طريقة التكليك الكهربائي لتسجيل الغشاء المحتمل من شريان دماغي متوسط كانولاتيد

Summary

الهدف الأساسي من هذه المقالة هو تقديم تفاصيل عنكيفية تسجيل الغشاء المحتملة (V م) من الشريان الدماغي الأوسط باستخدام طريقة الإمتصاسيم microelectrode. الشريان الدماغي الأوسط المُكَنَّد مُكَدَّد للحصول على نغمة مُجَرّة، وجدار الوعاء مُنَطَط باستخدام الأقطاب الدقيقة عالية المقاومة.

Abstract

الغشاء المحتمل(V م) من خلايا العضلات الملساء الوعائية يحدد لهجة الوعاء وبالتالي تدفق الدم إلى عضو. التغيرات في التعبير ووظيفة القنوات الأييون والمضخات الكهربائية التي تنظم_{V M} في حالات المرض يمكن أن يغير من المحتمل V_م,لهجة الأوعية الدموية, وتدفق الدم. وهكذا، فهم أساسي للوظائف الفسجية الكهربائية والأساليب اللازمة لتسجيل بدقة_{V M} في حالات صحية ومريضة ضرورية. هذا الأسلوب سوف يسمح تعديل_{V M} باستخدام عوامل دوائية مختلفة لاستعادة_{V م}. على الرغم من أن هناك عدة طرق، كل مع مزاياه وعيوبه، وتوفر هذه المادة بروتوكولات لتسجيل_{V M} من السفن المقاومة cannulated مثل الشريان الدماغي الأوسط باستخدام طريقة impalement microelectrode. يسمح للشرايين الدماغية الوسطى للحصول على لهجة myogenic في غرفة myograph، ويتم اختراق جدار السفينة باستخدام microelectrodes عالية المقاومة. يتم جمع إشارة_{V m} من خلال مقياس كهربائي، رقمنة، وتحليلها. توفر هذه الطريقة قراءة دقيقة لـ V_m لجدار السفينة دون الإضرار بالخلايا ودون تغيير مقاومة الغشاء.

Introduction

يشير احتمال الغشاء (V_m)من الخلية إلى الفرق النسبي للتهمة الأيونية عبر غشاء البلازما ونفاذية الغشاء النسبي لهذه الأيونات. يتم إنشاء_{V m} عن طريق التوزيع التفاضلي للأيونات ويتم الحفاظ عليها بواسطة قنوات أيون والمضخات. قنوات ايون مثل K⁺، Na⁺، و Cl^- المساهمة بشكل كبير في استراحة_{V م}. الأوعية الدموية الخلايا العضلية الملساء (VSMCs) تعبر عن أكثر من أربعة أنواع مختلفة من K⁺ قنوات¹, نوعين من الجهد بوابة Ca^{2 +} قنوات (VGCC)², أكثر من نوعين من Cl^- قنوات^{3, 4 , 5،}تخزين تشغيل هاتا2+ قنوات^6،تمتد تنشيط قنوات الموجبة^7،8،وكهربائي الصوديوم البوتاسيوم ATPase مضخات⁹ في أغشية البلازما الخاصة بهم، وكلها قد تكون تشارك في تنظيم_{V م}.

V_m من VSMCs يعتمد على ضغط التجويف. في الأوعية غير المضغوطة، V_m يختلف من -50 إلى -65 mV، ومع ذلك، في شرائح الشريان المضغوط، تتراوح_{V m} من -37 إلى -47 mV^10. ارتفاع الضغط داخل الأوعية الدموية يؤدي VSMCs إلى إزالة الاستقطاب¹¹، ويقلل من عتبة فتح VGCC ، ويزيد من تدفق الكالسيوم المساهمة في تطوير لهجة myogenic¹². على العكس من ذلك، في الأوعية السلبية أو غير المضغوطة، الغشاء فرط الاستقطاب، بسبب ارتفاع K⁺ قناة النشاط، سوف تمنع VGCC من فتح، مما أدى إلى دخول الكالسيوم محدودة وانخفاض في الكالسيوم داخل الخلايا، مما يسهم في أقل الأوعية الدموية لهجة¹³. وهكذا، V_م بسبب التغيرات في ضغط التجويف يبدو أن تلعب دورا أساسيا في تطوير لهجة الأوعية الدموية، وكلا VGCC و K⁺ قنوات تلعب دورا حاسما في تنظيم_{V م}.

V_m يختلف بين نوع السفينة والأنواع. V_M هو -54 ± 1.3 mV في غينيا خنزير متفوقة شرائط الشريانية المساريقي¹⁴، -45 ± 1 mV في الشرايين الدماغية الوسطى الفئران في 60 مم زئبق ضغط التجويف¹²، و -35 ± 1 mV في الجرذان في الجرذان parenchymal الشرايين في ضغط التجويف 15 mmHg 40. وV_متر يستريح سجلت في العضلات اللمفاوية الفئران غير الممدودة هو -48 ± 2 mV¹⁶. V_m من VSMCs الدماغي هو أكثر سلبية مما كانت عليه في الشرايين الطرفية. وبالمقارنة، تم الإبلاغ عن أن الشرايين الدماغية الوسطى الماكرة لديها_{V m} من حوالي -70 mV، في حين تم الإبلاغ عن الشرايين المساريقية والتاجية لديها -49 و -58 mV، على التوالي^17،18. الاختلافات في_{V m} عبر أسرة الأوعية الدموية قد تعكس الاختلافات في التعبير ووظيفة قنوات الأيون ومضخات الصوديوم والبوتاسيوم الكهربائية.

الزيادات والانخفاضات في_{V m} يشار إليها باسم الغشاء إزالة الاستقطاب وفرط الاستقطاب، على التوالي. هذه التعديلات في_{V m} تلعب دورا مركزيا في العديد من العمليات الفسيولوجية, بما في ذلك قناة الأيون gating, إشارة الخلية, تقلص العضلات, والعمل الانتشار المحتمل. في ضغط ثابت، العديد من مركبات موسعات الأوعية الذاتية والاصطناعية التي تنشط K⁺ قنوات تسبب فرط الاستقطاب الغشاء، مما أدى إلى توسع الأوعية^1،13. وعلى العكس من ذلك، فإن إزالة الاستقطاب الغشاء المستمر أمر حيوي في الانقباض اتّبع أو التقلص اتّبع الأوعية^19. V_m هو متغير حاسم لا ينظم فقط تدفق Ca²⁺ من خلال VGCC¹³ ولكن أيضا يؤثر على الافراج عن Ca²⁺ من المتاجر الداخلية^20،21 و Ca²⁺حساسية من جهاز التقلص²².

في حين أن هناك عدة طرق لتسجيل_{V M} من أنواع مختلفة من الخلايا، والبيانات التي تم جمعها من طريقة impalement microelectrode من السفن cannulated يبدو أن أكثر الفسيولوجية من البيانات التي تم الحصول عليها من VSMCs معزولة. عندما سجلت من VSMC معزولة باستخدام أساليب المشبك الحالي، وينظر_{V m} كما فرط الاستقطاب اتانعم يعابر في VSMCs²⁴. VSMCs معزولة ليست في المزامنة، والتغيرات في المقاومة سلسلة قد تسهم في السلوك التذبذب من_{V m}. من ناحية أخرى، لا يلاحظ السلوك التذبذب عندما يتم تسجيل_{V m} من السفن سليمة، وربما يرجع ذلك إلى اتصال خلية الخلية بين VSMCs التي هي في التزامن في الشريان ويتم summated في جميع أنحاء السفينة مما يؤدي إلى ثابت V_م ²⁴- وبالتالي، فإن قياس_متر V من الأوعية المضغوطة باستخدام تقنية التكوّل الكهربائي الصغير المعياري ة قريب نسبيا من الظروف الفسيولوجية.

تسجيل V_M من الأوعية cannulated يمكن أن توفر معلومات حيوية، منذ_{V م} من VSMCs التي هي في التزامن هي واحدة من المحددات الرئيسية لنغمة الأوعية الدموية وتدفق الدم، والتشكيل من_M V يمكن أن توفر وسيلة لتمدد أو انقباض الأوعية الدموية. وبالتالي، فمن الضروري أن نفهم المنهجية التي ينطوي عليها تسجيل_{V م}. يصف هذا مادة تسجيل [إينترسلّوكل] من [ف]_[م] من [كنتّلتد] [مكّين] شرايين ([ككم]) يستعمل [ميكروكتّر] [إيمّلمنت] طريقة. هذا البروتوكول سوف يصف كيفية إعداد MCAs، microelectrodes، إعداد مقياس الكهرباء وأداء طريقة impalement لتسجيل_{V م}. أيضاً، يتم مناقشة البيانات التمثيلية، والمشكلات الشائعة التي تمت مواجهتها عند استخدام هذا الأسلوب والمشكلات المحتملة.

Protocol

وقد تم إيواء الجرذان الذكور في مرفق رعاية الحيوانات في UMMC، الذي وافقت عليه جمعية تقييم واعتماد العناية بالحيوانات المختبرية (AAALAC). وكان للالحيوانات حرية الحصول على الغذاء والماء طوال الدراسة. تم الحفاظ على الحيوانات في بيئة خاضعة للرقابة مع درجة حرارة 24 ± 2 درجة مئوية، ومستويات الرطوبة من 60-80٪ و 12 دورة ضوء / الظلام. وقد وافقت لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في الاتحاد على جميع البروتوكولات.

1. إعداد المعدات

1. وضع مزدوج قناة التفاضلية الكهربائي مكبر للصوت (انظر جدول المواد) على مقربة منغرفة السفينة وفي الموقع المطلوب.
2. قم بتوصيل إخراج قناة مكبر الصوت A أو B بمدخل القناة من جهاز التحويل الرقمي مع كابل BNC-BNC.
3. جبل التحقيق في micromanipulator ووضعها بالقرب من المجهر وmyograph. يجب تثبيت إعداد التسجيل على جدول خالي من الاهتزاز.
4. وضع المقابض ومفاتيح على الجزء الأمامي من مكبر للصوت في المواقف التي تكوينه لهذه التجربة كما هو موضح في الدليل.
5. ربط الأرض حمام إلى الأرض الدائرة من مكبر للصوت عن طريق مع قطب مناسب. وبالمثل، تأكد من أن القفص هو على الارض إلى هيكل مكبر للصوت.

2. إعداد الأقطاب الدقيقة والتجمع

1. استخدم الأقطاب الدقيقة المصنوعة من البورسليكات (انظر جدول المواد) واسحب طرف الزجاج لتبلغ قطره 8-10 مم، وقطره <1 ميكروم ومقاومة 80-120 MΩ عند ملئه بـ 3 م ك.كل.
   1. استخدام سحب القياسية لتحقيق تفتق تدريجي قصيرة باستخدام الإعدادات التالية: الحرارة = 650; السرعة = 20؛ سحب = 25; الوقت = 250 وحلقة مرتين لمقاومة أعلى وأصغر نصائح. انظر جدول المواد كإعدادات خاصة بالصك.
      ملاحظة: سوف تسبب أقطار البقشيش <1 μm الحد الأدنى من الضرر للخلية عند الإنفسيد.
2. ملء ميكروكتريكت مع 3 M KCl باستخدام حقنة ستوكات (انظر جدول المواد).
   1. سحب ببطء المكبس من المحاقن ستوكات حتى أثناء حقن 3 M KCl في microelectrode للسماح مساحة للسائل لملء ومنع تشكيل فقاعات الهواء داخل microelectrode.
   2. ملء microelectrode حتى الكامل وضمان عدم وجود فقاعات الهواء قبل وضعه في حامل microelectrode. إذا كانت الفقاعات موجودة، فاضغط برفق على الميكروتكترود بإصبع لإزالة الفقاعات.
3. ممارسة الرعاية، ودفع بقوة ساق القطب في حامل من خلال ثقب بالملل. إذا كان السوائل الزائدة موجودة، قم بإزالته بنسيج.
4. قم بتوصيل تجميع حامل الأقطاب الكهربائية بمسبار مكبر الصوت. إجراء اختبار القطب الكهربائي، وضبط إزاحة الإدخال، والتحقق من الإعداد صفر والتحقق من تسرب المدخلات التحقيق وفقا لدليل مكبر للصوت.
5. قياس مقاومة الأقطاب الكهربائية باستخدام اختبار القطب كما هو موضح في الجدول1.
6. لاحظ أن قطب يعمل يعرض إزاحة الجهد DC إيجابية من 1 mV /MΩ في إخراج القناة. من ناحية أخرى، إذا ظهر جهد كبير في إخراج القناة وعلى العداد، وهذا يشير إلى قطب مسدود أو مكسور.
7. افتح برنامج التسجيل، وقم بتعيين اسم إلى الملف واحفظه لتحليله في المستقبل في برنامج تخزين.

3. عزل وقنينة الشريان الدماغي الأوسط

1. إعداد الكواشف.
   1. إعداد محلول ملح فسيولوجى للكالسيوم الطبيعي والمنخفض (PSS) كما هو موضح في الجدول 2.
2. جهزي الـ"ميوغراف"
   1. شطف غرفة myograph (انظر جدولالمواد) مع الماء المقطر عدة مرات للحفاظ على أنها خالية من الحطام. تحميل الغرفة مع 5 مل من PSS العادي.
   2. املأ كلا الكانولا الزجاجي ينبذ بـ PSS العادي ة بحقنة 5-10 مل. ملء بعناية كامل قنية والأنابيب المرفقة دون إدخال أي فقاعات الهواء.
   3. إعداد اثنين من خيوط النايلون حيدة (10-0، 0.02 ملم) مع نصف عقدة كل باستخدام ملقط حادة.
   4. ضع عقدة الخياطة المغلقة جزئيًا على كلا الخطين بعيدًا قليلاً عن الطرف باستخدام ملقط التشريح تحت مجهر التشريح. في وقت لاحق سيتم انزلق هذه العقد قبالة وتعادل بعناية على نهايات الشرايين cannulated لتأمين السفينة.
3. عزل وتأسي الشريان الدماغي الأوسط.
   1. إحداث تخدير عميق في الفئران سبراغ دولي باستخدام 2-4٪ استنشاق isoflurane.
   2. قطع رأس الجرذ باستخدام المقصلة تحت التخدير العميق.
   3. إزالة بعناية الجمجمة باستخدام قطع العظام ومقص.
   4. إزالة الدماغ من الجمجمة ووضعها في 5 مل من PSS الكالسيوم منخفضة على الجليد.
   5. تحديد وتشريح جزء غير متفرع من الشريان الدماغي الأوسط للفئران (MCA) بقطر داخلي يتراوح بين 100 و200 ميكرومتر من الدماغ باستخدام مقص الربيع وملقط.
   6. جبل MCA على cannulas الزجاج باستخدام ملقط غرامة وآمنة عن طريق تشديد الغرز في myograph التي تحتوي على PSS العادي.
   7. أغلق القنية البعيدة بحيث لن يكون هناك تدفق داخل MCAs.
   8. توصيل ماصة التدفق إلى خزان يحمل PSS للسماح للتحكم في الضغط داخل المنار الذي سيتم رصده باستخدام محول ضغط في الخط.
   9. تصور MCAs cannulated باستخدام كاميرا الجهاز تهمة مقرونة (انظر جدولالمواد) التي شنت على المجهر مقلوب والبرمجيات التصوير.
   10. تعيين طول محوري من MCA إلى طول تقريبي حيث ينبغي أن تظهر لا جامدة ولا رخوة.
   11. توازن حل الحمام مع O₂ (95%) وثاني أكسيد الكربون (5 في المائة) عند 37 درجة مئوية لتوفير الأكسجة الكافية، ودرجة الحرارة والمحافظة على درجة الـ 7.4 درجة مئوية.
4. إمبالي (اختراق غشاء بلازما الخلية) خلايا العضلات الملساء الوعائية.
   1. قم بتوصيل القطب الأرضي وابقائه مغموراً في PSS من myograph.
   2. تضيء غرفة السفينة وننظر من خلال المجهر لتصور غيض من microelectrode في محلول الحمام.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن تصور MCA وmicroelectrode على جهاز كمبيوتر وجود برنامج التصوير.
   3. استخدام الضوابط من micromanipulator لنقل غيض من microelectrode بالقرب من الجدار الخارجي للأوعية الدموية. يجب أن يكون micromanipulator وطرف microelectrode في وضع مستقر بالنسبة للأنسجة.
      ملاحظة: قبل بدء التجارب، تأكد من أن الجهد الغشاء قد استقرت. إذا كان الجهد المقيس غير مستقر، فإن الاتصال بين القطب الكهربائي والخلية غير مختوم، مما يشير إلى حدوث تسرب.
   4. ابدأ التسجيل.
   5. تحرك ببطء غيض من microelectrode نحو السفينة، وتهدف إلى مركز السفينة باستخدام مسار أو السيطرة الدقيقة من micromanipulator.
      ملاحظة: في بعض الأحيان، يمكن ملاحظة انحراف صغير في التسجيل عندما يتصل طرف ميكروإلكتركت بغشاء من ألياف العضلات.
   6. عندما يأتي الطرف على مقربة من السفينة، تقدم القطب إلى الأمام في حركة واحدة سريعة باستخدام micromanipulator لإمبل غشاء العضلات.
   7. عند هذه النقطة، يمكن للمرء أن يبدأ في مراقبة التغييرات في_{V m} يتم تسجيلها. لا تلمس الميكرومتتورتور عندما يقوم الإلكتروكت الكهربائي الدقيق بإملاك غشاء الخلية.
      ملاحظة: الفرق في الجهد بين تسجيل والقطب المرجعي يقلل من 0 mV إلى ما بين -40 mV و -75 mV اعتمادا على مستوى الضغط داخل الأوعية الدموية أو غيرها من المحفزات المثيرة أو المثبطة. هذه القراءات تميز الفرق المحتمل عبر الغشاء للخلية الحالية.
   8. تنفيذ العديد من التشوهات على سفينة واحدة في مناطق مختلفة من السفينة دون الإضرار VSMCs من أجل الحصول على قياسات دقيقة.
   9. بعد التسجيل، استخدم المتلاعب لإزالة ميكروتكترود في حركة واحدة سريعة.
   10. إيقاف التسجيل وحفظ ملفات البيانات لمزيد من التحليل.

النتائج

يمكن استخدام الطريقة المقدمة بشكل موثوق لتسجيل_{V m} في السفن cannulated. يتم عرض إجراء موجز يصف كيفية عزل MCA من الدماغ في الشكل 1A. بعد فصل الدماغ عن الجمجمة، تم تشريح MCA ووضعها في طبق بيتري الذي يحتوي على PSS منخفضة الكالسيوم. كما تم تشريح جزء من النسيج الضام ال?...

Discussion

توفر هذه المقالة الخطوات اللازمة حول كيفية استخدام طريقة حادة للتخميد ميكروالقطب لتسجيل_{V m} من إعداد وعاء cannulated. ويستخدم هذا الأسلوب على نطاق واسع، ويقدم عالية الجودة، وتسجيلات متسقة من_{V m} التي تجيب على مجموعة واسعة من الأسئلة التجريبية.

يتم وصف بعض الاعتبارات ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser	Parkland scientific	V3000PK
Dissection microscope	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer Bone Cutter	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps	Fine science tools	11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt	Fine science tools	14008-14
Suture	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas Spring Scissors	Fine science tools	15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera	Qimaging, , BC	Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier	WPI	FD223A
In-line pressure transducer	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelectrodes	Warner Instruments LLC, CT	G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe)	WPI	MF28G67-5
Microelectrode holder	WPI	MEH1SF
Myograph	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
Puller	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
Vibration-free table	TMC	3435-14
Softwares
Clampex 10	Molecular devices
p Clamp 10	Molecular devices
Imaging software	Nikon, NY	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
Glucose	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761