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  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El objetivo principal de este artículo es proporcionar detalles de cómo registrar el potencial de membrana (Vm) de la arteria cerebral media utilizando el método de empallamiento de microelectrodos. La arteria cerebral media canulada se equilibra para obtener tono miogénico, y la pared del vaso se empala usando microelectrodos de alta resistencia.

Resumen

El potencial de membrana (Vm) de las células musculares lisas vasculares determina el tono de los vasos y, por lo tanto, el flujo sanguíneo a un órgano. Los cambios en la expresión y función de los canales iónicos y las bombas electrogénicas que regulan el Vm en condiciones de enfermedad podrían alterar potencialmente la Vm,el tono vascular y el flujo sanguíneo. Por lo tanto, una comprensión básica de la electrofisiología y los métodos necesarios para registrar con precisión Vm en estados sanos y enfermos son esenciales. Este método permitirá modular Vm utilizando diferentes agentes farmacológicos para restaurar Vm. Aunque existen varios métodos, cada uno con sus ventajas y desventajas, este artículo proporciona protocolos para registrar Vm de vasos de resistencia cannulados como la arteria cerebral media utilizando el método de empalado de microelectrodos. Las arterias cerebrales medias pueden obtener tono miogénico en una cámara de miógrafo, y la pared del vaso se empaló utilizando microelectrodos de alta resistencia. La señal Vm se recoge a través de un electrómetro, se digitaliza y se analiza. Este método proporciona una lectura precisa del Vm de la pared de un recipiente sin dañar las células y sin cambiar la resistencia de la membrana.

Introducción

El potencial de membrana (Vm) de una célula se refiere a la diferencia relativa de carga iónica a través de la membrana plasmática y la permeabilidad relativa de la membrana a estos iones. El Vm es generado por la distribución diferencial de iones y es mantenido por canales iónicos y bombas. Los canales de iones como K+, Na+, y Clcontribuyen sustancialmente al resto de Vm. Las células musculares lisas vasculares (VSCM) expresan más de cuatro tipos diferentes de K+ canales1, dos tipos de canales Ca2+ con voltaje cerrado (VGCC)2, más de dos tipos de Cl- canales3, 4 , 5, Ca2+ canales6accionados por almacén , canales catión7 activados por estiramiento7,8y bombas electrogénicas ATPass de sodio-potasio9 en sus membranas plasmáticas, todas las cuales pueden ser implicados en la regulación de Vm.

El Vm de los VSMC depende de la presión del lumen. En recipientes no presurizados, Vm varía de -50 a -65 mV, sin embargo, en segmentos arteriales presurizados, Vm oscila entre -37 y -47 mV10. La elevación de la presión intravascular hace que los VSCM despolarizen11, disminuye el umbral de apertura del VGCC y aumenta la afluencia de calcio contribuyendo al desarrollo del tono miogénico12. Por el contrario, en los vasos pasivos o no presurizados, la hiperpolarización de la membrana, debido a la alta actividad del canal K+, evitará que el VGCC se abra, lo que resulta en una entrada limitada de calcio y una disminución del calcio intracelular, contribuyendo a tono vascular13. Por lo tanto, Vm debido a los cambios en la presión lumen parece desempeñar un papel esencial en el desarrollo del tono vascular, y tanto los canales VGCC y K+ juegan un papel crucial en la regulación de Vm.

Vm varía según el tipo de recipiente y la especie. Vm es de -54 x 1,3 mV en tiras arteriales mesentéricas superiores de conejillo de indias14, -45 x 1 mV en las arterias cerebrales medias de rata a 60 mmHg de presión lumen12,y -35 x 1 mV en arterias parénquimas de rata a 40 mmHg de presión de lúmenes15. El Vm en reposo registrado en el músculo linfático de rata sin estirar es de -48 a 2 mV16. Vm de VSMCs cerebrales es más negativo que en las arterias periféricas. En comparación, se informó que las arterias cerebrales medias felinas tienen un Vm de aproximadamente -70 mV, mientras que las arterias mesentéricas y coronarias fueron reportadas a -49 y -58 mV, respectivamente17,18. Las diferencias en el Vm entre los lechos vasculares pueden reflejar las diferencias en la expresión y función de los canales iónicos y las bombas electrogénicas de sodio-potasio.

Los aumentos y disminuciones en Vm se conocen como despolarización de membrana e hiperpolarización, respectivamente. Estas alteraciones en Vm juegan un papel central en muchos procesos fisiológicos, incluyendo gating de canal iónico, señalización celular, contracción muscular, y propagación potencial de acción. A una presión fija, muchos compuestos vasodilatadores endógenos y sintéticos que activan los canales K+ causan hiperpolarización de la membrana, lo que resulta en vasodilatación1,13. Por el contrario, la despolarización sostenida de la membrana es vital enla vasoconstricción 19 inducida por agonistas o mediada por receptores. Vm es una variable crítica que no sólo regula la afluencia Ca2+ a través de VGCC13, sino que también influye en la liberación de Ca2+ de las tiendas internas20,21 y Ca2+-sensibilidad de el aparato contractilo22.

Si bien existen varios métodos para registrar Vm de diferentes tipos de células, los datos recopilados del método de empallado de microelectrodos de los recipientes cannulados parecen ser más fisiológicos que los datos obtenidos de VSMC aislados. Cuando se registra desde VSMC aislado utilizando métodos de abrazadera de corriente, Vm se ve como hiperpolarizaciones transitorias espontáneas en VSMc24. Los VSMC aislados no están en el sincitio, y los cambios en la resistencia de la serie pueden contribuir al comportamiento oscilatorio de Vm. Por otro lado, el comportamiento oscilatorio no se observa cuando se registra Vm de vasos intactos, probablemente debido al contacto celular entre VSMCs que están en sincitio en la arteria y se suman en todo el recipiente que conduce a un Vm estable 24. Por lo tanto, la medición de Vm de recipientes presurizados utilizando la técnica estándar de empalacimiento de microelectrodos es relativamente cercana a las condiciones fisiológicas.

La grabación de Vm de los vasos cannulados podría proporcionar información vital, ya que el Vm de VSMCs que están en sincitio es uno de los principales determinantes del tono vascular y el flujo sanguíneo, y la modulación del Vm podría proporcionar una manera de dilatar o restringir los vasos sanguíneos. Por lo tanto, es esencial entender la metodología implicada en la grabación de Vm. Este artículo describe el registro intracelular de Vm de las arterias cerebrales medias cannuadas (MCA) utilizando un método de empallamiento de microelectrodos. Este protocolo describirá cómo preparar MCA, microelectrodos, configurar el electrómetro y realizar el método de empalamiento para grabar Vm. Además, se discuten los datos representativos, los problemas comunes que se encontraron al usar este método y los posibles problemas.

Protocolo

Las ratas macho fueron alojados en el Centro de Cuidado Animal de la UMMC, que está aprobado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado Animal de Laboratorio (AAALAC). Los animales tuvieron libre acceso a alimentos y agua durante todo el estudio. Los animales se mantuvieron en un ambiente controlado con una temperatura de 24oC, niveles de humedad del 60-80% y ciclos de luz/oscuridad de 12 h. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la UMMC.

1. Preparación de equipos

  1. Coloque un amplificador de electrometro diferencial de doble canal (consulte la Tabla de materiales)cerca de la cámara del recipiente y en la ubicación deseada.
  2. Conecte la salida del canal del amplificador A o B a la entrada de canal del digitalizador con un cable BNC-BNC.
  3. Monte la sonda en el micromanipulador y colóquela cerca del microscopio y del miógrafo. La configuración de grabación debe instalarse en una mesa sin vibraciones.
  4. Coloque las perillas y los interruptores en la parte frontal del amplificador en las posiciones que lo configuran para este experimento como se describe en el manual.
  5. Conecte el suelo del baño a la tierra del circuito del amplificador a través de un electrodo adecuado. Del mismo modo, asegúrese de que la jaula esté conectada a tierra al chasis del amplificador.

2. Preparación de Microelectrodos y Montaje

  1. Utilice microelectrodos de vidrio de borosilicato (ver la Tabla de Materiales) y tire de la punta de vidrio para tener un cónico de 8-10 mm, diámetro de <1 m y resistencia de 80-120 M cuando se llena con 3 M KCl.
    1. Utilice un tirador estándar para lograr un cono gradual corto utilizando los siguientes ajustes: calor 650; velocidad 20; tirar 25; tiempo 250 y bucle dos veces para mayores resistencias y puntas más pequeñas. Consulte la Tabla de materiales, ya que los ajustes son específicos del instrumento.
      NOTA: Los diámetros de la punta <1 m causarán un daño mínimo a la celda cuando se empala.
  2. Llene el microelectrodo con 3 M DeKCl utilizando una jeringa de microfibra (ver la Tabla de Materiales).
    1. Tire lentamente del émbolo de la jeringa de microfibra hacia arriba mientras inyecta el KCl de 3 M en el microelectrodo para permitir que el fluido se llene y para evitar la formación de burbujas de aire dentro del microelectrodo.
    2. Llene el microelectrodo hasta que esté lleno y asegúrese de que no haya burbujas de aire antes de colocarlo en el soporte del microelectrodo. Si hay burbujas, toque suavemente el microelectrodo con un dedo para eliminar las burbujas.
  3. Ejerciendo cuidado, empuje firmemente el vástago del electrodo en el soporte a través del agujero perforado. Si hay exceso de líquido, retírelo con un pañuelo de papel.
  4. Conecte el conjunto del soporte del electrodo a la sonda del amplificador. Realice una prueba de electrodos, ajuste el desplazamiento de entrada, verifique la configuración cero y compruebe la fuga de entrada de la sonda según el manual del amplificador.
  5. Mida la resistencia de los electrodos mediante una prueba de electrodos como se muestra en la Tabla1.
  6. Tenga en cuenta que un electrodo de trabajo muestra un desplazamiento de voltaje de CC positivo de 1 mV/M en la salida del canal. Por otro lado, si aparece una tensión grande en la salida del canal y en el medidor, esto indica un electrodo bloqueado o roto.
  7. Abra el software de grabación, asigne un nombre al archivo y guárdelo para su análisis futuro en un software de almacenamiento.

3. Aislamiento y cannulación de la arteria cerebral media

  1. Preparar los reactivos.
    1. Preparar la solución de sal fisiológica (PSS) normal y baja en calcio como se describe en la Tabla2.
  2. Preparen el miógrafo.
    1. Enjuague la cámara de miógrafo (ver la Tabla de Materiales)con agua destilada varias veces para mantenerla libre de residuos. Cargue la cámara con 5 ml de PSS normal.
    2. Llene ambas cánulas de vidrio con PSS normal filtrada utilizando una jeringa de 5-10 ml. Llene cuidadosamente toda la cánula y el tubo adjunto sin introducir burbujas de aire.
    3. Preparar dos suturas de nylon monofilamento (10-0, 0.02 mm) con medio nudo cada una usando fórceps contundentes.
    4. Coloque los nudos de sutura parcialmente cerrados en ambas cánulas ligeramente lejos de la punta usando fórceps de disección bajo un microscopio de disección. Más tarde estos nudos se deslizarán y se atarán cuidadosamente en los extremos arteriales canulados para asegurar el vaso.
  3. Aísle y cinrara la arteria cerebral media.
    1. Inducir anestesia profunda en una rata Sprague Dawley mediante el uso de 2-4% de isoflurano inhalado.
    2. Decapitar a la rata usando guillotina bajo anestesia profunda.
    3. Retire cuidadosamente el cráneo con un cortador de huesos y una tijera.
    4. Retire el cerebro del cráneo y colóquelo en 5 ml de PSS bajo en calcio sobre hielo.
    5. Identificar y diseccionar un segmento no ramificado de la arteria cerebral media de rata (MCA) con un diámetro interno de 100–200 m del cerebro usando tijeras de resorte y fórceps.
    6. Monte el MCA en las cánulas de vidrio con fórceps finos y asegúrelo apretando las suturas en el miógrafo que contiene PSS normal.
    7. Cierre la cánula distal de modo que no haya flujo dentro de los MCA.
    8. Conecte la pipeta de entrada a un depósito que sostenga PSS para permitir el control de la presión intraluminal que se controlará con un transductor de presión en línea.
    9. Visualice los MCA cannulados utilizando una cámara de dispositivo acoplada por carga (consulte la Tabla de materiales)montada en un microscopio invertido y un software de imágenes.
    10. Establezca la longitud axial del MCA en una longitud aproximada donde no debería aparecer ni rígida ni flácida.
    11. Equilibrar la solución de baño con O2 (95%) y CO2 (5%) a 37 oC para proporcionar una oxigenación adecuada, temperatura y mantener el pH a 7,4.
  4. Empalar (penetrar en la membrana plasmática celular) las células musculares lisas vasculares.
    1. Conecte el electrodo de tierra y manténgalo sumergido en el PSS del miógrafo.
    2. Ilumina la cámara del recipiente y mira a través del microscopio para visualizar la punta del microelectrodo en la solución de baño.
      NOTA: Alternativamente, se puede visualizar el MCA y el microelectrodo en un ordenador que tiene un software de imágenes.
    3. Utilice los controles del micromanipulador para mover la punta del microelectrodo cerca de la pared externa del vaso sanguíneo. El micromanipulador y la punta del microelectrodo deben estar en una posición estable en relación con el tejido.
      NOTA: Antes de comenzar los experimentos, confirme que el voltaje de la membrana se ha estabilizado. Si la tensión medida es inestable, la conexión entre el electrodo y la célula no está sellada, lo que indica una fuga.
    4. Comience la grabación.
    5. Mueva lentamente la punta del microelectrodo hacia el recipiente, apuntando hacia el centro del recipiente utilizando el curso o el control fino del micromanipulador.
      NOTA: Ocasionalmente, se puede observar una pequeña desviación en la grabación cuando la punta del microelectrodo entra en contacto con una membrana de fibra muscular.
    6. Cuando la punta se acerca al recipiente, avance el electrodo hacia adelante en un movimiento rápido utilizando el micromanipulador para empalar la membrana del músculo.
    7. En este punto, uno puede comenzar a observar los cambios en Vm que se están registrando. No toque el micromanipulador cuando el microelectrodo empalse la membrana de la célula.
      NOTA: La diferencia de tensión entre el electrodo de grabación y de referencia disminuye de 0 mV a entre -40 mV y -75 mV dependiendo del nivel de presión intravascular u otros estímulos excitatorios o inhibitorios. Estas lecturas caracterizan la diferencia potencial transmembrana de la célula actual.
    8. Realizar múltiples empalamientos en un solo recipiente en diferentes áreas del recipiente sin dañar los VSMCs con el fin de obtener mediciones precisas.
    9. Después de la grabación, utilice el manipulador para eliminar el microelectrodo en un movimiento rápido.
    10. Detenga la grabación y guarde los archivos de datos para su posterior análisis.

Resultados

El método presentado se puede utilizar de forma fiable para grabar Vm en recipientes canulados. En la Figura 1Ase presenta un breve procedimiento que describe cómo aislar la MCA del cerebro. Después de separar el cerebro del cráneo, el MCA fue diseccionado y colocado en una placa de Petri que contiene PSS de calcio bajo. Parte del tejido conectivo que se unía también se diseccionó junto con MCA usando tijeras de resorte y fórceps para evita...

Discusión

Este artículo proporciona los pasos necesarios sobre cómo utilizar un método de empalamiento de microelectrodos nítidos para registrar Vm desde la preparación de un recipiente cannulado. Este método es ampliamente utilizado, y ofrece grabaciones consistentes y de alta calidad de Vm que responden a una amplia gama de preguntas experimentales.

Algunas consideraciones críticas y pasos de solución de problemas se describen aquí para garantizar el éxito del método. ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Programa de Investigación de Apoyo Intramural (IRSP) de la UMMC, AHA Scientist Development Grant (13SDG14000006) otorgada a Mallikarjuna R. Pabbidi.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Dissection instruments
Aneshetic VaporiserParkland scientificV3000PK
Dissection microscopeNikon Instruments Inc., NYEclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575Harvard Apparatus, MA73-198
Littauer Bone CutterFine science tools16152-15
Moria MC40 Ultra Fine ForcepsFine science tools11370-40
Surgical scissors Sharp-BluntFine science tools14008-14
SutureHarvard Apparatus72-3287
Vannas Spring ScissorsFine science tools15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device cameraQimaging, , BCRetiga 2000R
Differential electrometer amplifierWPIFD223A
In-line pressure transducerHarvard Apparatus, MAMA1 72-4496
MicromanipulatorThor labsPCS-5400
MicroelectrodesWarner Instruments LLC, CTG200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe)WPIMF28G67-5
Microelectrode holderWPIMEH1SF
MyographLiving Systems Instrumentation, VTCH-1-SH
PullerSutter Instrument, San Rafael, CAP-97
Vibration-free tableTMC3435-14
Softwares
Clampex 10Molecular devices
p Clamp 10Molecular devices
Imaging softwareNikon, NYNIS-elements
Chemicals
NaClSigmaS7653
KClSigmaP4504
MgSO4SigmaM7506
CaCl2 SigmaC3881
HEPESSigmaH7006
GlucoseSigmaG7021
NaH2PO4SigmaS0751
NaHCO3SigmaS5761

Referencias

  1. Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
  2. Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Vascular Research. 32 (6), 353-370 (1995).
  3. Large, W. A., Wang, Q. Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle. American Journal of Physiology. 271 (2 Pt 1), C435-C454 (1996).
  4. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. Journal of Physiology. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
  5. Yamazaki, J., et al. Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells. Journal of Physiology. 507 (Pt 3), 729-736 (1998).
  6. Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone. Trends in Pharmacol Sciences. 19 (7), 266-269 (1998).
  7. Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 262 (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).
  8. Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig. Journal of Physiology. 501 (Pt 2), 343-353 (1997).
  9. Shelly, D. A., et al. Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), C813-C820 (2004).
  10. Coca, A., Garay, R. . Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. , (1993).
  11. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circulation Research. 55 (2), 197-202 (1984).
  12. Knot, H. J., Nelson, M. T. Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure. Journal of Physiology. 508 (Pt 1), 199-209 (1998).
  13. Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone. American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).
  14. Harder, D. R., Sperelakis, N. Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium. American Journal of Physiology. 237 (1), C75-C80 (1979).
  15. Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
  16. Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch. Lymphatic Research and Biology. 12 (2), 66-75 (2014).
  17. Harder, D. R. Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat. American Journal of Physiology. 239 (1), C23-C26 (1980).
  18. Harder, D. R. Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds. Federation Proceedings. 42 (2), 253-256 (1983).
  19. Cogolludo, A., et al. Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization. Circulation Research. 98 (7), 931-938 (2006).
  20. Ganitkevich, V., Isenberg, G. Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes. Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).
  21. Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).
  22. Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).
  23. Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro. American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).
  24. Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 278 (2), C235-C256 (2000).

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