Mikroelektroden-Impalement-Methode zur Aufzeichnung des Membranpotenzials aus einer kantigen mittleren Zerebralparese

Zusammenfassung

Das primäre Ziel dieses Artikels ist es, Details darüber zu liefern, wie Membranpotenzial (V_m) aus der mittleren Zerebrale mit der Mikroelektroden-Impalement-Methode aufzuzeichnen ist. Die kanülierte mittlere Hirnarterie wird ausgeglichen, um myogenen Ton zu erhalten, und die Gefäßwand wird mit hochwiderstandigen Mikroelektroden aufgespießt.

Zusammenfassung

Membranpotential (V_m) von vaskulären glatten Muskelzellen bestimmt den Gefäßtonund und damit den Blutfluss zu einem Organ. Veränderungen in der Expression und Funktion von Ionenkanälen und elektrogenen Pumpen, die V_m bei Krankheitszuständen regulieren, könnten möglicherweise V_m,Gefäßtonus und Blutfluss verändern. Daher sind ein grundlegendes Verständnis der Elektrophysiologie und die Methoden, die notwendig sind, um V_m in gesunden und kranken Zuständen genau aufzuzeichnen, unerlässlich. Diese Methode ermöglicht die Modulation von V_m mit verschiedenen pharmakologischen Mitteln zur Wiederherstellung von V_m. Obwohl es mehrere Methoden gibt, jede mit ihren Vor- und Nachteilen, bietet dieser Artikel Protokolle zur Aufzeichnung von V_m aus kanülierten Widerstandsgefäßen wie der mittleren Zerebralparese mit der Mikroelektroden-Impalement-Methode. Mittlere Hirnarterien dürfen in einer Myographenkammer myogenen Ton erhalten, und die Gefäßwand wird mit hochwiderstandsstarken Mikroelektroden aufgespießt. Das V m-Signal wird über ein Elektrometer erfasst, digitalisiert und analysiert. Diese Methode ermöglicht ein genaues Ablesen des V_m einer Gefäßwand, ohne die Zellen zu beschädigen und ohne den Membranwiderstand zu verändern.

Einleitung

Das Membranpotential (V_m) einer Zelle bezieht sich auf den relativen Unterschied der ionischen Ladung über die Plasmamembran und die relative Durchlässigkeit der Membran zu diesen Ionen. Der V_m wird durch die Differenzverteilung der Ionen erzeugt und durch Ionenkanäle und Pumpen aufrechterhalten. Ionenkanäle wie K⁺, Na⁺, und Cl^- tragen wesentlich zum ruhenden V_mbei. Vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) exprimieren mehr als vier verschiedene Arten von K⁺ Kanäle¹, zwei Arten von spannungsgegated Ca²⁺ Kanälen (VGCC)², mehr als zwei Arten von Cl - Kanäle^{3, 4 , 5}, speicherbetriebene Ca²⁺ Kanäle⁶, Stretch-aktivierte Kationenkanäle^7,8und elektrogene Natrium-Kalium-ATPase-Pumpen⁹ in ihren Plasmamembranen, die alle an der Regulierung von V_mbeteiligt sind.

Der V_m von VSMCs hängt vom Lumendruck ab. In nicht unter Druck stehenden Gefäßen variiert V_m von -50 bis -65 mV, in Druckarteriensegmenten reicht V_m jedoch von -37 bis -47 mV¹⁰. Die Erhöhung des intravaskulären Drucks bewirkt, dass VSMCs¹¹depolarisieren, den Schwellenwert für die VGCC-Öffnung verringern und den Kalziumzufluss erhöhen, der zur Entwicklung des myogenen Tons^{beiträgt 12}. Im Gegenteil, in passiven oder nicht unter Druck stehenden Gefäßen wird die Membranhyperpolarisation aufgrund der hohen K +-Kanalaktivität verhindern, dass sich VGCC öffnet, was zu einem begrenzten Kalziumeintrag und einer Abnahme des intrazellulären Kalziums führt, was zu weniger Gefäßton¹³. Somit scheint V_m aufgrund von Veränderungen des Lumendrucks eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung des Gefäßtonons zu spielen, und sowohl VGCC- als auch K +-Kanäle spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von V_m.

V_m variiert je nach Schiffstyp und Art. V_m ist -54 x 1,3 mV in Meerschweinchen überlegene meenterische arterielle Streifen¹⁴, -45 x 1 mV in den mittleren Hirnarterien der Ratte bei 60 mmHg Lumendruck¹², und -35 x 1 mV in Rattenparenchymalarterien bei 40 mmHg Lumendruck¹⁵. Der ruhende V_m, der im ungestreckten Lymphmuskel der Ratte aufgezeichnet wird, beträgt -48 x 2 mV¹⁶. V_m zerebraler VSMCs ist negativer als in peripheren Arterien. Im Vergleich dazu wurden feline mittlere Hirnarterien mit einem V_m von etwa -70 mV berichtet, während mesentäre und koronare Arterien mit -49 bzw. -58 mV bzw.^17,18berichtet enden. Unterschiede im V_m über Gefäßbetten können die Unterschiede in der Expression und Funktion von Ionenkanälen und elektrogenen Natrium-Kaliumpumpen widerspiegeln.

Erhöhungen und Abnahmen von V_m werden als Membrandepolarisation bzw. Hyperpolarisation bezeichnet. Diese Veränderungen in V_m spielen eine zentrale Rolle in vielen physiologischen Prozessen, einschließlich Ionenkanalgating, Zellsignalisierung, Muskelkontraktion, und Aktion potenzielle Ausbreitung. Bei einem festen Druck verursachen viele endogene und synthetische Vasodilatatorverbindungen, die K⁺ Kanäle aktivieren, eine Membranhyperpolarisation, was zu Einer Vasodilatation^1,13führt. Umgekehrt ist eine nachhaltige Membrandepolarisation bei agonistisch-induzierter oder rezeptorvermittelter Vasokonstriktion¹⁹von entscheidender Bedeutung. V_m ist eine kritische Variable, die nicht nur den Zustrom von Ca²⁺ durch VGCC¹³ reguliert, sondern auch die Freisetzung von Ca²⁺ aus den internen Lagern^20,21 und Ca²⁺-Empfindlichkeit von die kontraktive Vorrichtung²².

Zwar gibt es mehrere Methoden zur Erfassung von V_m aus verschiedenen Zelltypen, aber die Daten, die aus der Mikroelektroden-Imprägemethode von kanülierten Gefäßen gesammelt wurden, scheinen physiologischer zu sein als Daten, die von isolierten VSMCs gewonnen wurden. Bei aufnahme von isoliertem VSMC mit aktuellen Klemmmethoden wird V_m als spontane transiente Hyperpolarisation in VSMCs²⁴angesehen. Isolierte VSMCs befinden sich nicht im Syncytium, und die Änderungen im Serienwiderstand können zum Oszillatorverhalten von V_mbeitragen. Andererseits wird das Oszillationsverhalten nicht beobachtet, wenn V_m von intakten Gefäßen aufgezeichnet wird, wahrscheinlich aufgrund des Zell-Zell-Kontakts zwischen VSMCs, die sich in der Arterie im Syncytium befinden und im gesamten Gefäß summiert werden, was zu einem stabilen V_m ^{führt. 24}. Somit ist die Messung von V_m von Druckgefäßen mit Standard-Mikroelektroden-Impalement-Technik relativ nahe an den physiologischen Bedingungen.

Die Aufnahme von V_m von kanülierten Gefäßen könnte wichtige Informationen liefern, da V_m von VSMCs, die in Syncytium sind, eine der wichtigsten Determinanten des Gefäßtons und des Blutflusses ist und die Modulation des V_m eine Möglichkeit bieten könnte, Verengung der Blutgefäße. Daher ist es wichtig, die Methodik zu verstehen, die bei der Erfassung von V_merforderlich ist. Dieser Artikel beschreibt die intrazelluläre Aufzeichnung von V_m aus kanülierten mittleren Hirnarterien (MCAs) mit einer Mikroelektroden-Impalement-Methode. Dieses Protokoll beschreibt, wie McAs, Mikroelektroden, die Einrichtung des Elektrometers und die Impalement-Methode zur Aufzeichnung von V_mdurchgeführt werden. Darüber hinaus werden repräsentative Daten, häufige Probleme, die bei der Verwendung dieser Methode aufgetreten sind, und potenzielle Probleme diskutiert.

Protokoll

Die männlichen Ratten wurden in der Animal Care Facility des UMMC untergebracht, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) zugelassen ist. Die Tiere hatten während der gesamten Studie freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Tiere wurden in einer kontrollierten Umgebung mit einer Temperatur von 24 °C bei 2 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 60–80 % und 12 h Licht-/Dunkelzyklen gehalten. Alle Protokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der UMMC genehmigt.

1. Vorbereitung der Ausrüstung

1. Platzieren Sie einen Zweikanal-Differentialelektrometerverstärker (siehe Materialtabelle) in der Nähe der Gefäßkammer und an der gewünschten Stelle.
2. Schließen Sie den Ausgang des Verstärkerkanals A oder B mit einem BNC-BNC-Kabel an den Kanaleingang des Digitizers an.
3. Montieren Sie die Sonde im Mikromanipulator und platzieren Sie sie in der Nähe des Mikroskops und des Myographen. Das Aufnahme-Setup muss auf einem vibrationsfreien Tisch installiert sein.
4. Stellen Sie die Knöpfe und Schalter an der Vorderseite des Verstärkers in Positionen, die ihn für dieses Experiment konfigurieren, wie im Handbuch beschrieben.
5. Verbinden Sie den Badegrund über eine entsprechende Elektrode mit dem Schaltungsboden des Verstärkers. Stellen Sie ebenfalls sicher, dass der Käfig auf das Gehäuse des Verstärkers geerdet ist.

2. Vorbereitung von Mikroelektroden und Montage

1. Verwenden Sie Borosilikatglas-Mikroelektroden (siehe Materialtabelle) und ziehen Sie die Glasspitze, um eine Verjüngung von 8–10 mm, einen Durchmesser von <1 m und einen Widerstand von 80–120 M zu haben, wenn sie mit 3 M KCl gefüllt sind.
   1. Verwenden Sie einen Standard-Puller, um eine kurze allmähliche Verjüngung mit den folgenden Einstellungen zu erreichen: Hitze = 650; Geschwindigkeit = 20; Ziehen = 25; Zeit = 250 und Schleife zweimal für höhere Widerstände und kleinere Spitzen. Siehe Materialtabelle, da die Einstellungen instrumentspezifisch sind.
      HINWEIS: Spitzendurchmesser <1 m verursachen minimale Schäden an der Zelle, wenn sie aufgespießt werden.
2. Füllen Sie die Mikroelektrode mit 3 M KCl mit einer Mikrofaserspritze (siehe Materialtabelle).
   1. Ziehen Sie den Kolben der Mikrofaserspritze langsam nach oben, während Sie den 3 M KCl in die Mikroelektrode injizieren, um Platz für die Flüssigkeit zu geben und die Bildung von Luftblasen innerhalb der Mikroelektrode zu verhindern.
   2. Füllen Sie die Mikroelektrode bis zur Vollentat und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind, bevor Sie sie in den Mikroelektrodenhalter legen. Wenn Blasen vorhanden sind, tippen Sie vorsichtig mit einem Finger auf die Mikroelektrode, um die Blasen zu entfernen.
3. Üben Sie Pflege, drücken Sie den Elektrodenschaft fest in den Halter durch das Bohrloch. Wenn überschüssige Flüssigkeit vorhanden ist, entfernen Sie sie mit einem Gewebe.
4. Schließen Sie die Elektrodenhalterbaugruppe an die Verstärkersonde an. Führen Sie einen Elektrodentest durch, passen Sie den Eingangsversatz an, überprüfen Sie die Nulleinstellung und überprüfen Sie die Leckage des Sondeneingangs gemäß dem Verstärkerhandbuch.
5. Messen Sie den Elektrodenwiderstand mit einem Elektrodentest, wie in Tabelle 1dargestellt.
6. Beachten Sie, dass eine Arbeitselektrode eine positive Dc-Spannungsverschiebung von 1 mV/M a am Kanalausgang anzeigt. Wenn andererseits eine große Spannung am Kanalausgang und am Zähler auftritt, weist dies auf eine blockierte oder defekte Elektrode hin.
7. Öffnen Sie die Aufnahmesoftware, weisen Sie der Datei einen Namen zu und speichern Sie sie für die zukünftige Analyse in einer Speichersoftware.

3. Isolierung und Cannulation der mittleren Zerebralen Arterie

1. Zubereitung der Reagenzien.
   1. Bereiten Sie normale und kalziumarme physiologische Salzlösung (PSS) wie in Tabelle 2beschrieben vor.
2. Bereiten Sie den Myographen vor.
   1. Spülen Sie die Myographenkammer (siehe Materialtabelle) mehrmals mit destilliertem Wasser, um sie frei von Schmutz zu halten. Laden Sie die Kammer mit 5 ml normalem PSS.
   2. Füllen Sie beide Glaskanülen mit gefilterten normalen PSS mit einer 5-10 ml Spritze. Füllen Sie sorgfältig die gesamte Kanüle und die angeschlossenen Schläuche, ohne Luftblasen einzuführen.
   3. Bereiten Sie zwei Monofilament Nylon Nähte (10-0, 0,02 mm) mit einem halben Knoten jeweils mit stumpfen Zangen.
   4. Platzieren Sie die teilweise geschlossenen Nahtknoten auf beiden Kanülen leicht von der Spitze entfernt mit Sezierzangen unter einem Seziermikroskop. Später werden diese Knoten abrutschen und sorgfältig an die kanülierten arteriellen Enden gebunden, um das Gefäß zu sichern.
3. Isolieren und können die mittlere Zerebralparese isolieren.
   1. Induzieren Sie tiefe Anästhesie in einer Sprague Dawley Ratte, indem Sie 2–4% inhaliertes Isofluran verwenden.
   2. Enthaupten Sie die Ratte mit Guillotine unter tiefer Anästhesie.
   3. Entfernen Sie den Schädel vorsichtig mit einem Knochenschneider und einer Schere.
   4. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und legen Sie es in 5 ml niedrigem Kalzium-PSS auf Eis.
   5. Identifizieren und sezieren Sie ein unverzweigtes Segment der mittleren Hirnschlagader (MCA) der Ratte mit einem Innendurchmesser von 100–200 m aus dem Gehirn mit Federschere und Zange.
   6. Montieren Sie den MCA mit feinen Zangen auf die Glaskanülen und sichern Sie die Nähte im Myographen, der normale PSS enthält.
   7. Schließen Sie die distale Kanüle, damit innerhalb der WAB kein Fluss entsteht.
   8. Schließen Sie die Zuflusspipette an ein Reservoir mit PSS an, um die Kontrolle des intraluminalen Drucks zu ermöglichen, der mit einem Inline-Druckwandler überwacht wird.
   9. Visualisieren Sie die kanülierten MCAs mit einer ladungsgekoppelten Gerätekamera (siehe Materialtabelle),die auf einem invertierten Mikroskop und einer Bildverarbeitungssoftware montiert ist.
   10. Stellen Sie die axiale Länge des MCA auf eine ungefähre Länge ein, in der sie weder starr noch schlaff erscheinen sollte.
   11. Ausgleich der Badlösung mit O₂ (95%) und CO₂ (5%) bei 37 °C, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung, Temperatur und pH-Wert bei 7,4 zu gewährleisten.
4. Impale (durchdringen Sie die Zellplasmamembran) die vaskulären glatten Muskelzellen.
   1. Schließen Sie die Masseelektrode an und halten Sie sie in der PSS des Myographen eingetaucht.
   2. Beleuchten Sie die Gefäßkammer und schauen Sie durch das Mikroskop, um die Spitze der Mikroelektrode in der Badlösung zu visualisieren.
      HINWEIS: Alternativ kann man die MCA und Mikroelektrode auf einem Computer mit einer Bildverarbeitungssoftware visualisieren.
   3. Verwenden Sie die Steuerung des Mikromanipulators, um die Spitze der Mikroelektrode in der Nähe der Außenwand des Blutgefäßes zu bewegen. Der Mikromanipulator und die Spitze der Mikroelektrode müssen sich in einer stabilen Position in Bezug auf das Gewebe befinden.
      HINWEIS: Bestätigen Sie vor Beginn der Experimente, dass sich die Membranspannung stabilisiert hat. Wenn die gemessene Spannung instabil ist, wird die Verbindung zwischen der Elektrode und der Zelle nicht abgedichtet, was auf ein Leck hindeutet.
   4. Beginnen Sie die Aufzeichnung.
   5. Bewegen Sie langsam die Spitze der Mikroelektrode in Richtung des Behälters, mit Blick auf die Mitte des Gefäßes mit Kurs oder feiner Kontrolle des Mikromanipulators.
      HINWEIS: Gelegentlich kann eine kleine Durchbiegung in der Aufzeichnung beobachtet werden, wenn die Mikroelektrodenspitze eine Muskelfasermembran kontaktiert.
   6. Wenn die Spitze in unmittelbarer Nähe zum Gefäß kommt, bringen Sie die Elektrode in einer schnellen Bewegung vorwärts, indem Sie den Mikromanipulator verwenden, um die Membran des Muskels zu aufpalest.
   7. An dieser Stelle kann man beginnen, die Änderungen in V_m zu beobachten, die aufgezeichnet werden. Berühren Sie den Mikromanipulator nicht, wenn die Mikroelektrode die Membran der Zelle aufspießt.
      HINWEIS: Der Spannungsunterschied zwischen der Aufnahme- und Referenzelektrode verringert sich von 0 mV auf -40 mV und -75 mV, abhängig vom Grad des intravaskulären Drucks oder anderen erregenden oder hemmenden Reizen. Diese Messwerte charakterisieren den Transmembranpotentialunterschied der aktuellen Zelle.
   8. Führen Sie mehrere Verbesserungen auf einem einzigen Schiff in verschiedenen Bereichen des Schiffes durch, ohne VSMCs zu beschädigen, um genaue Messungen zu erhalten.
   9. Nach der Aufnahme verwenden Sie den Manipulator, um die Mikroelektrode in einer schnellen Bewegung zu entfernen.
   10. Beenden Sie die Aufzeichnung und speichern Sie Datendateien zur weiteren Analyse.

Ergebnisse

Die vorgestellte Methode kann zuverlässig zur Aufzeichnung von V_m in kanülierten Gefäßen eingesetzt werden. Eine kurze Prozedur, die beschreibt, wie MCA aus dem Gehirn isoliert werden kann, ist in Abbildung 1Adargestellt. Nach der Trennung des Gehirns vom Schädel wurde das MCA seziert und in eine Petrischale mit niedrigem Kalzium-PSS gelegt. Ein Teil des anhaftenden Bindegewebes wurde zusammen mit MCA mit Federschere und Zange seziert, um eine...

Diskussion

Dieser Artikel enthält die notwendigen Schritte, wie eine scharfe Mikroelektroden-Impalement-Methode verwendet werden kann, um V_m aus einer kanülierten Gefäßzubereitung aufzuzeichnen. Diese Methode ist weit verbreitet und bietet qualitativ hochwertige, konsistente Aufnahmen von V_m, die eine Vielzahl von experimentellen Fragen beantworten.

Einige kritische Überlegungen und Schritte zur Fehlerbehebung werden hier beschrieben, um den Erfolg der Methode sicherzustellen. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser	Parkland scientific	V3000PK
Dissection microscope	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer Bone Cutter	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps	Fine science tools	11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt	Fine science tools	14008-14
Suture	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas Spring Scissors	Fine science tools	15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera	Qimaging, , BC	Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier	WPI	FD223A
In-line pressure transducer	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelectrodes	Warner Instruments LLC, CT	G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe)	WPI	MF28G67-5
Microelectrode holder	WPI	MEH1SF
Myograph	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
Puller	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
Vibration-free table	TMC	3435-14
Softwares
Clampex 10	Molecular devices
p Clamp 10	Molecular devices
Imaging software	Nikon, NY	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
Glucose	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761