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Method Article
Das primäre Ziel dieses Artikels ist es, Details darüber zu liefern, wie Membranpotenzial (Vm) aus der mittleren Zerebrale mit der Mikroelektroden-Impalement-Methode aufzuzeichnen ist. Die kanülierte mittlere Hirnarterie wird ausgeglichen, um myogenen Ton zu erhalten, und die Gefäßwand wird mit hochwiderstandigen Mikroelektroden aufgespießt.
Membranpotential (Vm) von vaskulären glatten Muskelzellen bestimmt den Gefäßtonund und damit den Blutfluss zu einem Organ. Veränderungen in der Expression und Funktion von Ionenkanälen und elektrogenen Pumpen, die Vm bei Krankheitszuständen regulieren, könnten möglicherweise Vm,Gefäßtonus und Blutfluss verändern. Daher sind ein grundlegendes Verständnis der Elektrophysiologie und die Methoden, die notwendig sind, um Vm in gesunden und kranken Zuständen genau aufzuzeichnen, unerlässlich. Diese Methode ermöglicht die Modulation von Vm mit verschiedenen pharmakologischen Mitteln zur Wiederherstellung von Vm. Obwohl es mehrere Methoden gibt, jede mit ihren Vor- und Nachteilen, bietet dieser Artikel Protokolle zur Aufzeichnung von Vm aus kanülierten Widerstandsgefäßen wie der mittleren Zerebralparese mit der Mikroelektroden-Impalement-Methode. Mittlere Hirnarterien dürfen in einer Myographenkammer myogenen Ton erhalten, und die Gefäßwand wird mit hochwiderstandsstarken Mikroelektroden aufgespießt. Das V m-Signal wird über ein Elektrometer erfasst, digitalisiert und analysiert. Diese Methode ermöglicht ein genaues Ablesen des Vm einer Gefäßwand, ohne die Zellen zu beschädigen und ohne den Membranwiderstand zu verändern.
Das Membranpotential (Vm) einer Zelle bezieht sich auf den relativen Unterschied der ionischen Ladung über die Plasmamembran und die relative Durchlässigkeit der Membran zu diesen Ionen. Der Vm wird durch die Differenzverteilung der Ionen erzeugt und durch Ionenkanäle und Pumpen aufrechterhalten. Ionenkanäle wie K+, Na+, und Cl- tragen wesentlich zum ruhenden Vmbei. Vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) exprimieren mehr als vier verschiedene Arten von K+ Kanäle1, zwei Arten von spannungsgegated Ca2+ Kanälen (VGCC)2, mehr als zwei Arten von Cl - Kanäle3, 4 , 5, speicherbetriebene Ca2+ Kanäle6, Stretch-aktivierte Kationenkanäle7,8und elektrogene Natrium-Kalium-ATPase-Pumpen9 in ihren Plasmamembranen, die alle an der Regulierung von Vmbeteiligt sind.
Der Vm von VSMCs hängt vom Lumendruck ab. In nicht unter Druck stehenden Gefäßen variiert Vm von -50 bis -65 mV, in Druckarteriensegmenten reicht Vm jedoch von -37 bis -47 mV10. Die Erhöhung des intravaskulären Drucks bewirkt, dass VSMCs11depolarisieren, den Schwellenwert für die VGCC-Öffnung verringern und den Kalziumzufluss erhöhen, der zur Entwicklung des myogenen Tonsbeiträgt 12. Im Gegenteil, in passiven oder nicht unter Druck stehenden Gefäßen wird die Membranhyperpolarisation aufgrund der hohen K +-Kanalaktivität verhindern, dass sich VGCC öffnet, was zu einem begrenzten Kalziumeintrag und einer Abnahme des intrazellulären Kalziums führt, was zu weniger Gefäßton13. Somit scheint Vm aufgrund von Veränderungen des Lumendrucks eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung des Gefäßtonons zu spielen, und sowohl VGCC- als auch K +-Kanäle spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Vm.
Vm variiert je nach Schiffstyp und Art. Vm ist -54 x 1,3 mV in Meerschweinchen überlegene meenterische arterielle Streifen14, -45 x 1 mV in den mittleren Hirnarterien der Ratte bei 60 mmHg Lumendruck12, und -35 x 1 mV in Rattenparenchymalarterien bei 40 mmHg Lumendruck15. Der ruhende Vm, der im ungestreckten Lymphmuskel der Ratte aufgezeichnet wird, beträgt -48 x 2 mV16. Vm zerebraler VSMCs ist negativer als in peripheren Arterien. Im Vergleich dazu wurden feline mittlere Hirnarterien mit einem Vm von etwa -70 mV berichtet, während mesentäre und koronare Arterien mit -49 bzw. -58 mV bzw.17,18berichtet enden. Unterschiede im Vm über Gefäßbetten können die Unterschiede in der Expression und Funktion von Ionenkanälen und elektrogenen Natrium-Kaliumpumpen widerspiegeln.
Erhöhungen und Abnahmen von Vm werden als Membrandepolarisation bzw. Hyperpolarisation bezeichnet. Diese Veränderungen in Vm spielen eine zentrale Rolle in vielen physiologischen Prozessen, einschließlich Ionenkanalgating, Zellsignalisierung, Muskelkontraktion, und Aktion potenzielle Ausbreitung. Bei einem festen Druck verursachen viele endogene und synthetische Vasodilatatorverbindungen, die K+ Kanäle aktivieren, eine Membranhyperpolarisation, was zu Einer Vasodilatation1,13führt. Umgekehrt ist eine nachhaltige Membrandepolarisation bei agonistisch-induzierter oder rezeptorvermittelter Vasokonstriktion19von entscheidender Bedeutung. Vm ist eine kritische Variable, die nicht nur den Zustrom von Ca2+ durch VGCC13 reguliert, sondern auch die Freisetzung von Ca2+ aus den internen Lagern20,21 und Ca2+-Empfindlichkeit von die kontraktive Vorrichtung22.
Zwar gibt es mehrere Methoden zur Erfassung von Vm aus verschiedenen Zelltypen, aber die Daten, die aus der Mikroelektroden-Imprägemethode von kanülierten Gefäßen gesammelt wurden, scheinen physiologischer zu sein als Daten, die von isolierten VSMCs gewonnen wurden. Bei aufnahme von isoliertem VSMC mit aktuellen Klemmmethoden wird Vm als spontane transiente Hyperpolarisation in VSMCs24angesehen. Isolierte VSMCs befinden sich nicht im Syncytium, und die Änderungen im Serienwiderstand können zum Oszillatorverhalten von Vmbeitragen. Andererseits wird das Oszillationsverhalten nicht beobachtet, wenn Vm von intakten Gefäßen aufgezeichnet wird, wahrscheinlich aufgrund des Zell-Zell-Kontakts zwischen VSMCs, die sich in der Arterie im Syncytium befinden und im gesamten Gefäß summiert werden, was zu einem stabilen Vm führt. 24. Somit ist die Messung von Vm von Druckgefäßen mit Standard-Mikroelektroden-Impalement-Technik relativ nahe an den physiologischen Bedingungen.
Die Aufnahme von Vm von kanülierten Gefäßen könnte wichtige Informationen liefern, da Vm von VSMCs, die in Syncytium sind, eine der wichtigsten Determinanten des Gefäßtons und des Blutflusses ist und die Modulation des Vm eine Möglichkeit bieten könnte, Verengung der Blutgefäße. Daher ist es wichtig, die Methodik zu verstehen, die bei der Erfassung von Vmerforderlich ist. Dieser Artikel beschreibt die intrazelluläre Aufzeichnung von Vm aus kanülierten mittleren Hirnarterien (MCAs) mit einer Mikroelektroden-Impalement-Methode. Dieses Protokoll beschreibt, wie McAs, Mikroelektroden, die Einrichtung des Elektrometers und die Impalement-Methode zur Aufzeichnung von Vmdurchgeführt werden. Darüber hinaus werden repräsentative Daten, häufige Probleme, die bei der Verwendung dieser Methode aufgetreten sind, und potenzielle Probleme diskutiert.
Die männlichen Ratten wurden in der Animal Care Facility des UMMC untergebracht, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) zugelassen ist. Die Tiere hatten während der gesamten Studie freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Tiere wurden in einer kontrollierten Umgebung mit einer Temperatur von 24 °C bei 2 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 60–80 % und 12 h Licht-/Dunkelzyklen gehalten. Alle Protokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der UMMC genehmigt.
1. Vorbereitung der Ausrüstung
2. Vorbereitung von Mikroelektroden und Montage
3. Isolierung und Cannulation der mittleren Zerebralen Arterie
Die vorgestellte Methode kann zuverlässig zur Aufzeichnung von Vm in kanülierten Gefäßen eingesetzt werden. Eine kurze Prozedur, die beschreibt, wie MCA aus dem Gehirn isoliert werden kann, ist in Abbildung 1Adargestellt. Nach der Trennung des Gehirns vom Schädel wurde das MCA seziert und in eine Petrischale mit niedrigem Kalzium-PSS gelegt. Ein Teil des anhaftenden Bindegewebes wurde zusammen mit MCA mit Federschere und Zange seziert, um eine...
Dieser Artikel enthält die notwendigen Schritte, wie eine scharfe Mikroelektroden-Impalement-Methode verwendet werden kann, um Vm aus einer kanülierten Gefäßzubereitung aufzuzeichnen. Diese Methode ist weit verbreitet und bietet qualitativ hochwertige, konsistente Aufnahmen von Vm, die eine Vielzahl von experimentellen Fragen beantworten.
Einige kritische Überlegungen und Schritte zur Fehlerbehebung werden hier beschrieben, um den Erfolg der Methode sicherzustellen. ...
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Diese Arbeit wurde teilweise durch Stipendien des Intramural Support Research Program (IRSP) von UMMC, AHA Scientist Development Grant (13SDG14000006) an Mallikarjuna R. Pabbidi unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dissection instruments | |||
Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
Electrophysiology Instruments | |||
Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
Softwares | |||
Clampex 10 | Molecular devices | ||
p Clamp 10 | Molecular devices | ||
Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
Chemicals | |||
NaCl | Sigma | S7653 | |
KCl | Sigma | P4504 | |
MgSO4 | Sigma | M7506 | |
CaCl2 | Sigma | C3881 | |
HEPES | Sigma | H7006 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 |
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