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Method Article
El objetivo principal de este artículo es proporcionar detalles de cómo registrar el potencial de membrana (Vm) de la arteria cerebral media utilizando el método de empallamiento de microelectrodos. La arteria cerebral media canulada se equilibra para obtener tono miogénico, y la pared del vaso se empala usando microelectrodos de alta resistencia.
El potencial de membrana (Vm) de las células musculares lisas vasculares determina el tono de los vasos y, por lo tanto, el flujo sanguíneo a un órgano. Los cambios en la expresión y función de los canales iónicos y las bombas electrogénicas que regulan el Vm en condiciones de enfermedad podrían alterar potencialmente la Vm,el tono vascular y el flujo sanguíneo. Por lo tanto, una comprensión básica de la electrofisiología y los métodos necesarios para registrar con precisión Vm en estados sanos y enfermos son esenciales. Este método permitirá modular Vm utilizando diferentes agentes farmacológicos para restaurar Vm. Aunque existen varios métodos, cada uno con sus ventajas y desventajas, este artículo proporciona protocolos para registrar Vm de vasos de resistencia cannulados como la arteria cerebral media utilizando el método de empalado de microelectrodos. Las arterias cerebrales medias pueden obtener tono miogénico en una cámara de miógrafo, y la pared del vaso se empaló utilizando microelectrodos de alta resistencia. La señal Vm se recoge a través de un electrómetro, se digitaliza y se analiza. Este método proporciona una lectura precisa del Vm de la pared de un recipiente sin dañar las células y sin cambiar la resistencia de la membrana.
El potencial de membrana (Vm) de una célula se refiere a la diferencia relativa de carga iónica a través de la membrana plasmática y la permeabilidad relativa de la membrana a estos iones. El Vm es generado por la distribución diferencial de iones y es mantenido por canales iónicos y bombas. Los canales de iones como K+, Na+, y Clcontribuyen sustancialmente al resto de Vm. Las células musculares lisas vasculares (VSCM) expresan más de cuatro tipos diferentes de K+ canales1, dos tipos de canales Ca2+ con voltaje cerrado (VGCC)2, más de dos tipos de Cl- canales3, 4 , 5, Ca2+ canales6accionados por almacén , canales catión7 activados por estiramiento7,8y bombas electrogénicas ATPass de sodio-potasio9 en sus membranas plasmáticas, todas las cuales pueden ser implicados en la regulación de Vm.
El Vm de los VSMC depende de la presión del lumen. En recipientes no presurizados, Vm varía de -50 a -65 mV, sin embargo, en segmentos arteriales presurizados, Vm oscila entre -37 y -47 mV10. La elevación de la presión intravascular hace que los VSCM despolarizen11, disminuye el umbral de apertura del VGCC y aumenta la afluencia de calcio contribuyendo al desarrollo del tono miogénico12. Por el contrario, en los vasos pasivos o no presurizados, la hiperpolarización de la membrana, debido a la alta actividad del canal K+, evitará que el VGCC se abra, lo que resulta en una entrada limitada de calcio y una disminución del calcio intracelular, contribuyendo a tono vascular13. Por lo tanto, Vm debido a los cambios en la presión lumen parece desempeñar un papel esencial en el desarrollo del tono vascular, y tanto los canales VGCC y K+ juegan un papel crucial en la regulación de Vm.
Vm varía según el tipo de recipiente y la especie. Vm es de -54 x 1,3 mV en tiras arteriales mesentéricas superiores de conejillo de indias14, -45 x 1 mV en las arterias cerebrales medias de rata a 60 mmHg de presión lumen12,y -35 x 1 mV en arterias parénquimas de rata a 40 mmHg de presión de lúmenes15. El Vm en reposo registrado en el músculo linfático de rata sin estirar es de -48 a 2 mV16. Vm de VSMCs cerebrales es más negativo que en las arterias periféricas. En comparación, se informó que las arterias cerebrales medias felinas tienen un Vm de aproximadamente -70 mV, mientras que las arterias mesentéricas y coronarias fueron reportadas a -49 y -58 mV, respectivamente17,18. Las diferencias en el Vm entre los lechos vasculares pueden reflejar las diferencias en la expresión y función de los canales iónicos y las bombas electrogénicas de sodio-potasio.
Los aumentos y disminuciones en Vm se conocen como despolarización de membrana e hiperpolarización, respectivamente. Estas alteraciones en Vm juegan un papel central en muchos procesos fisiológicos, incluyendo gating de canal iónico, señalización celular, contracción muscular, y propagación potencial de acción. A una presión fija, muchos compuestos vasodilatadores endógenos y sintéticos que activan los canales K+ causan hiperpolarización de la membrana, lo que resulta en vasodilatación1,13. Por el contrario, la despolarización sostenida de la membrana es vital enla vasoconstricción 19 inducida por agonistas o mediada por receptores. Vm es una variable crítica que no sólo regula la afluencia Ca2+ a través de VGCC13, sino que también influye en la liberación de Ca2+ de las tiendas internas20,21 y Ca2+-sensibilidad de el aparato contractilo22.
Si bien existen varios métodos para registrar Vm de diferentes tipos de células, los datos recopilados del método de empallado de microelectrodos de los recipientes cannulados parecen ser más fisiológicos que los datos obtenidos de VSMC aislados. Cuando se registra desde VSMC aislado utilizando métodos de abrazadera de corriente, Vm se ve como hiperpolarizaciones transitorias espontáneas en VSMc24. Los VSMC aislados no están en el sincitio, y los cambios en la resistencia de la serie pueden contribuir al comportamiento oscilatorio de Vm. Por otro lado, el comportamiento oscilatorio no se observa cuando se registra Vm de vasos intactos, probablemente debido al contacto celular entre VSMCs que están en sincitio en la arteria y se suman en todo el recipiente que conduce a un Vm estable 24. Por lo tanto, la medición de Vm de recipientes presurizados utilizando la técnica estándar de empalacimiento de microelectrodos es relativamente cercana a las condiciones fisiológicas.
La grabación de Vm de los vasos cannulados podría proporcionar información vital, ya que el Vm de VSMCs que están en sincitio es uno de los principales determinantes del tono vascular y el flujo sanguíneo, y la modulación del Vm podría proporcionar una manera de dilatar o restringir los vasos sanguíneos. Por lo tanto, es esencial entender la metodología implicada en la grabación de Vm. Este artículo describe el registro intracelular de Vm de las arterias cerebrales medias cannuadas (MCA) utilizando un método de empallamiento de microelectrodos. Este protocolo describirá cómo preparar MCA, microelectrodos, configurar el electrómetro y realizar el método de empalamiento para grabar Vm. Además, se discuten los datos representativos, los problemas comunes que se encontraron al usar este método y los posibles problemas.
Las ratas macho fueron alojados en el Centro de Cuidado Animal de la UMMC, que está aprobado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado Animal de Laboratorio (AAALAC). Los animales tuvieron libre acceso a alimentos y agua durante todo el estudio. Los animales se mantuvieron en un ambiente controlado con una temperatura de 24oC, niveles de humedad del 60-80% y ciclos de luz/oscuridad de 12 h. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la UMMC.
1. Preparación de equipos
2. Preparación de Microelectrodos y Montaje
3. Aislamiento y cannulación de la arteria cerebral media
El método presentado se puede utilizar de forma fiable para grabar Vm en recipientes canulados. En la Figura 1Ase presenta un breve procedimiento que describe cómo aislar la MCA del cerebro. Después de separar el cerebro del cráneo, el MCA fue diseccionado y colocado en una placa de Petri que contiene PSS de calcio bajo. Parte del tejido conectivo que se unía también se diseccionó junto con MCA usando tijeras de resorte y fórceps para evita...
Este artículo proporciona los pasos necesarios sobre cómo utilizar un método de empalamiento de microelectrodos nítidos para registrar Vm desde la preparación de un recipiente cannulado. Este método es ampliamente utilizado, y ofrece grabaciones consistentes y de alta calidad de Vm que responden a una amplia gama de preguntas experimentales.
Algunas consideraciones críticas y pasos de solución de problemas se describen aquí para garantizar el éxito del método. ...
Los autores no tienen nada que revelar.
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Programa de Investigación de Apoyo Intramural (IRSP) de la UMMC, AHA Scientist Development Grant (13SDG14000006) otorgada a Mallikarjuna R. Pabbidi.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dissection instruments | |||
Aneshetic Vaporiser | Parkland scientific | V3000PK | |
Dissection microscope | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
Littauer Bone Cutter | Fine science tools | 16152-15 | |
Moria MC40 Ultra Fine Forceps | Fine science tools | 11370-40 | |
Surgical scissors Sharp-Blunt | Fine science tools | 14008-14 | |
Suture | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
Vannas Spring Scissors | Fine science tools | 15018-10 | |
Electrophysiology Instruments | |||
Charge-coupled device camera | Qimaging, , BC | Retiga 2000R | |
Differential electrometer amplifier | WPI | FD223A | |
In-line pressure transducer | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
Micromanipulator | Thor labs | PCS-5400 | |
Microelectrodes | Warner Instruments LLC, CT | G200-6, | |
Micro Fil (Microfiber syringe) | WPI | MF28G67-5 | |
Microelectrode holder | WPI | MEH1SF | |
Myograph | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
Puller | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
Vibration-free table | TMC | 3435-14 | |
Softwares | |||
Clampex 10 | Molecular devices | ||
p Clamp 10 | Molecular devices | ||
Imaging software | Nikon, NY | NIS-elements | |
Chemicals | |||
NaCl | Sigma | S7653 | |
KCl | Sigma | P4504 | |
MgSO4 | Sigma | M7506 | |
CaCl2 | Sigma | C3881 | |
HEPES | Sigma | H7006 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 |
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