pelotilla.
   2. Centrifugar el sobrenadante (desde el paso 5.1.1) en 1.000 × g por 10 min transferencia el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y descartar cualquier pelotilla.
   3. Centrifugar el sobrenadante (de paso 5.1.2) a 2.000 × g por 10 min transferencia el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y descartar cualquier pelotilla.
   4. Centrifugar el sobrenadante (de paso 5.1.3) a 4.000 x g durante 15 min. traslado sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio, mantener pellet que contiene mitocondrias.
   5. Resuspender el precipitado de las mitocondrias en un pequeño volumen (0.5\u20121 mL) de tampón de lisis B.
   6. Centrifugue el sedimento suspendido a 4.000 × g durante 15 minutos retirar el sobrenadante y resuspender el mitocondrial pelotilla en el volumen final deseado del tampón de muestra (por ejemplo, 250 a 500 μl, dependiendo del tamaño de la pelotilla y deseado concentración).
   7. Centrifugar el sobrenadante (de paso 5.1.4) a 4.000 x g durante 15 minutos transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio. Repita este paso hasta que no pellet se obtiene tras centrifugación.
   8. Girar el sobrenadante a 18.000 × g durante 3 h.
   9. Quite el sobrenadante y mantener el pellet que contiene proteínas de la membrana. Resuspender el precipitado de la membrana en un pequeño volumen (0,5 – 1 mL) de lysis buffer B.
   10. Centrifugue el sedimento suspendido en 18.000 × g durante 1 hora.
   11. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de membrana en el volumen final deseado del tampón de muestra (250 a 500 μl, dependiendo del tamaño de la pelotilla y la concentración deseada).
2. Someter a ultrasonidos las pelotillas de muestra de 3 s en un baño de hielo en un ajuste de potencia de 5 (50% de 125 W de potencia máxima a 20 kHz, ver La tabla de materiales).
3. Almacenar las muestras a 4 ° C (corto plazo) o a-20 ° C (largo plazo).
4. Examinar las muestras de pureza del fraccionamiento mediante la realización de un western blot utilizando anticuerpos contra marcadores de proteínas encontrados los compartimientos del citoplasma, mitocondrias y membrana de la célula (refiérase a la sección de resultados representativos).

Resultados

Fraccionamiento exitoso de células indiferenciadas de la⁸ de U937 cultivadas en suspensión fue logrado usando el protocolo detallado arriba e ilustrado en la figura 1. Las muestras obtenidas con este método fueron sometidas a western blot⁹ utilizando un método de transferencia mojado a una membrana de polivinilideno (PVDF) de fluoruro. La membrana fue posteriormente explorada con anticuerpos contra citoplasm...

Discusión

El desarrollo de este protocolo surge de la incapacidad de separar mitocondrial y las muestras de la membrana, usando kits disponibles en el mercado, para el análisis de la localización de la proteína durante la necroptosis¹⁴. Las limitaciones primarias de kits prefabricados son su incapacidad para adaptarse a las necesidades de los investigadores individuales, su costo por muestra y el número limitado de muestras capaces de ser procesados. El método presentado aquí se puede realizar sin el ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digitonin	TCI Chemicals	D0540	For Cytoplasm Extraction
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125	For Lysis buffer B
Dounce homogenizer	VWR	22877-282	For Homogenization
end-over-end rotator	Barnstead	N/A	For Cytoplasm Extraction
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Alfa Aesar	J61721	For Lysis buffer B
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E7889	For Lysis buffer B
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118	For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000
HEPES	VWR	J848	For Lysis buffers A and B
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	For Lysis buffer B
MgCl2	Alfa Aesar	12315	For Lysis buffer B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565	For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	For Lysis buffer A
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	VWR	M145	For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer
probe sonicator	Qsonica	Q125-110	For Final Samples
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML	For Cytoplasm Extraction
refrigerated centrifuge	Beckman-Coulter	N/A
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	VWR	227	For Sample buffer
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma-Aldrich	450243	For Lysis buffers A and B
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	For Lysis buffer B
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	788	For Sample buffer
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661	For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000