תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את קרום פלזמה, הציטופלסמה ואת המיטוכונדריה U937 תאים ללא שימוש צנטריפוגה במהירות גבוהה. טכניקה זו ניתן לטהר שברים subcellular הבאים בחינת לוקליזציה חלבון באמצעות immunoblotting.

Abstract

ב פרוטוקול זה אנחנו מפרטים שיטה להשיג שברים subcellular של תאים U937 ללא שימוש ultracentrifugation או בדטרגנטים ללא הבחנה. שיטה זו משתמשת מאגרי היפוטוניק, digitonin, פירוק מכני, צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד את הציטופלסמה, המיטוכונדריה ואת קרום פלזמה. התהליך וניתן לשנותם כדי להתאים את הצרכים של החוקרים, היא פעולה פשוטה וזולה. שיטה זו יאפשר לחוקרים לקבוע לוקליזציה של חלבונים בתאים ללא בדיקות מיוחדות וללא שימוש קיטים מסחריים, אשר שניהם ניתן לחדשו. אנחנו משתמשים בהצלחה זו שיטה להפרדת cytosolic, קרום פלזמה, חלבונים מיטוכונדריאלי בקו התא האנושי מונוציט U937.

Introduction

זיהוי אמין של חלבון לוקליזציה הכרחי לעתים קרובות בעת בחינת מסלולים מולקולריים בתאים האיקריוטים. שיטות להשגת שברים subcellular מנוצלים על ידי חוקרים לבחון מקרוב את מרכיבי התא עניין.

רוב שיטות קיימות fractionation תא בדרך כלל נחלקים לשתי קטגוריות רחבות, המבוסס על אבקת^1,2 ומבוסס-ultracentrifugation^3,4,5, אשר יכול להיות מובחנת על ידי מהירות, דיוק ועלות. דטרגנט פרוטוקולים מבוסס מסתמכים על השימוש במאגרים עם הגדלת כוח דטרגנט solubilize רכיבים נפרדים של התא. זו היא שיטה מהירה ונוחה לעיבוד דגימות והוא יכול להיות העלות האפקטיבית אם המספר והגודל של דגימות קטנות. ניתן לרכוש ערכות המבוסס על אבקת לבודד cytoplasmic ממברנה/אברון (שבר מעורב), שברים גרעיני תאים. עם זאת, מספר חסרונות הקשורים עם ערכות אלה להגביל את התועלת שלהם לחוקרים. הם נועדו בקלות לבודד את מרכיבי התא אחד או שניים, אך אינם מסוגלים לבודד כל שברים מתוך מדגם בו-זמנית. השימוש של דטרגנטים אומר כי קרום פלזמה של organelles מוקף קרום להיות באותה מידה solubilized ולכן אין אפשרות להיות מופרדים אחד מהשני. סיבוך נוסף נובע הרכיבים קניינית ערכות אלה אשר מונעת חוקרים שינוי התנאים עבור יישומים ספציפיים. לבסוף, הם מוגבלים למספר שימושים, עשוי להיות יקר מדי עבור ניסויים בקנה מידה גדול יותר. ערכות בסיס חומרי שאינם קיימים עבור בידודו של המיטוכונדריה, עם זאת, הם לא נועדו כדי לבודד קרום פלזמה, התשואה מדגם הוא משמעותית פחות מזה של צפיפות צנטריפוגה מבוסס בידוד פרוטוקולים^6,7 .

שיטות לנצל ultracentrifugation להשיג שברים הם יותר זמן צריכת, אבל לעתים קרובות התוצאה בחלקים מזוכך יותר ערכות מבוססי דטרגנט. כדי לבודד ממברנות פלזמה מתאי ללא הראשון solubilizing אותם (וכתוצאה מכך זיהום עם קרום organelles) דורש מהם כדי להיות lysed על ידי שיטה ללא חומרי ואחריו ההפרדה של מרכיבי התא באמצעות דיפרנציאל צנטריפוגה — עם בידוד קרום פלזמה הדורשים מהירויות של × 100,000 g כדי להשיג. במקרים רבים, צנטריפוגה דיפרנציאלית חייב להיות במעקב על-ידי isopycnic צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה להפרדה נוספת של שברים הסלולר או הסרה של מזהמים. בעוד ששיטות אלה הם יסודי ומשתנות, החסרונות כוללים עלות צריכת זמן, את הצורך ultracentrifuge על הפרדה בין שברים ומספרים נוספים טיהור באמצעות צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה. צנטריפוגות במהירות גבוהה ביותר הן בעלות זה אוסרני עבור חוקרים בודדים ולעיתים קרובות משותף, ליבה של ציוד במוסדות אקדמיים. לפיכך, זמינות ultracentrifuge הופך אוסרני במצבים אלה.

ב פרוטוקול fractionation זה נדגים את ניתוקה של שברים subcellular ללא שימוש solubilizing דטרגנטים וללא צנטריפוגה במהירות גבוהה. שיטה זו תאפשר חוקרים לבודד את קרום פלזמה, המיטוכונדריה, cytoplasmic מרכיבי תא האיקריוטים עם זיהום מזערי בין שברים.

Protocol

1. מכינים Buffers וראגנטים

הערה: ראה טבלה 1.

1. להכין פתרונות של מאגר A, פירוק מאגר B, מאגר מדגם digitonin.
   1. להכין מאגר על-ידי הוספת 8.77 g של NaCl ו- 50 מ של HEPES (1 מ', pH 7.4) יונים 900 מל מים, לכוון עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר עם מים יונים.
      הערה: ריכוזי הסופי הם 150 מ מ NaCl 50 מ מ HEPES.
   2. הכנת מאגר פירוק B על-ידי הוספת 20 מ של HEPES (1 מ', pH 7.4), 0.75 גר' אשלגן כלורי, 0.19 גר' MgCl₂, 2 מ ל חומצה Ethylenediaminetetraacetic (0.5 M EDTA), 2 מ של-אתילן גליקול-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-חומצה tetraacetic (0.5 M EGTA) , 38.26 g של מניטול ו- g 23.96 של סוכרוז עד 900 מ"ל של מים יונים, לכוון עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר מים יונים.
      הערה: ריכוזי הסופי הם 20 מ מ HEPES, 10 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ MgCl₂, 1 מ מ EDTA, 1 מ"מ EGTA, 210 מ מ מניטול וסוכרוז 70 מ"מ.
   3. להכין מאגר לדוגמה על-ידי הוספת 0.01 גר' נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות) 10 מ ל תמיסת באגירה טריס (TBS) ריכוז סופי של 0.1% מרחביות.
   4. להכין פתרון מניות של digitonin על-ידי הוספת 25 מ ג של digitonin 100 מ של מים יונים (הריכוז הסופי הוא 250 µg/mL).
   5. אחסן את כל מאגר הפתרונות ב 4 ° C ו digitonin ב-20 ° C עד תחילת הניסוי.
2. להכין טרי פתרונות של מעכבי פרוטאז, פוספטאז להוסיף מאגר פתרונות לפני תוספת לתאים.
   1. להכין פתרון מניות של פלואוריד phenylmethanesulfonyl (PMSF) על-ידי הוספת 17.4 מ"ג של PMSF 1 מ"ל אתנול 100% (הריכוז הסופי הוא 100 מ מ).
      התראה: ללבוש ציוד מגן מתאים וזהירות פעילות גופנית בעת טיפול PMSF. PMSF הוא מסוכנים אם בולעים אותם מעט מסוכן במקרה של מגע עם העור (גירוי), קשר עין (גירוי) או שאיפה; . זה שמשחית העיניים והעור.
   2. להכין קוקטייל מעכב פרוטאז זמינים מסחרית (100 ×) לפי הוראות היצרן (ראה את הטבלה של חומרים).
   3. להכין פתרון מניות של נתרן orthovanadate (SOV) על-ידי הוספת 92 מ ג SOV 1 מ"ל של מים יונים (הריכוז הסופי הוא 500 מ מ).
      התראה: ללבוש ציוד מגן מתאים, נהג בזהירות בעת הטיפול. SOV הוא מסוכן במקרה של קשר עין (גירוי), בליעה או שאיפה. חשיפת יתר חמורה יכולה לגרום למוות.

2. PBS לשטוף

1. להתרכז ולשטוף תאים בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) לפני fractionation.
   1. צנטריפוגה תא ההשעיה במהירות המתאימה ליצירת גלולה. לדוגמה, centrifuge השעיה של תאים U937 ב × 400 g למשך 10 דקות.
   2. הסר את תגובת שיקוע, resuspend תא גלולה ב- PBS בטמפרטורת החדר-ריכוז סופי של 4 × 10⁶ תאים למ"ל, פיפטה בעדינות כדי לשבור את הגושים.
   3. Centrifuge התליה תא ב × 400 g 10 דקות הצניפה תאים.
   4. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend צנפה תא קר כקרח מאגר A-ריכוז סופי של 2 × 10⁷ תאים למ"ל.
      הערה: כל השלבים הבאים צריך להתבצע ב 4 ° C או על קרח, כל מאגרי צריך להיות טרום מקורר.

3. בידוד חלבון cytosolic

1. תמצית חלבונים cytosolic על ידי דגירה עם digitonin דטרגנט.
   1. מייד לפני resuspension של תאים (שלב 3.1.3) להוסיף µL 10 מניות PMSF (100 מ מ), 10 µL של מעכבי פרוטאז (100 ×), µL 2 מניות SOV (500 מ מ) ו- µL 100 של digitonin מניות (250 µg/mL) כדי µL 878 מאגר A (ריכוזים הסופי הם 1 מ מ PMSF , 1 × מעכב פרוטאז, 1 מ"מ SOV, digitonin µg/mL 25; לכוון את עוצמת הקול הסופי לפי מספר התאים בשימוש). לשמור את הפתרון על הקרח עד בנוסף תא גלולה.
   2. Centrifuge התליה תא ב × 400 g 10 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
   3. Resuspend בגדר תא ב בופר A המכיל מעכבי ו digitonin (להכין בשלב 3.1.1)-ריכוז סופי של 2 × 10⁷ תאים למ"ל, פיפטה בעדינות כדי לשבור את הגושים.
   4. דגירה התליה תא על מסובב מעל קצה--4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   5. Centrifuge התליה תא ב × 400 g עבור 10 דקות לאסוף את תגובת שיקוע ומניחים אותו בתוך שפופרת צנטרפוגה נקי.
   6. Centrifuge את תגובת שיקוע שנאספו ב × 18,000 g למשך 20 דקות הצניפה פסולת הסלולר.
   7. להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה נקי.
   8. חזור על שלבים ו 3.1.5 3.1.6 עד אין גלולה מתקבל לאחר צנטריפוגה.
   9. לאסוף את תגובת שיקוע המכיל חלבונים cytosolic ואחסן אותו ב 4 ° C (תקופות קצרות) או-20 ° C (לטווח ארוך).
2. להסיר את עודף digitonin, חלבונים cytosolic על ידי צנטריפוגה.
   1. Resuspend בגדר תא digitonin-permeabilized (מתוך שלב 3.1.5) במאגר A-ריכוז סופי של 4 × 10⁶ תאים למ"ל, פיפטה בעדינות כדי לשבור את הגושים.
   2. Centrifuge התליה תא digitonin-permeabilized ב × 400 g 10 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.
      הערה: ניתן לבצע חוזרות שוטף במאגר A כדי להסיר עודפי מזהמים cytosolic.

4. תא המגון

1. דגירה התאים על הקרח במאגר פירוק B ואת lyse אותם באמצעים מכניים.
   1. מייד לפני resuspension של תאים (שלב 4.1.2) להוסיף µL 10 מניות PMSF (100 מ מ) µL 2 מניות SOV (500 מ מ) µL 988 פירוק מאגר B (ריכוזים הסופי הם 1 מ PMSF ו 1 מ"מ SOV; להתאים את עוצמת הקול הסופי כדי להכיל את מספר התאים להיות lysed) ולשמור על solu tion על הקרח עד בנוסף תא גלולה.
   2. Resuspend בגדר תא (מתוך שלב 3.2.2) תוך קר כקרח פירוק B בופר המכילה PMSF ו SOV (להכין בשלב 4.1.1)-ריכוז סופי של 4 × 10⁶ תאים למ"ל.
   3. דגירה התליה תא על קרח למשך 30 דקות.
   4. להעביר את המתלים תא מהמגן דאונס טרום מקורר (עם B ההדוקות כבעלי) על הקרח ולבצע עובר 40 עם איחדו מהמגן בתנועות איטיות, משיחות אפילו.
      הערה: לחלופין לנצל אמצעים אחרים של פירוק מכני תא כמפורט בסעיף הדיון.
   5. לאסוף את homogenate, להעביר אותו שפופרת צנטרפוגה נקי.
   6. לשטוף מהמגן איחדו את התחתית עם נפח קטן (1-2 מ ל) של פירוק מאגר B ולהוסיף אותו homogenate.
   7. Centrifuge את homogenate × 400 גרם (או את המהירות המינימלי הנדרש כדי הצניפה תאים רצופה) למשך 10 דקות.
   8. להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה נקי.
      הערה: אם גלולה משמעותי נותר חזור על שלבים 4.1.4 דרך 4.1.6 להגברת שברים כמו מפורט במקטע דיון. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה, homogenate השמורים ב 4 ° C לטווח קצר (24 שעות).

5. צנטריפוגה דיפרנציאלית

1. Centrifuge את homogenate בהגברת מהירויות להסרת פסולת הסלולר, המיטוכונדריה ולבודד ושברים ממברנה.
   1. Centrifuge את תגובת שיקוע (מתוך שלב 4.1.8) ב × 500 g עבור תגובת שיקוע העברת 10 דקות כדי שפופרת צנטרפוגה נקי, ולמחוק את כל גלולה.
   2. Centrifuge תגובת שיקוע (מתוך שלב 5.1.1) ב × 1000 גרם במשך 10 דקות להעביר את תגובת שיקוע על שפופרת צנטרפוגה נקי, ולמחוק את כל גלולה.
   3. Centrifuge את תגובת שיקוע (מתוך שלב 5.1.2) ב × 2,000 g עבור 10 דקות להעביר תגובת שיקוע על שפופרת צנטרפוגה נקי, ולמחוק את כל גלולה.
   4. Centrifuge את תגובת שיקוע (מתוך שלב 5.1.3) ב × 4,000 גרם במשך 15 דקות העברה תגובת שיקוע על שפופרת צנטרפוגה נקי, לשמור על גלולה המכילה המיטוכונדריה.
   5. Resuspend בגדר המיטוכונדריה באמצעי אחסון קטן (0.5\u20121 מ"ל) פירוק מאגר B.
   6. Centrifuge בגדר תנאי ב × 4,000 גרם במשך 15 דקות להסיר את תגובת שיקוע ואת resuspend מיטוכונדריאלי צניפה בהיקף הסופי הרצוי של מאגר מדגם (למשל, 250 עד 500 µL, בהתאם לגודל בגדר והרצוי ריכוז).
   7. צנטריפוגה תגובת שיקוע (מתוך שלב 5.1.4) ב × 4,000 גרם במשך 15 דקות להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה נקי. חזור על שלב זה עד אין גלולה מתקבל לאחר צנטריפוגה.
   8. לסובב את תגובת שיקוע ב × 18,000 g עבור 3 שעות.
   9. הסר את תגובת שיקוע, ולשמור את גלולה המכילה חלבונים ממברנה. Resuspend בגדר ממברנה באמצעי אחסון קטן (0.5-1 מ ל) של פירוק מאגר B.
   10. Centrifuge בגדר תנאי ב × 18,000 g עבור 1 h.
   11. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר ממברנה באמצעי הסופי הרצוי דוגמת המאגר (250 עד 500 µL, בהתאם לגודל של גלולה, הריכוז הרצוי).
2. Sonicate כדורי מדגם 3 s באמבט קרח בקביעה כוח של 5 (50% של 125 כוח מרבי W ב-20 קילו-הרץ, ראה טבלה של החומרים).
3. אחסן את הדגימות ב 4 ° C (תקופות קצרות) או-20 ° C (לטווח ארוך).
4. לבחון את הדגימות טוהר של fractionation על ידי ביצוע של תספיג ניצול נוגדנים נגד סמני חלבונים נמצאו בתאים ציטופלזמה, המיטוכונדריה, הממברנה של התא (עיין בסעיף התוצאות נציג).

תוצאות

Fractionation מוצלחת של U937 מובחן⁸ תאים גדל ההשעיה הושג באמצעות פרוטוקול שתוארו לעיל, מאויר באיור1. הדגימות שהושג עם שיטה זו היו נענשים המערבי סופג⁹ ניצול שיטת העברה רטוב כדי קרום פלואוריד (PVDF) polyvinylidene. הקרום נבדקה לאחר מכן עם נוגדנים נגד ...

Discussion

הפיתוח של פרוטוקול זה עלתה מחוסר היכולת להפריד מיטוכונדריאלי ודוגמאות ממברנה, באמצעות ערכות זמינים מסחרית, לניתוח של חלבון לוקליזציה במהלך necroptosis¹⁴. המגבלות העיקרי של ערכות premade הם היכולת שלהם להתאים את הצרכים של חוקרים בודדים, שלהם עלות לדוגמה, מספר מצומצם של דוגמאות מסוגל לה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digitonin	TCI Chemicals	D0540	For Cytoplasm Extraction
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125	For Lysis buffer B
Dounce homogenizer	VWR	22877-282	For Homogenization
end-over-end rotator	Barnstead	N/A	For Cytoplasm Extraction
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Alfa Aesar	J61721	For Lysis buffer B
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E7889	For Lysis buffer B
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118	For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000
HEPES	VWR	J848	For Lysis buffers A and B
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	For Lysis buffer B
MgCl2	Alfa Aesar	12315	For Lysis buffer B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565	For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	For Lysis buffer A
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	VWR	M145	For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer
probe sonicator	Qsonica	Q125-110	For Final Samples
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML	For Cytoplasm Extraction
refrigerated centrifuge	Beckman-Coulter	N/A
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	VWR	227	For Sample buffer
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma-Aldrich	450243	For Lysis buffers A and B
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	For Lysis buffer B
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	788	For Sample buffer
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661	For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000