고속 원심 분리의 부재에서 U937 세포의 세포 분별 법

요약

여기, 선물이 원형질 막, 세포질 및 고속 원심 분리의 사용 없이 U937 세포의 미토 콘 드리 아를 분리 하는 프로토콜. 이 기술은 정화 subcellular 분수 immunoblotting 통해 단백질 지역화의 후속 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.

초록

이 프로토콜에서 우리를 ultracentrifugation 또는 무차별 세제의 사용 없이 U937 세포의 subcellular 분수를 받는 방법을 자세하게. 이 메서드 사용 소형 버퍼, digitonin, 기계적인 세포 및 세포질, 미토 콘 드리 아 및 원형질 막 분리 차등 원심 분리 합니다. 과정은 연구자의 요구에 맞게 확장할 수 있습니다, 그리고 저렴 하 고 간단. 이 메서드는 특수 원심 분리기와 둘 다 엄청나게 비쌀 수 있는 상업용 키트를 사용 하지 않고 셀에 단백질 지 방화를 결정 하기 위해 연구원 수 있게 됩니다. 성공적으로 인간 monocyte 셀 라인 U937이 cytosolic 분리 하는 방법, 원형질 막 및 미토 콘 드리 아 단백질 사용 했습니다.

서문

단백질 지 방화의 신뢰할 수 있는 id는 진 핵 세포에 있는 분자 통로 조사할 때 경우가 많습니다. 방법 subcellular 분수를 더 밀접 하 게 검사 세포 구성 성분의 연구자에 의해 활용 됩니다.

기존의 셀 분류 방법의 대부분은 일반적으로 두 개의 넓은 범주로, 세제 기반^1,2 , ultracentrifugation 기반^3,,45, 될 수 있는 속도, 정확성 및 비용에 의해 분화 된다. 셀의 고유 구성 요소를 solubilize 세제 힘 증가 함께 버퍼의 사용에 의존 하는 세제 기반된 프로토콜. 이 샘플을 처리 하는 신속 하 고 편리한 방법 이며, 비용 효과적일 수 있다 수와 샘플의 크기는 작은 하는 경우. 세포질, 막/세포 기관이 (혼합된 분수), 및 세포에서 핵 분수 분리 세제 기반 키트를 구입할 수 있습니다. 그러나, 이러한 장비와 관련 된 몇 가지 단점이 연구원에 게 그들의 유용성을 제한 한다. 그들은 쉽게 셀의 하나 또는 두 개의 구성 요소를 분리 하도록 설계 되었습니다 하지만 샘플에서 모든 분수를 동시에 차단 할 수 있다. 세제의 사용 의미는 원형질 막과 세포 막 동봉 하는 것입니다 수 똑같이 solubilized 및, 그러므로, 서로에서 분리 될 수 없습니다. 추가 합병증이 키트 연구원은 특정 응용 프로그램에 대 한 조건을 변경 하지 못하도록 독점 구성 요소에서 발생 합니다. 마지막으로, 그들은 사용에 제한 되 고 엄청나게 큰 규모의 실험에 대 한 비용이 있을 수 있습니다. 그러나 비 세제 기반된 키트 미토 콘 드리 아의 격리에 대 한 존재,, 원형질 막 분리 설계 되지 않았습니다 및 샘플 수율은 훨씬 밀도 원심에서 저것 보다는 더 적은 격리 프로토콜^{6,7 기반으로} .

분수를 ultracentrifugation를 사용 하는 메서드는 더 시간이 소모, 하지만 종종 세제 기반 키트 보다 순수한 분수에 결과. 그들 뒤에 세포질 분 대를 통해 차동의 분리 비 세제 메서드에서 lysed 첫 solubilizing 그들 (막 세포와 오염 결과로) 하지 않고 셀에서 플라즈마 막 분리 필요 원심 분리-원형질 막 절연 요구를 달성 하기 위해 100000 × g 의 속도. 대부분의 경우, isopycnic 밀도 그라데이션 원심 분리 추가 대 한 셀룰러 분수 또는 오염 물질의 제거의 차등 원심을 뒤 합니다. 이러한 방법은 철저 하 고 수정할 수 있지만, 단점 등 비용, 시간 소비, 분수와 더 정화를 통해 밀도 그라데이션 원심 분리에 대 한 ultracentrifuge에 대 한 필요. 대부분 고속 원심 분리기는 개별 조사와는 종종 교육 기관에서 장비를 코어 공유, 금지는 비용에 있습니다. 따라서, ultracentrifuge 가용성 이러한 상황에서 금지 된다.

이 분류 프로토콜 solubilizing 세제의 사용 없이 및 고속 원심 분리 하지 않고 subcellular 분수의 보여 줍니다. 이 메서드는 원형질 막, 미토 콘 드리 아 및 분수 사이 최소한의 오염으로 진 핵 세포의 세포질 구성 요소를 분리 하는 연구자 수 있게 됩니다.

프로토콜

1. 버퍼와 시 약 준비

주: 표 1을 참조 하십시오.

1. 버퍼 A, 세포의 용 해 버퍼 B, 샘플 버퍼 및 digitonin의 솔루션을 준비 합니다.
   1. NaCl의 8.77 g와 900 mL 이온된 물, HEPES (1 M, pH 7.4) 50 mL 조정 이온 물 1 L에 최종 볼륨을 추가 하 여 버퍼 A를 준비 합니다.
      참고: 최종 농도 150 mM NaCl 및 50 mM HEPES.
   2. 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N의 2 mL KCl, MgCl₂, Ethylenediaminetetraacetic 산 (0.5 M EDTA)의 2 개 mL의 0.19 g의 0.75 g HEPES (1 M, pH 7.4) 20 mL를 추가 하 여 세포의 용 해 버퍼 B 준비 ', N'-tetraacetic 산 (0.5 M EGTA) 38.26 g 마 니 톨 및 이온된 물 900 mL에 자당의 23.96 g 이온 물 1 L에 최종 볼륨을 조정.
      참고: 최종 농도 20 mM HEPES, 10mm KCl, 2 m MgCl₂m, 1 mM EDTA, 1mm EGTA, 210 m m 마 니 톨 및 70mm 자당.
   3. 0.1 %SDS 최종 농도 대 한 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)의 0.01 g을 추가 하 여 tris 버퍼 염 분 (TBS)의 10ml 샘플 버퍼를 준비 합니다.
   4. 이온된 수 (최종 농도 250 µ g/mL)의 100 mL에 digitonin의 25 mg을 추가 하 여 digitonin의 재고 솔루션을 준비 합니다.
   5. 실험의 시작까지 4 ° C에서 모든 버퍼 솔루션 및-20 ° C에서 digitonin를 저장 합니다.
2. 셀에 추가 하기 전에 버퍼 솔루션에 추가 될 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제의 새로운 솔루션을 준비 합니다.
   1. 100% 에탄올의 1 mL에 PMSF의 17.4 mg을 추가 하 여 phenylmethanesulfonyl 불 소 (PMSF)의 재고 솔루션을 준비 (최종 농도 100 mM).
      주의: 적절 한 보호 장비와 운동 주의 PMSF 처리할 때 착용 하십시오. PMSF는 섭취 하는 경우에 유해 하 고 약간 위험한 (자극성) 피부 접촉, 눈 접촉 (자극성) 또는 흡입; 그것은 눈과 피부에 부식성입니다.
   2. 제조업체의 지침에 따라 상용 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (100 ×) 준비 ( 재료의 표참조).
   3. SOV의 92 mg 이온된 수 (최종 농도 500 m m)의 1 mL에 추가 하 여 나트륨 orthovanadate (SOV)의 재고 솔루션을 준비 합니다.
      주의: 적절 한 보호 장비를 착용 하 고 처리할 때 주의 사용 합니다. SOV (자극성) 눈 접촉, 섭취 또는 흡입 위험입니다. 심한 노출은 죽음에 발생할 수 있습니다.

2. PBS 워시

1. 집중 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 분류 이전에 세포를 씻어.
   1. 원심 분리기 세포 현 탁 액 만드는 펠 릿을 적절 한 속도로. 예를 들어 10 분 400 × g 에서 U937 세포의 현 탁 액을 원심.
   2. 제거는 상쾌한, 4 × 10⁶ 셀/mL 및 덩어리 헤어를 부드럽게 피 펫의 최종 농도에서 실내 온도 PBS에 셀 펠 릿 resuspend.
   3. 셀 서 스 펜 션 10 분 작은 셀 400 × g 에서 원심
   4. 상쾌한을 제거 하 고 셀 펠 릿 2 × 10⁷ 셀/mL의 최종 농도에 차가운 얼음 버퍼 A에에서 resuspend.
      참고: 모든 후속 단계 4 ° C 에서 실행 되어야 한다 또는 얼음 및 모든 버퍼에 미리 냉장되어야 합니다.

3. cytosolic 단백질 격리

1. 세제 digitonin 가진 외피에 의해 cytosolic 단백질을 추출 합니다.
   1. 셀 (단계 3.1.3)의 물의 resuspension 직전 추가 재고 PMSF (100 m m), 프로 테아 제 억제제의 10 µ L 10 µ L (100 ×), SOV (500mm) 주식의 2 µ L 및 버퍼 A의 878 µ L 재고 digitonin (250 µ g/mL)의 100 µ L (최종 농도 1 밀리미터 PMSF 1 × protease 억제제, 1 mM SOV와 25 µ g/mL digitonin; 사용 되는 셀의 수에 의하여 최종 볼륨 조정). 셀 펠 릿에 추가 될 때까지 얼음 에 솔루션을 계속.
   2. 10 분 동안 400 × g 에서 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
   3. 억제제 및 digitonin (단계 3.1.1에서에서 준비) 2 × 10⁷ 셀/mL, 덩어리 헤어를 부드럽게 피 펫의 최종 농도에 포함 하는 버퍼 A 솔루션에서 셀 펠 릿을 resuspend.
   4. 셀 서 스 펜 션에서 20 분 동안 4 ° C 이상 끝 회전에 품 어.
   5. 원심 10 분 수집에 대 한 400 × g 에서 셀 서 스 펜 션은 상쾌한 하 고 깨끗 한 원심 분리기 튜브에.
   6. 작은 세포 파편을 20 분에 대 한 18000 × g 에서 수집 된 상쾌한 원심
   7. 깨끗 한 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송.
   8. 때까지 아무 펠 릿은 원심 분리에 따라 3.1.5-3.1.6 단계를 반복 합니다.
   9. Cytosolic 단백질 을 포함 하는 상쾌한을 수집 하 고 그것은 4 ° C (단기) 또는-20 ° C (긴 기간) 저장.
2. 원심 분리에 의해 초과 digitonin 및 cytosolic 단백질을 제거 합니다.
   1. 4 × 10⁶ 셀/mL 및 덩어리 헤어를 부드럽게 피 펫의 최종 농도에 버퍼 A에에서 resuspend (3.1.5 단계)에서 digitonin permeabilized 셀 펠 릿.
   2. 10 분 동안 400 × g 에서 digitonin permeabilized 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
      참고: 초과 cytosolic 오염 물질을 제거 하는 버퍼 A에에서 반복된 세척을 수행할 수 있습니다.

4. 세포 균질

1. 세포 세포의 용 해 버퍼 B에에서 얼음에 품 어 및 기계적 방법으로 그들을 lyse.
   1. 셀 (4.1.2 단계)의 물의 resuspension 직전 주식 PMSF (100 mM)의 10 µ L 및 추가 재고 SOV (500 m m)의 2 µ L B 세포의 용 해 버퍼의 988 µ L (최종 농도 1 밀리미터 PMSF와 1mm SOV; 되 lysed 세포의 수에 맞게 최종 볼륨 조정) solu 유지 기 셀 펠 릿에 추가 될 때까지 얼음 에.
   2. 차가운 얼음 세포의 용 해 버퍼 B 솔루션 PMSF 및 SOV (4.1.1 단계에서 준비) 4 × 10⁶ 셀/mL의 최종 농도에 포함 된 셀 펠 릿 (3.2.2 단계)에서 resuspend.
   3. 30 분 동안 얼음에 세포 현 탁 액을 품 어.
   4. 얼음에 (꽉 끼는 B 유 봉)과 미리 냉장된 Dounce 균질 화기에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 천천히, 심지어 스트로크를 사용 하 여 균질 화기 유 봉과 40 패스를 수행 합니다.
      참고: 또는 토론 섹션에서 자세한 기계적 세포 세포의 용 해의 다른 수단을 사용 합니다.
   5. homogenate를 수집 하 고 깨끗 한 원심 분리기 튜브에 그것을 전송.
   6. 균질 화기 유 봉 및 B 세포의 용 해 버퍼의 소량 (1 ~ 2 mL) 튜브를 세척 하 고는 homogenate에 그것을 추가.
   7. Homogenate 400 × g (또는 작은 손상 되지 않은 세포에 필요한 최소 속도)에서 10 분 원심.
   8. 깨끗 한 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송.
      참고: 중요 한 펠 릿 반복 단계 4.1.6로 분수의 수확량을 증가 시키기를 통해 4.1.4 경우 토론 섹션에 자세히. 프로토콜은 여기, 일시 중지할 수 있습니다 그리고는 homogenate 단기 (24 시간) 4 ° C에서 저장.

5. 차동 원심 분리

1. 세포질 파편, 격리 미토 콘 드리 아 및 막 분수 제거 하는 속도 증가에서 homogenate 원심
   1. 10 분 전송 상쾌한에 대 한 500 × g 에서 깨끗 한 원심 분리기 튜브 (4.1.8 단계)에서 상쾌한 원심 그리고 어떤 펠 릿을 삭제.
   2. 원심 (5.1.1 단계)에서 10 분 전송에 대 한 1000 × g 에서 상쾌한 깨끗 한 원심 분리기 튜브에 상쾌한 고 어떤 펠 릿을 삭제.
   3. 10 분 전송에 상쾌한에 대 한 2000 × g 에서 깨끗 한 원심 분리기 튜브 (5.1.2 단계)에서 상쾌한 원심 그리고 어떤 펠 릿을 삭제.
   4. 깨끗 한 원심 분리기 튜브, 미토 콘 드리 아를 포함 하는 계속 펠 릿에 15 분 전송 상쾌한에 대 한 4000 × g 에서 (에서 단계 5.1.3) 상쾌한 원심
   5. B. 세포의 용 해 버퍼의 작은 볼륨 (0.5\u20121 mL)에서 미토 콘 드리 아 펠 릿 resuspend
   6. 상쾌한, resuspend 4000 × g 15 분 제거에서 일시 중단 된 펠 릿을 원심는 미토 콘 드리 아 의 샘플 버퍼 (예를 들어, 250 ~ 500 µ L, 펠 릿의 크기에 따라 그리고 원하는 원하는 최종 볼륨에서 펠 릿 농도)입니다.
   7. 원심 분리기 (5.1.4 단계)에서 상쾌한 4000 × g 에서 15 분에 대 한 깨끗 한 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송. 때까지 아무 펠 릿은 원심 분리에 따라이 단계를 반복 합니다.
   8. 3 h에 대 한 18000 × g 에서 상쾌한 스핀.
   9. 상쾌한, 제거 하 고 막 단백질을 포함 하는 펠 릿을 유지. 작은 볼륨에서 막 펠 릿 resuspend (0.5-1 mL) 세포의 B. 버퍼
   10. 1 시간에 대 한 18000 × g 에서 일시 중단 된 펠 릿 원심
   11. 상쾌한을 제거 하 고 원하는 마지막 양의 샘플 버퍼 (250 ~ 500 µ L, 펠 릿 및 원하는 농도의 크기에 따라)에 막 펠 릿 resuspend.
2. 3 샘플 펠 릿을 sonicate 5의 전원 설정에서 얼음 목욕에서 s (20 kHz에서 125 W 최대 전력의 50%는 테이블의 자료참조).
3. 샘플 4 ° C (단기) 또는-20 ° C (장기)를 저장 합니다.
4. 서쪽 오 점 단백질 마커는 세포의 세포질, 미토 콘 드리 아 막 구획에서 발견에 대 한 항 체를 이용 하 여 분류의 순수성에 대 한 샘플을 검사 (대표적인 결과 섹션을 참조 하십시오).

결과

Undifferentiated U937⁸ 셀 서 스 펜 션에서의 성공적인 분류는 위에서 자세히 설명 하 고 그림 1에 나와 있는 프로토콜을 사용 하 여 달성 되었다. 이 방법으로 얻은 샘플 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막에 젖은 전송 방법을 이용 하 여 서쪽 더 럽 히⁹ 를 받게 했다. 막에 대 한 항 체와 조사 이후에 세포질, 미토 콘 드 리아 멤브?...

토론

이 프로토콜의 개발은 미토 콘 드리 아를 분리 하는 무 능력 하 고 막 샘플, necroptosis¹⁴동안 단백질 지 방화의 분석을 위해 상용 키트를 사용 하 여에서 발생 했다. Premade 키트의 주요 한계는 그들의 무 능력 개인 연구자의 요구에 적응 될 샘플 및 샘플 처리 수의 제한 된 수의 비용. 비싼 시 약의 사용과 고가의 장비에 대 한 필요성 없이 여기에 제시 된 메서드를 수행할 수 있습니다...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digitonin	TCI Chemicals	D0540	For Cytoplasm Extraction
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125	For Lysis buffer B
Dounce homogenizer	VWR	22877-282	For Homogenization
end-over-end rotator	Barnstead	N/A	For Cytoplasm Extraction
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Alfa Aesar	J61721	For Lysis buffer B
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E7889	For Lysis buffer B
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118	For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000
HEPES	VWR	J848	For Lysis buffers A and B
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	For Lysis buffer B
MgCl2	Alfa Aesar	12315	For Lysis buffer B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565	For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	For Lysis buffer A
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	VWR	M145	For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer
probe sonicator	Qsonica	Q125-110	For Final Samples
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML	For Cytoplasm Extraction
refrigerated centrifuge	Beckman-Coulter	N/A
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	VWR	227	For Sample buffer
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma-Aldrich	450243	For Lysis buffers A and B
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	For Lysis buffer B
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	788	For Sample buffer
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661	For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000