Fracionamento celular de células U937, na ausência de centrifugação de alta velocidade

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar a membrana plasmática, citoplasma e mitocôndrias de células U937 sem o uso de centrifugação de alta velocidade. Esta técnica pode ser usada para purificar as fracções subcelulares para posterior exame de localização de proteínas através de immunoblotting.

Resumo

Neste protocolo, detalhamos um método para obter fracções subcelulares de células U937 sem o uso de ultracentrifugação ou detergentes indiscriminados. Este método utiliza buffers de hipotônicas, digitonin, Lise mecânica e centrifugação diferencial para isolar o citoplasma, mitocôndrias e membrana plasmática. O processo pode ser dimensionado para acomodar as necessidades dos investigadores, é barato e simples. Este método permitirá que os investigadores determinar a localização da proteína nas células sem centrifugadores especializados e sem o uso de kits comerciais, ambos dos quais podem ser proibitivamente caros. Com sucesso usamos este método para separar citosólica, membrana plasmática e proteínas mitocondriais em linhagem celular de monócitos humanos U937.

Introdução

Identificação fiável de localização da proteína é muitas vezes necessária, ao examinar as vias moleculares em células eucarióticas. Métodos para obter fracções subcelulares são utilizados pelos pesquisadores para examinar mais de perto os componentes celulares de interesse.

A maioria dos métodos existentes de fracionamento celular geralmente caem em duas categorias amplas, baseado em detergente^1,2 e baseada em ultracentrifugação^3,4,5, que pode ser diferenciadas por velocidade, precisão e custo. Protocolos baseados em detergente contam com o uso de buffers com crescente força detergente para solubilizar componentes distintos da célula. Este é um método rápido e conveniente para o processamento de amostras e pode ser rentável se o número e o tamanho das amostras são pequenas. Detergente com base em kits podem ser adquiridos para isolar citoplasmática membrana/organela (fração mista) e frações nucleares de células. No entanto, vários inconvenientes associados a estes kits limitam sua utilidade para pesquisadores. Eles são projetados para isolar facilmente um ou dois componentes da célula, mas são incapazes de isolar todas as frações de uma amostra simultaneamente. O uso de detergentes significa que a membrana plasmática e organelas de membrana-incluido vão ser igualmente solubilizadas e, portanto, incapaz de ser separados uns dos outros. Uma complicação adicional decorre os componentes proprietários nesses kits que impede que os investigadores alterando as condições para aplicações específicas. Por último, eles são limitados em número de usos e podem ser proibitivamente caros para experiências em maior escala. Kits de non-detergente com base existem para o isolamento de mitocôndrias, no entanto, eles não são projetados para isolar a membrana plasmática e o rendimento da amostra é significativamente menor do que a da centrifugação densidade com base em protocolos de isolamento^6,7 .

Métodos que utilizam a ultracentrifugação para obter fracções são mais tempo consumindo, mas muitas vezes resultam em frações mais puras do que jogos baseados em detergente. Para isolar as membranas do plasma de células sem primeiro solubilizing-los (resultando em contaminação com organelas de membrana) os obriga a ser lysed por um método não-detergente seguido de separação de componentes celulares através do diferencial centrifugação — com isolamento de membrana plasmática que exigem velocidades de 100.000 × g para realizar. Em muitos casos, centrifugação diferencial deve ser seguida por isopícnica centrifugação de densidade gradiente para ainda mais a separação das frações celulares ou remoção de contaminantes. Enquanto esses métodos são minuciosos e modificável, desvantagens incluem a necessidade de um se para separação das frações e ainda mais purificação através de densidade gradiente centrifugação, consumo de tempo e custo. A maioria das centrífugas de alta velocidade são a um custo que é proibitivo dos investigadores individuais e são frequentemente partilhados, núcleo equipamentos em instituições acadêmicas. Assim, a disponibilidade se torna-se proibitivo nessas situações.

Neste protocolo de fracionamento, demonstramos o isolamento de frações subcelulares, sem o uso de detergentes de solubilizing e sem centrifugação de alta velocidade. Este método permitirá que pesquisadores isolar a membrana plasmática, mitocôndrias e componentes citoplasmáticos de uma célula eucariótica com contaminação mínima entre frações.

Protocolo

1. preparar reagentes e Buffers

Nota: Consulte a tabela 1.

1. Prepare soluções de tampão A, B do lysis, amortecedor da amostra e digitonin.
   1. Prepare A reserva, acrescentando 8,77 g de NaCl e 50ml de HEPES (1 M, pH 7,4) a 900 mL de água desionizada, ajustar volume final para 1 L com água desionizada.
      Nota: Concentrações finais são 150 mM NaCl e 50 mM HEPES.
   2. Preparar o tampão de Lise B adicionando 20 mL de HEPES (1 M, pH 7,4), 0,75 g de KCl, 0,19 g de MgCl₂, 2ml de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA 0,5 M), 2 mL do glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-ácido etilenodiaminotetracético (0,5 M EGTA) , 38,26 g de manitol e 23,96 g de sacarose a 900 mL de água desionizada, ajustar volume final para 1 L com água desionizada.
      Nota: Concentrações finais são 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl₂, EDTA 1 mM, 1 mM EGTA, manitol 210mm e sacarose de 70 mM.
   3. Prepare o amortecedor da amostra adicionando 0,01 g de sulfato dodecyl de sódio (SDS) para 10 mL de tampão salino tris (TBS) para uma concentração final de 0,1% SDS.
   4. Prepare uma solução stock de digitonin adicionando 25 mg de digitonin para 100 mL de água desionizada (concentração final é de 250 µ g/mL).
   5. Armazene todas as soluções-tampão a 4 ° C e digitonin a-20 ° C até o início do experimento.
2. Prepare soluções novas de inibidores de protease e fosfatase para ser adicionado a soluções tampão antes da adição de células.
   1. Preparar uma solução de fluoreto de phenylmethanesulfonyl (PMSF) adicionando 17,4 mg de PMSF a 1 mL de etanol a 100% (concentração final é 100 mM).
      Atenção: Usar equipamento de protecção e de exercício cuidado ao manusear PMSF. PMSF é perigoso se ingerido e pouco perigoso em caso de contacto com a pele (irritante), contato com os olhos (irritante) ou inalação; é corrosivo para os olhos e pele.
   2. Preparar um coquetel de inibidor de protease disponíveis comercialmente (100 ×) de acordo com as instruções do fabricante (ver a Tabela de materiais).
   3. Prepare uma solução stock de ortovanadato de sódio (SOV) adicionando 92 mg de SOV para 1 mL de água desionizada (concentração final é de 500 mM).
      Atenção: Utilize equipamento de protecção adequado e tenha cuidado ao manusear. SOV é perigoso em caso de contato com os olhos (irritante), ingestão ou inalação. Excesso de exposição severo pode resultar em morte.

2. PBS lavagem

1. Concentre-se e lavam-se células em tampão fosfato salino (PBS) antes do fracionamento.
   1. Centrifugar a suspensão de células em uma velocidade adequada para criar uma pelota. Por exemplo, centrifugar uma suspensão de células U937 a 400 × g por 10 min.
   2. Remover o sobrenadante, resuspenda o pellet celular em PBS de temperatura em uma concentração final de 4 × 10⁶ células/mL e pipeta suavemente para quebrar aglomerados.
   3. Centrifugar a suspensão celular de 400 × g por 10 min para células de Pelotas.
   4. Remover o sobrenadante e ressuspender células num tampão de gelo frio A uma concentração final de 2 × 10⁷ células/mL.
      Nota: Todas as etapas subsequentes devem ser efectuadas em 4 ° C ou em gelo e todos os buffers devem ser previamente refrigeradas.

3. isolamento da proteína citosólica

1. Extrair proteínas cytosolic pela incubação com o detergente digitonin.
   1. Imediatamente antes da ressuspensão das células (passo 3.1.3), adicionar 10 µ l de estoque PMSF (100 mM), 10 µ l de inibidor de protease (× 100), 2 µ l de estoque SOV (500 mM) e 100 µ l de digitonin ações (250 µ g/mL) a 878 µ l de tampão A (concentrações finais são 1 mM PMSF , 1 × inibidor da protease, 1mm SOV e 25 µ g/mL digitonin; ajuste o volume final conforme o número de células sendo usado). Manter a solução no gelo até adição de centrifugado.
   2. Centrifugar a suspensão celular de 400 × g por 10 min e retirar o sobrenadante.
   3. Resuspenda o pellet de células em solução tampão A contendo inibidores e digitonin (preparado na etapa 3.1.1) em uma concentração final de 2 × 10⁷ células/mL, pipeta suavemente para quebrar aglomerados.
   4. Incube a suspensão de células em um rotador completa sobre a 4 ° C por 20 min.
   5. Centrifugar a suspensão celular de 400 × g por 10 min. recolher o sobrenadante e colocá-lo num tubo de centrífuga limpo.
   6. Centrifugue o sobrenadante coletado a 18.000 × g por 20 min para restos celulares de Pelotas.
   7. Transferi o sobrenadante para um tubo de centrifugação limpo.
   8. Repita as etapas 3.1.5 e 3.1.6 até à não obtenção de nenhum sedimento após centrifugação.
   9. Recolher o sobrenadante contendo as proteínas cytosolic e armazená-lo em 4 ° C (curto prazo) ou a-20 ° C (longo prazo).
2. Remova o excesso digitonin e proteínas cytosolic por centrifugação.
   1. Resuspenda o pellet de células digitonin-permeabilizado (da etapa 3.1.5) em tampão A em uma concentração final de 4 × 10⁶ células/mL e pipeta suavemente para quebrar aglomerados.
   2. Centrifugar a suspensão de células digitonin-permeabilizado 400 × g por 10 min e retirar o sobrenadante.
      Nota: Lavagens repetidas em tampão A podem ser realizadas para remover contaminantes citosólico em excesso.

4. célula homogeneização

1. Incubar as células no gelo em tampão de Lise B e lyse-los por meios mecânicos.
   1. Imediatamente antes da ressuspensão das células (etapa 4.1.2), adicionar 10 µ l de estoque PMSF (100 mM) e 2 µ l de estoque SOV (500 mM) para 988 µ l de tampão de Lise B (concentrações finais são 1mm PMSF e 1mm SOV; ajustar volume final para acomodar o número de células sendo lysed) e manter a solu ção no gelo até adição de centrifugado.
   2. Ressuspender as células (da etapa 3.2.2) em solução-tampão B lise fria como o gelo contendo PMSF e SOV (preparado na etapa 4.1.1) em uma concentração final de 4 × 10⁶ células/mL.
   3. Incube a suspensão de células no gelo por 30 min.
   4. Transferir a suspensão de células para um homogenizador homogenizacao pre-refrigerado (com um pilão de B apertadas) no gelo e executar 40 passes com o pilão homogenizador devagar, usando até mesmo traços.
      Nota: Em alternativa utilize outros meios de lise celular mecânica conforme detalhado na seção de discussão.
   5. Recolher o homogeneizado e transferi-lo para um tubo de centrifugação limpo.
   6. Lave o pilão homogenizador e tubo com um pequeno volume (1 a 2 mL) de tampão de Lise B e adicioná-lo para o homogeneizado.
   7. Centrifugue o homogeneizado em 400 × g (ou a velocidade mínima necessária para células ininterrupta de Pelotas) por 10 min.
   8. Transferi o sobrenadante para um tubo de centrifugação limpo.
      Nota: Se uma pelota de significativa permanece 4.1.4 através de 4.1.6 para aumentar o rendimento das frações como repita os passos detalhados na seção de discussão. O protocolo pode ser pausado aqui, e o homogenate armazenadas a 4 ° C para curto prazo (24 h).

5. diferencial centrifugação

1. Centrifugue o homogeneizado em aumentar a velocidade para remover restos celulares, as mitocôndrias isoladas e fracções de membrana.
   1. Centrifugue o sobrenadante (da etapa 4.1.8) a 500 × g por 10 min. transferência de sobrenadante para um tubo limpo e descartar qualquer pelota.
   2. Sobrenadante (da etapa 5.1.1) a 1.000 × g por 10 min. transferência de centrifugação o sobrenadante para um tubo de centrifuga limpo e descartar qualquer pelota.
   3. Centrifugue o sobrenadante (da etapa 5.1.2) a 2.000 × g por 10 min. transferência o sobrenadante para um tubo limpo e descartar qualquer pelota.
   4. Centrifugue o sobrenadante (da etapa 5.1.3) a 4.000 × g durante 15 min. transferência de sobrenadante para um tubo de centrifugação limpo, manter pelota contendo mitocôndria.
   5. Resuspenda o pellet de mitocôndrias em um pequeno volume (0.5\u20121 mL) de tampão de Lise B.
   6. Centrifugue o sedimento suspenso a 4.000 × g durante 15 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o mitocondrial pelota em volume final desejado de tampão de amostra (por exemplo, 250 a 500 µ l, dependendo do tamanho da pelota e desejado concentração).
   7. Centrifugue o sobrenadante (da etapa 5.1.4) a 4.000 × g 15 min. Transfira o sobrenadante para um tubo de centrifugação limpo. Repita este passo até que nenhum sedimento é obtido após centrifugação.
   8. Gire o sobrenadante a 18.000 × g durante 3 h.
   9. Remover o sobrenadante e manter o sedimento contendo proteínas da membrana. Resuspenda o pellet de membrana em um pequeno volume (0,5 – 1 mL) do lysis buffer de B.
   10. Centrifugue o sedimento suspenso a 18.000 × g por 1h.
   11. Remover o sobrenadante e ressuspender a membrana do volume final desejado de tampão de amostra (250 a 500 µ l, dependendo do tamanho da pelota e concentração desejada).
2. Proceda à sonicação as pelotas de amostra para 3 s em um banho de gelo em uma configuração de energia de 5 (50% da potência máxima de 125 W a 20 kHz, consulte A tabela de materiais).
3. Armazene as amostras em 4 ° C (curto prazo) ou a-20 ° C (longo prazo).
4. Examinar as amostras para a pureza de fracionamento, realizando um western blot utilizando anticorpos contra marcadores de proteína encontradas nos compartimentos citoplasma, mitocôndrias e membrana da célula (consulte a seção resultados representativos).

Resultados

Bem sucedido fraccionamento de células indiferenciadas de⁸ U937 crescido em suspensão foi realizado utilizando o protocolo detalhado acima e ilustrado na Figura 1. As amostras obtidas com este método foram submetidas a mancha ocidental⁹ utilizando um método de transferência molhado para uma membrana (PVDF) de fluoreto de polivinilideno. A membrana foi posteriormente analisada com anticorpos contra citoplasm...

Discussão

O desenvolvimento do presente protocolo surgiu de uma incapacidade de se separar mitocondrial e amostras de membrana, usando kits comercialmente disponíveis, para análise da localização da proteína durante necroptosis¹⁴. As limitações primárias de kits do premade são sua incapacidade de ser adaptado às necessidades dos investigadores individuais, o custo por amostra e número limitado de amostras capazes de serem processados. O método apresentado aqui pode ser realizado sem a utilizaç?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digitonin	TCI Chemicals	D0540	For Cytoplasm Extraction
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125	For Lysis buffer B
Dounce homogenizer	VWR	22877-282	For Homogenization
end-over-end rotator	Barnstead	N/A	For Cytoplasm Extraction
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Alfa Aesar	J61721	For Lysis buffer B
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E7889	For Lysis buffer B
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118	For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000
HEPES	VWR	J848	For Lysis buffers A and B
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	For Lysis buffer B
MgCl2	Alfa Aesar	12315	For Lysis buffer B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565	For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	For Lysis buffer A
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	VWR	M145	For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer
probe sonicator	Qsonica	Q125-110	For Final Samples
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML	For Cytoplasm Extraction
refrigerated centrifuge	Beckman-Coulter	N/A
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	VWR	227	For Sample buffer
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma-Aldrich	450243	For Lysis buffers A and B
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	For Lysis buffer B
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	788	For Sample buffer
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661	For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000