Фракционирование клеток U937 клеток в отсутствие высокоскоростной центрифуги

Резюме

Здесь мы представляем протокол изолировать плазматической мембраны, цитоплазмы и митохондрии клеток U937 без использования высокоскоростной центрифуги. Этот метод может использоваться для очистки субцеллюлярные фракций для последующего изучения белков локализации через immunoblotting.

Аннотация

В этом протоколе мы подробно метод для получения субцеллюлярные фракций U937 клеток без использования ultracentrifugation или неизбирательного моющих средств. Этот метод использует гипотонический буферов, digitonin, механический лизис и дифференциального центрифугирования изолировать цитоплазмы, митохондрии и плазматической мембраны. Этот процесс может масштабироваться для удовлетворения потребностей исследователей, является недорогим и простым. Этот метод позволит исследователям для определения локализации белка в клетках без специализированных центрифуги и без использования коммерческих комплекты, оба из которых могут быть дорогими. Мы успешно использовали этот метод, чтобы отделить цитозольной, плазматической мембраны и митохондриальных протеинов в линии клеток человека Моноцит U937.

Введение

Надежная идентификация белка локализации часто бывает необходимо при рассмотрении молекулярные пути в эукариотических клеток. Методы для получения субцеллюлярные фракции используются исследователями более внимательно изучить клеточных компонентов, представляющих интерес.

Большинство существующих методов фракционировки клетки, как правило, делятся на две широкие категории, на основе моющих средств^1,2 и на основе ultracentrifugation^3,4,5, который может быть различаются по скорости, точности и стоимости. Стиральный порошок на основе протоколов полагаются на использование буферов с увеличения моющая сила чтобы солюбилизировать последнего отдельных компонентов клетки. Это быстрый и удобный метод для обработки образцов и может быть экономически эффективным, если количество и размер образцов малы. Комплекты на основе моющих средств могут быть приобретены изолировать цитоплазмы, мембраны/органелл (смешанная дробь) и ядерных фракций из клеток. Однако некоторые недостатки, связанные с эти комплекты ограничивает их полезность для исследователей. Они предназначены для легко изолировать одного или двух компонентов клетки, но способны одновременно изолируя всех дробей от образца. Использование моющих средств означает, что будет одинаково солюбилизирован плазматической мембраны и мембраны закрытых органелл и, следовательно, не могут быть отделены друг от друга. Дополнительное усложнение возникает от несвободных компонентов в эти комплекты, препятствующая исследователей от изменения условий для конкретных приложений. Наконец они ограничены в число случаев использования и могут быть дорогими для больших масштабах экспериментов. Non-моющее средство на основе наборы для изоляции митохондрий существуют, однако, они не предназначены для изоляции плазматической мембраны и образец урожайность является значительно меньше, чем от плотности центрифугирования изоляции протоколы^6,7 .

Методы, которые используют ultracentrifugation для получения фракций больше времени, но часто результат в чище фракций, чем наборы на основе моющих средств. Чтобы изолировать мембраны плазмы от клеток без первого растворяющие их (в результате загрязнения с Органеллы мембраны) требует от них лизированы методом без моющих средств, следуют разъединения клетчатых компонентов через дифференциальный центрифугирование — с изоляцией плазматической мембраны, требующие скорости 100 000 × g для выполнения. Во многих случаях дифференциального центрифугирования должны сопровождаться isopycnic плотность градиентного центрифугирования для дальнейшего разделения сотовой фракций или удаления загрязняющих веществ. Хотя эти методы являются тщательное и модифицируемый, недостатки включают стоимость, время потребления и потребность ультрацентрифуга для разделения фракций и дальнейшей очистки через плотность градиентного центрифугирования. Большинство Высокоскоростные центрифуги, ценой, что непомерно высока для отдельных следователей и часто разделяют, стержневое оборудование в академических учреждениях. Таким образом наличие ультрацентрифуга становится непомерно в таких ситуациях.

В этом протоколе фракционирование мы демонстрируем изоляции субцеллюлярные фракций без использования растворяющие моющие средства и высокая скорость центрифугирования. Этот метод позволит исследователям изолировать плазматической мембраны, митохондрии и цитоплазматических компонентов эукариотических клеток с минимальным загрязнением между фракциями.

протокол

1. Подготовьте буферов и реагенты

Примечание: См. таблицу 1.

1. Подготовка решений буфер A, литического буфера B, буфер образца и digitonin.
   1. Подготовка буфера A, добавив 8.77 г NaCl и 50 мл HEPES (1 М, рН 7,4) до 900 мл деионизированной воды, настроить конечный объем до 1 Л деионизированной водой.
      Примечание: Окончательный концентрации являются 150 мм NaCl и 50 мм HEPES.
   2. Подготовка буфера lysis B, добавив 20 мл HEPES (1 М, рН 7,4), 0,75 г KCl, 0,19 g MgCl₂, 2 мл Этилендиаминтетрауксусная кислота (0,5 М ЭДТА), 2 мл этиленгликоля bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic кислота (0,5 М EGTA) , 38.26 g маннит и 23.96 г сахарозы в 900 мл деионизированной воды, настроить конечный объем до 1 Л деионизированной водой.
      Примечание: Окончательный концентрации являются 20 мм HEPES, 10 мм KCl, 2 мм MgCl₂, 1 мм ЭДТА, 1 мм EGTA, маннитол 210 мм и 70 мм сахарозы.
   3. Подготовьте буфер образца, добавляя 0.01 g додецилового сульфата натрия (SDS) до 10 мл трис амортизированное saline (TBS) для окончательного концентрации 0,1% SDS.
   4. Подготовьте Стоковый раствор digitonin путем добавления 25 мг digitonin 100 мл деонизированной воды (конечная концентрация составляет 250 мкг/мл).
   5. Храните все буферных растворов в 4 ° C и digitonin при-20 ° C до начала эксперимента.
2. Подготовьте свежие решения ингибиторов протеаз и фосфатазы добавляемый к буферных растворов перед добавлением к клеткам.
   1. Подготовить раствор phenylmethanesulfonyl фтора (PMSF) путем добавления 17,4 мг PMSF 1 мл 100% этанола (конечная концентрация составляет 100 мм).
      Предупреждение: Носить соответствующего защитного оборудования и проявлять осторожность при обработке PMSF. PMSF опасными, если его проглотить и слегка опасных в случае контакта с кожей (раздражающие), контакт глаз (раздражающие) или ингаляционно; коррозионное воздействие на глаза и кожу.
   2. Приготовить коктейль ингибитор протеазы коммерчески доступных (100 ×) согласно инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
   3. Подготовьте Стоковый раствор Ортованадат натрия (SOV) путем добавления 92 мг SOV 1 мл деонизированной воды (конечная концентрация составляет 500 мм).
      Предупреждение: Использовать соответствующие средства индивидуальной защиты и осторожность при обработке. SOV опасных в случае контакта глаз (раздражающие), при приеме внутрь или ингаляции. Тяжелые чрезмерное воздействие может привести к смерти.

2. PBS мыть

1. Концентрат и вымыть клетки в фосфат амортизированное saline (PBS) до фракционирования.
   1. Суспензию клеток в центрифуге при соответствующей скорости для создания гранул. Например центрифуга подвеска U937 клеток на 400 × g за 10 мин.
   2. Удалить супернатант, Ресуспензируйте Пелле клеток в комнатной температуре PBS в конечной концентрации 4 × 10⁶ клеток/мл и пипетки нежно порвать пряди.
   3. Центрифуга суспензию клеток на 400 × g за 10 мин до Пелле клетки.
   4. Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле ячейки в буфер A ледяной в конечной концентрации 2 × 10⁷ кл/мл.
      Примечание: Все последующие шаги должны осуществляться при Температуре 4 ° C или на льду и все буферы должны быть предварительно охлажденным.

3. цитозольной белка изоляции

1. Извлечь цитозольной белки, инкубация с моющим средством digitonin.
   1. Непосредственно перед ресуспендирования клеток (шаг 3.1.3) мкл 10 акций PMSF (100 мм), 10 мкл ингибитор протеазы (100 ×), 2 мкл запасов SOV (500 мм) и 100 мкл запасов digitonin (250 мкг/мл) в 878 мкл буфера A (окончательный концентрации являются 1 мм PMSF , 1 × ингибитор протеазы, 1 мм SOV и 25 мкг/мл digitonin; громкость окончательный согласно количество ячеек используются). Держите решение на льду до дополнение к ячейке Пелле.
   2. Центрифуга суспензию клеток на 400 × g 10 мин и удалить супернатант.
   3. Ресуспензируйте Пелле ячейки в буфер A решения, содержащие ингибиторы и digitonin (подготовленных на шаге 3.1.1) в конечной концентрации 2 × 10⁷ кл/мл, Пипетка нежно порвать пряди.
   4. Инкубируйте суспензию клеток на конец над конец ротатор на 4 ° C в течение 20 мин.
   5. Центрифуга суспензию клеток на 400 × g для 10 минут собрать супернатант и поместите его в чистый пластиковых пробирок.
   6. Центрифуга собранные супернатант в 18 000 × g за 20 мин до Пелле сотовой мусора.
   7. Передать супернатант чистых пластиковых пробирок.
   8. Повторите шаги 3.1.5 и 3.1.6, до тех пор, пока не Пелле получается после центрифугирования.
   9. Собирать супернатанта, содержащий цитозольной белков и хранить его на 4 ° C (краткосрочные) или от-20 ° C (долгосрочные).
2. Удалите излишки digitonin и цитозольной белки центрифугированием.
   1. Ресуспензируйте Пелле digitonin-permeabilized клеток (от шага 3.1.5) в буфере A в конечной концентрации 4 × 10⁶ клеток/мл и пипетки нежно порвать пряди.
   2. Центрифуга суспензию клеток digitonin-permeabilized на 400 × g 10 мин и удалить супернатант.
      Примечание: Неоднократных стирок в буфере A может быть проведена для удаления избыточных цитозольной загрязнений.

4. клетки гомогенизации

1. Инкубировать клетки на льду литического буфера B и лизируют их механическими средствами.
   1. Непосредственно перед ресуспендирования клеток (шаг 4.1.2) добавить 10 мкл запасов PMSF (100 мм) и 2 мкл запасов SOV (500 мм) 988 мкл буфера lysis B (окончательный концентрации 1 мм PMSF и 1 мм SOV; окончательного громкость для размещения количество клеток лизированы) и держать Солу Тион на льду до дополнение к ячейке Пелле.
   2. Ресуспензируйте ячейки Пелле (из шага 3.2.2) в ледяной лизис буфера B раствор, содержащий PMSF и SOV (подготовленных на шаге 4.1.1) в конечной концентрации 4 × 10⁶ клеток/мл.
   3. Инкубируйте суспензию клеток на льду за 30 мин.
   4. Передавать предварительно охлажденные Dounce гомогенизатора (с пестиком B облегающие) суспензии клеток на льду и 40 проходит с пестиком гомогенизатор, медленно, используя даже штрихов.
      Примечание: Можно также используйте другие средства лизис механические клетки как описано в разделе "обсуждение".
   5. Собирать огневки и перенести его на чистых пластиковых пробирок.
   6. Вымойте гомогенизатор пестик и трубки с небольшой объем (1-2 мл) буфера lysis B и добавить его в огневки.
   7. Центрифуга огневки на 400 × g (или минимальная скорость для пеллет непрерывной клетки) 10 мин.
   8. Передать супернатант чистых пластиковых пробирок.
      Примечание: Если значительный Пелле остается повторите шаги 4.1.4 через 4.1.6 увеличить выход фракций как подробно в разделе обсуждения. Протокол может быть приостановлена здесь, и огневки температуре 4 ° C на короткий срок (24 h).

5. дифференциального центрифугирования

1. Центрифуга огневки на повышение скорости для удаления сотовой мусора, изолировать митохондрии и мембраны фракций.
   1. Центрифуга супернатант (из шага 4.1.8) на 500 × g для передачи супернатант 10 мин для чистых пластиковых пробирок и отменить любые Пелле.
   2. Центрифуга супернатант (из шага 5.1.1) на 1000 × g 10 мин передачи супернатант в чистых пластиковых пробирок и отменить любые Пелле.
   3. Центрифуга супернатант (из шага 5.1.2) на 2000 × g 10 мин передачи супернатант в чистых пластиковых пробирок и отменить любые Пелле.
   4. Центрифуга супернатант (из шага 5.1.3) на 4000 × g для передачи супернатант 15 мин для чистых пластиковых пробирок, держать гранулы, содержащие митохондрий.
   5. Ресуспензируйте Пелле митохондрий в небольшом объеме (0.5\u20121 мл) буфера lysis б.
   6. Центрифуги подвесные гранул на 4000 × g 15 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте митохондриальной Пелле в нужный конечный объем буфера выборки (например, 250 до 500 мкл, в зависимости от размера гранул и желаемого концентрация).
   7. Центрифуга супернатант (от шага 5.1.4) на 4000 × g 15 мин передачи супернатант чистых пластиковых пробирок. Повторите этот шаг до тех пор, пока не Пелле получается после центрифугирования.
   8. Спиновые супернатант в 18 000 × г за 3 ч.
   9. Удалить супернатант и держать гранулы, содержащие мембранных белков. Ресуспензируйте Пелле мембраны в небольшом объеме (0,5 – 1 мл) из лизис буфера б.
   10. Центрифуги подвесные гранул на 18 000 × г за 1 ч.
   11. Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле мембраны в нужный конечный объем буфера выборки (250-500 мкл, в зависимости от размера гранул и желаемой концентрации).
2. Sonicate образец гранулы для 3 s в ледяной ванне при мощности 5 (50% 125 Вт Максимальная мощность на 20 кГц, см. Таблицу материалы).
3. Храните образцы на 4 ° C (краткосрочные) или от-20 ° C (долгосрочные).
4. Проверьте образцы для чистоты фракционирования, выполняя Западная помарка, используя антитела против белков маркеры в цитоплазме, митохондрии и мембраны отсеков ячейки (см. раздел представительных результатов).

Результаты

Успешное фракционирование недифференцированных клеток U937⁸ , выращенных в подвеска была выполнена с использованием протокола подробно изложенных выше и показан на рисунке 1. Образцы, полученные с помощью этого метода были подвергнуты запа...

Обсуждение

В разработке этого протокола, обусловленные неспособность отделить митохондриальных и мембраны образцов, используя коммерчески доступные наборы для анализа белка локализации во время necroptosis¹⁴. Основная ограничения готовые комплекты являются их неспособность быть адапти...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digitonin	TCI Chemicals	D0540	For Cytoplasm Extraction
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125	For Lysis buffer B
Dounce homogenizer	VWR	22877-282	For Homogenization
end-over-end rotator	Barnstead	N/A	For Cytoplasm Extraction
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Alfa Aesar	J61721	For Lysis buffer B
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E7889	For Lysis buffer B
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118	For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000
HEPES	VWR	J848	For Lysis buffers A and B
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	For Lysis buffer B
MgCl2	Alfa Aesar	12315	For Lysis buffer B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565	For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	For Lysis buffer A
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	VWR	M145	For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer
probe sonicator	Qsonica	Q125-110	For Final Samples
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML	For Cytoplasm Extraction
refrigerated centrifuge	Beckman-Coulter	N/A
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	VWR	227	For Sample buffer
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma-Aldrich	450243	For Lysis buffers A and B
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	For Lysis buffer B
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	788	For Sample buffer
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661	For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000