高速遠心分離のない状態で U937 細胞のセル分別

要約

ここでは、細胞膜、細胞質、高速遠心分離を使用せず U937 細胞のミトコンドリアを分離するためのプロトコルを提案する.この手法は、蛋白質のローカリゼーションを介して免疫ブロットの後続受験内分を浄化するために使用できます。

要約

このプロトコル細胞遠心や無差別な洗剤を使用せず U937 細胞画分を取得する方法を詳しく説明します。このメソッドは、細胞質、ミトコンドリア、細胞膜を分離する差動遠心分離機械換散、ジギトニン低張性バッファーを利用します。プロセスは、研究者のニーズに対応することができます、安価で簡単です。このメソッドは、セル特殊な遠心分離機とどちらが極端に高くなることができる市販のキットの使用なしで蛋白質のローカリゼーションを決定する研究者になります。このゾル性細胞質の分離方法、細胞膜、ミトコンドリア蛋白質は、正常にひと単球細胞 u937 で利用させていただきました。

概要

蛋白質のローカリゼーションの確実な同定は、真核細胞の分子経路を調べてみる必要があります。内分を取得する方法は、興味の細胞成分を調べる研究者によって活用されます。

既存のセル分別方法の大半は一般に洗剤ベース^1,2および遠心ベース^3,4、5、することができます 2 つの広範なカテゴリに分類します。スピード ・精度・ コストによって区別されます。洗剤ベース プロトコルはセルの異なるコンポーネントを可溶化する洗剤の高強度化をバッファーの使用に頼る。これはサンプルを処理するための迅速かつ便利な方法で、数とサンプルのサイズが小さい場合は費用対効果にすることができます。細胞質膜/オルガネラ (混合割合)、細胞から核分画を分離するため洗剤ベース キットを購入できます。しかし、これらのキットに関連付けられているいくつかの欠点は、研究者への有用性を制限します。彼らは、簡単にセルの 1 つまたは 2 つのコンポーネントを分離するために設計されていますが、同時にサンプルからすべての画分を分離することができません。洗剤の使用を意味する血しょう膜、膜で囲まれた細胞内小器官が均等に溶こと、したがって、お互いから分離することができません。その他の合併症は、これらのキットは研究者が特定のアプリケーションのための条件を変更するを防止する独自のコンポーネントから発生します。最後に、彼らは、使用回数に制限が、非常に大きい実大施工実験高価かもしれません。非洗剤ベース キットは、ミトコンドリアの分離、膜を分離する設計されていませんし、サンプルの利回りは大幅密度遠心分離からのそれより小さいベース分離のプロトコル^6,7.

分画遠心を利用する方法はより時間がかかるが、しばしば洗剤ベース キットよりも純粋な分数の結果。最初可 (膜小器官による汚染の結果) それらのない細胞から膜を分離するには、必要があります細胞コンポーネントを介して差動の分離に続いて非洗剤法による分離遠心分離、膜分離を達成する 100,000 × gの速度を必要とします。多くの場合、差動遠心分離細胞一部分または汚染物質の除去のさらに分離のための密度密度勾配遠心による従わなければなりません。これらのメソッドは、徹底的に、変更可能なコスト、時間消費、および分数とさらに浄化経由で密度勾配遠心分離用超遠心機の必要性の欠点が含まれます。ほとんど高速遠心分離機は、個々 の調査官とはしばしば共有、教育機関の機器のコアは、法外なコストです。したがって、超遠心機可用性はこのような状況で禁止になります。

この分別のプロトコルでは、内分可洗剤を使用せず、高速遠心分離なしの分離を示しています。このメソッドは、細胞膜、ミトコンドリアと分数の間の雑菌と真核細胞の細胞質成分を隔離して研究者になります。

プロトコル

1. バッファーおよび試薬

注: は、テーブル 1を参照してください。

1. バッファー A、B の換散バッファー、サンプル バッファーおよびジギトニンのソリューションを準備します。
   1. バッファー A を準備するには、NaCl の 8.77 g と 900 mL の脱イオン水 50 mL HEPES (1 M、pH 7.4) の調整を脱イオン水 1 L に最終巻を追加します。
      注: 最終濃度は、150 mM の NaCl と 50 mM HEPES。
   2. 換散バッファー B を準備するには、追加の HEPES (1 M、pH 7.4) の 20 mL KCl、MgCl₂、エチレンジアミン四酢酸 (0.5 M の EDTA)、2 mL の 0.19 g の 0.75 g 2 mL エチレング リコール-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N'、N'-四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸 0.5 M)、38.26 g マンニトールと 900 mL の脱イオン水にショ糖 23.96 g 調整脱イオン水で 1 L に最終巻。
      メモ: 最終的な濃度は、20 mM HEPES、10 mM KCl、MgCl₂2 mM、1 mM EDTA、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、210 mM マンニトール 70 mM ショ糖です。
   3. 最終濃度 0.1 %sds のドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の 0.01 g を追加することによって含有トリス緩衝生理食塩水 (TBS) 10 mL にサンプル バッファーを準備します。
   4. ジギトニンの 25 mg を 100 mL の脱イオン水 (最終濃度は 250 μ g/mL) に追加することによってジギトニンの原液を準備します。
   5. 試験開始まで 4 ° C ですべての緩衝溶液と-20 ° C でジギトニンを格納します。
2. 細胞に添加する前にバッファー ソリューションに追加するホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤の新鮮なソリューションを準備します。
   1. 100% エタノール 1 mL に 17.4 mg PMSF を追加することによって phenylmethanesulfonyl フッ化物 (PMSF) の原液を準備 (最終濃度は 100 mM)。
      注意: は、PMSF を処理するとき、適切な保護具と注意を着用します。PMSF は摂取した場合危険物や皮膚への接触 (刺激)、アイ ・ コンタクト (刺激) や吸入; の場合少し危険目と皮膚に腐食性です。
   2. 製造元の指示に従って市販プロテアーゼ阻害剤カクテル (100 ×) を準備 (材料の表を参照してください)。
   3. SOV の 92 mg を 1 mL の脱イオン水 (最終濃度は 500 mM) に追加することによってナトリウム バナジン (SOV) の原液を準備します。
      注意: 適切な保護具を着用し、処理するときに注意を使用します。SOV はアイ ・ コンタクト (刺激)、摂取または吸入の場合危険です。深刻な露出過度は、死に至ることができます。

2. PBS 洗浄

1. 集中し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 分別前の細胞を洗ってください。
   1. ペレットを作成する適切な速度で細胞を懸濁液を遠心します。たとえば、400 × g 10 分間で U937 細胞の懸濁液を遠心分離機します。
   2. 上澄みを除去、4 × 10⁶セル/mL と塊を破るに優しくピペットの最終濃度で室温 PBS で細胞ペレットを再懸濁します。
   3. 400 × g細胞のペレットを 10 分間で細胞懸濁液を遠心します。
   4. 上澄みを除去し、, 最終濃度 2 × 10⁷セル/mL の氷冷バッファー A で細胞ペレットを再懸濁します。
      注: これ以降の手順4 ° Cで行われるべきまたは氷とすべてのバッファーの前の冷蔵をする必要があります。

3. ゾル性細胞質蛋白質の隔離

1. 洗剤ジギトニンと孵化によって細胞質蛋白質を抽出します。
   1. 直前のセル (ステップ 3.1.3) の株式 PMSF (100 mM)、プロテアーゼ阻害剤の 10 μ L の 10 μ L を追加 (100 ×)、2 μ L 在庫 SOV (500 mM) のバッファー A の 878 μ L にストック ジギトニン (250 μ g/mL) の 100 μ L (最終濃度 1 mM PMSF は、、1 × 1 mM SOV と 25 μ G/ml ジギトニン; プロテアーゼ阻害剤使用されているセルの数に従って最終的な音量を調整)。細胞ペレットに加えまで氷の上のソリューションを保持します。
   2. 400 × g 10 分間に細胞懸濁液を遠心分離し、上清を削除します。
   3. 阻害剤と 2 × 10⁷セル/mL、塊を破るに優しくピペットの最終的な集中でジギトニン (3.1.1 の手順で準備) を含むバッファー A 溶液中の細胞ペレットを再懸濁します。
   4. 4 ° C、20 分でエンド オーバー エンド回転子に細胞懸濁液を孵化させなさい。
   5. 上澄み 400 × gで 10 分間収集に細胞懸濁液を遠心分離し、きれいな遠心管。
   6. 細胞デブリに 20 分間、18,000 × gで収集した上清を遠心します。
   7. きれいな遠心チューブに上清を転送します。
   8. 3.1.5 と 3.1.6 の手順を繰り返して、遠心分離後餌が得られない。
   9. ゾル性細胞質蛋白質を含む上清を収集して保存する (短期) の 4 ° C または-20 ° C (長期)。
2. 遠心分離によって過剰ジギトニンとゾル性細胞質蛋白質を削除します。
   1. 4 × 10⁶セル/mL と塊を破るに優しくピペットの最終濃度バッファー A に (ステップ 3.1.5) からジギトニン グリセリン細胞ペレットを再懸濁します。
   2. 400 × g 10 分間ジギトニン グリセリン細胞懸濁液を遠心分離し、上清を削除します。
      注: 余分なゾル性細胞質の汚染物質を除去するバッファー A に繰り返し洗浄を実行できます。

4. セルの均質化

1. 細胞換散バッファー B に氷の上をインキュベートし、機械的手段によってそれらを溶解します。
   1. 直前のセル (ステップ 4.1.2) の換散バッファー B 988 μ に株式 PMSF (100 mM) の 10 μ L と株式 SOV (500 mM) の 2 μ L を追加 (最終濃度 1 mM PMSF、1 mM SOV; 分離されているセルの数を合わせて最終的な音量を調整) し、ラブ細胞ペレットに加えまで氷のグローバリゼ-ション。
   2. 4 × 10⁶セル/mL の最終的な集中で PMSF と SOV (4.1.1 の手順で準備) を含む氷冷換散バッファー B 溶液中 (からステップ 3.2.2) 細胞ペレットを再懸濁します。
   3. 30 分間氷の上細胞懸濁液を孵化させなさい。
   4. 氷の上 (とタイトなフィッティング B 杵) 中古冷蔵 Dounce ホモジナイザーに細胞懸濁液を転送し、遅いもストロークを使用してホモジナイザー杵と 40 パスを実行します。
      注: またディスカッション セクションで詳細として機械セル換散の他の手段を利用します。
   5. 磨砕液を収集し、きれいな遠心管にそれを転送します。
   6. ホモジナイザー杵と少量 (1 ~ 2 mL) 換散バッファー B の管を洗って、磨砕液を追加します。
   7. 10 分間 400 × g (または餌の切れ目のない細胞に必要な最小速度) でホモジネートを遠心します。
   8. きれいな遠心チューブに上清を転送します。
      注: 重要な餌まま手順として分数の収穫を増加する 4.1.6 を通じて 4.1.4 の場合ディスカッション セクションで詳しく説明します。プロトコルをここでは、一時停止できるし、磨砕液は短期 (24 h) の 4 ° C で保存します。

5. 差動遠心分離

1. 細胞の残骸、分離ミトコンドリア膜の一部分を削除する速度を増加させる、ホモジネートを遠心します。
   1. 上清を 500 × g 10 分転送上澄みで (ステップ 4.1.8) からきれいな遠心チューブを遠心分離し、ペレットを破棄します。
   2. きれいな遠心チューブに上清 (ステップ 5.1.1) から 1,000 × gで 10 分間転送で上清を遠心し、ペレットを破棄します。
   3. 上清を 2,000 × gで 10 分間転送上澄みで (ステップ 5.1.2) からきれいな遠心チューブを遠心分離し、ペレットを破棄します。
   4. 遠心上清を 4,000 × gで 15 分転送上澄みで (ステップ 5.1.3) からきれいな遠心管、ミトコンドリアを含む維持ペレット。
   5. B. の換散バッファーの少量 (0.5\u20121 mL) でミトコンドリアのペレットを再懸濁します
   6. 4,000 × gで 15 分間削除で中断されたペレットを遠心上清と再懸濁します、ミトコンドリアのサンプル バッファー (例えば250 を 500 μ L、ペレットのサイズによって異なり、必要な目的の最終巻のペレット濃度)。
   7. 15 分間遠心する (ステップ 5.1.4) から 4,000 × gで上清は、きれいな遠心管に上清を転送します。この手順を繰り返して、遠心分離後餌が得られない。
   8. 3 時間 18,000 × gで上清をスピンします。
   9. 膜蛋白質を含んでいるペレットをして、上清を除去します。少量で膜ペレットを再懸濁します (0.5 – 1 mL) の換散バッファー b.
   10. 1 時間 18,000 × gで中断されたペレットを遠心します。
   11. 上澄みを除去し、サンプル バッファー (250 を 500 μ L、ペレットと望ましい集中のサイズによって) の必要な最終巻で膜ペレットを再懸濁します。
2. 3 サンプル ペレットを超音波照射 5 のパワー設定で氷浴で s (20 kHz で 125 W の最大電力の 50% は、材料表を参照してください)。
3. (短期) の 4 ° C または-20 ° C (長期) のサンプルを格納します。
4. セルの細胞質やミトコンドリア膜コンパートメント内で見つかったタンパク質マーカーに対する抗体を用いたウエスタンブロットを実行することによって分別の純度のためのサンプルを調べる (代表的な結果を参照してください)。

結果

^{未分化 U937 細胞懸濁液で栽培}の成功の分別は、上記の詳細し、図 1に示したプロトコルを使用して達成されました。この方法で得られた試料は、ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜に濡れた転送法を用いた西部しみが付く⁹に服従しました。膜はその後に対する抗体をプローブ細胞質、ミトコンドリア膜局在蛋白質?...

ディスカッション

このプロトコルの開発は、ミトコンドリアを分離することができないと膜サンプル、市販キットを用いたネクロトーシス¹⁴中タンパク質の局在の解析から生まれた。既成のキットの主な制限は、サンプルとサンプルを処理することの限られた数、単価、各研究者のニーズに適応する無力です。ここで紹介した方法は、高価な試薬を使用せず、高価な機器の必要性なしに実行?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digitonin	TCI Chemicals	D0540	For Cytoplasm Extraction
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125	For Lysis buffer B
Dounce homogenizer	VWR	22877-282	For Homogenization
end-over-end rotator	Barnstead	N/A	For Cytoplasm Extraction
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Alfa Aesar	J61721	For Lysis buffer B
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E7889	For Lysis buffer B
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118	For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000
HEPES	VWR	J848	For Lysis buffers A and B
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	For Lysis buffer B
MgCl2	Alfa Aesar	12315	For Lysis buffer B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565	For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	For Lysis buffer A
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	VWR	M145	For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer
probe sonicator	Qsonica	Q125-110	For Final Samples
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML	For Cytoplasm Extraction
refrigerated centrifuge	Beckman-Coulter	N/A
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	VWR	227	For Sample buffer
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma-Aldrich	450243	For Lysis buffers A and B
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	For Lysis buffer B
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	788	For Sample buffer
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661	For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000