Método de empalamiento de microelectrodos para registrar el potencial de la membrana a partir de una arteria cerebral media cannulada

Resumen

El objetivo principal de este artículo es proporcionar detalles de cómo registrar el potencial de membrana (V_m) de la arteria cerebral media utilizando el método de empallamiento de microelectrodos. La arteria cerebral media canulada se equilibra para obtener tono miogénico, y la pared del vaso se empala usando microelectrodos de alta resistencia.

Resumen

El potencial de membrana (V_m) de las células musculares lisas vasculares determina el tono de los vasos y, por lo tanto, el flujo sanguíneo a un órgano. Los cambios en la expresión y función de los canales iónicos y las bombas electrogénicas que regulan el V_m en condiciones de enfermedad podrían alterar potencialmente la V_m,el tono vascular y el flujo sanguíneo. Por lo tanto, una comprensión básica de la electrofisiología y los métodos necesarios para registrar con precisión V_m en estados sanos y enfermos son esenciales. Este método permitirá modular V_m utilizando diferentes agentes farmacológicos para restaurar V_m. Aunque existen varios métodos, cada uno con sus ventajas y desventajas, este artículo proporciona protocolos para registrar V_m de vasos de resistencia cannulados como la arteria cerebral media utilizando el método de empalado de microelectrodos. Las arterias cerebrales medias pueden obtener tono miogénico en una cámara de miógrafo, y la pared del vaso se empaló utilizando microelectrodos de alta resistencia. La señal V_m se recoge a través de un electrómetro, se digitaliza y se analiza. Este método proporciona una lectura precisa del V_m de la pared de un recipiente sin dañar las células y sin cambiar la resistencia de la membrana.

Introducción

El potencial de membrana (V_m) de una célula se refiere a la diferencia relativa de carga iónica a través de la membrana plasmática y la permeabilidad relativa de la membrana a estos iones. El V_m es generado por la distribución diferencial de iones y es mantenido por canales iónicos y bombas. Los canales de iones como K⁺, Na⁺, y Cl^contribuyen sustancialmente al resto de V_m. Las células musculares lisas vasculares (VSCM) expresan más de cuatro tipos diferentes de K⁺ canales¹, dos tipos de canales Ca²⁺ con voltaje cerrado (VGCC)², más de dos tipos de Cl^- canales^{3, 4 , 5}, Ca²⁺ canales⁶accionados por almacén , canales catión7 activados por estiramiento^7,8y bombas electrogénicas ATPass de sodio-potasio⁹ en sus membranas plasmáticas, todas las cuales pueden ser implicados en la regulación de V_m.

El V_m de los VSMC depende de la presión del lumen. En recipientes no presurizados, V_m varía de -50 a -65 mV, sin embargo, en segmentos arteriales presurizados, V_m oscila entre -37 y -47 mV¹⁰. La elevación de la presión intravascular hace que los VSCM despolarizen¹¹, disminuye el umbral de apertura del VGCC y aumenta la afluencia de calcio contribuyendo al desarrollo del tono miogénico^12. Por el contrario, en los vasos pasivos o no presurizados, la hiperpolarización de la membrana, debido a la alta actividad del canal K^+, evitará que el VGCC se abra, lo que resulta en una entrada limitada de calcio y una disminución del calcio intracelular, contribuyendo a tono vascular¹³. Por lo tanto, V_m debido a los cambios en la presión lumen parece desempeñar un papel esencial en el desarrollo del tono vascular, y tanto los canales VGCC y K⁺ juegan un papel crucial en la regulación de V_m.

V_m varía según el tipo de recipiente y la especie. V_m es de -54 x 1,3 mV en tiras arteriales mesentéricas superiores de conejillo de indias¹⁴, -45 x 1 mV en las arterias cerebrales medias de rata a 60 mmHg de presión lumen^12,y -35 x 1 mV en arterias parénquimas de rata a 40 mmHg de presión de lúmenes¹⁵. El V_m en reposo registrado en el músculo linfático de rata sin estirar es de -48 a 2 mV^16. V_m de VSMCs cerebrales es más negativo que en las arterias periféricas. En comparación, se informó que las arterias cerebrales medias felinas tienen un V_m de aproximadamente -70 mV, mientras que las arterias mesentéricas y coronarias fueron reportadas a -49 y -58 mV, respectivamente^17,18. Las diferencias en el V_m entre los lechos vasculares pueden reflejar las diferencias en la expresión y función de los canales iónicos y las bombas electrogénicas de sodio-potasio.

Los aumentos y disminuciones en V_m se conocen como despolarización de membrana e hiperpolarización, respectivamente. Estas alteraciones en V_m juegan un papel central en muchos procesos fisiológicos, incluyendo gating de canal iónico, señalización celular, contracción muscular, y propagación potencial de acción. A una presión fija, muchos compuestos vasodilatadores endógenos y sintéticos que activan los canales K⁺ causan hiperpolarización de la membrana, lo que resulta en vasodilatación^1,13. Por el contrario, la despolarización sostenida de la membrana es vital enla vasoconstricción 19 inducida por agonistas o mediada por receptores. V_m es una variable crítica que no sólo regula la afluencia Ca²⁺ a través de VGCC^13, sino que también influye en la liberación de Ca²⁺ de las tiendas internas^20,21 y Ca²⁺-sensibilidad de el aparato contractilo²².

Si bien existen varios métodos para registrar V_m de diferentes tipos de células, los datos recopilados del método de empallado de microelectrodos de los recipientes cannulados parecen ser más fisiológicos que los datos obtenidos de VSMC aislados. Cuando se registra desde VSMC aislado utilizando métodos de abrazadera de corriente, V_m se ve como hiperpolarizaciones transitorias espontáneas en VSMc²⁴. Los VSMC aislados no están en el sincitio, y los cambios en la resistencia de la serie pueden contribuir al comportamiento oscilatorio de V_m. Por otro lado, el comportamiento oscilatorio no se observa cuando se registra V_m de vasos intactos, probablemente debido al contacto celular entre VSMCs que están en sincitio en la arteria y se suman en todo el recipiente que conduce a un V_m ^{estable 24}. Por lo tanto, la medición de V_m de recipientes presurizados utilizando la técnica estándar de empalacimiento de microelectrodos es relativamente cercana a las condiciones fisiológicas.

La grabación de V_m de los vasos cannulados podría proporcionar información vital, ya que el V_m de VSMCs que están en sincitio es uno de los principales determinantes del tono vascular y el flujo sanguíneo, y la modulación del V_m podría proporcionar una manera de dilatar o restringir los vasos sanguíneos. Por lo tanto, es esencial entender la metodología implicada en la grabación de V_m. Este artículo describe el registro intracelular de V_m de las arterias cerebrales medias cannuadas (MCA) utilizando un método de empallamiento de microelectrodos. Este protocolo describirá cómo preparar MCA, microelectrodos, configurar el electrómetro y realizar el método de empalamiento para grabar V_m. Además, se discuten los datos representativos, los problemas comunes que se encontraron al usar este método y los posibles problemas.

Protocolo

Las ratas macho fueron alojados en el Centro de Cuidado Animal de la UMMC, que está aprobado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado Animal de Laboratorio (AAALAC). Los animales tuvieron libre acceso a alimentos y agua durante todo el estudio. Los animales se mantuvieron en un ambiente controlado con una temperatura de 24oC, niveles de humedad del 60-80% y ciclos de luz/oscuridad de 12 h. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la UMMC.

1. Preparación de equipos

1. Coloque un amplificador de electrometro diferencial de doble canal (consulte la Tabla de materiales)cerca de la cámara del recipiente y en la ubicación deseada.
2. Conecte la salida del canal del amplificador A o B a la entrada de canal del digitalizador con un cable BNC-BNC.
3. Monte la sonda en el micromanipulador y colóquela cerca del microscopio y del miógrafo. La configuración de grabación debe instalarse en una mesa sin vibraciones.
4. Coloque las perillas y los interruptores en la parte frontal del amplificador en las posiciones que lo configuran para este experimento como se describe en el manual.
5. Conecte el suelo del baño a la tierra del circuito del amplificador a través de un electrodo adecuado. Del mismo modo, asegúrese de que la jaula esté conectada a tierra al chasis del amplificador.

2. Preparación de Microelectrodos y Montaje

1. Utilice microelectrodos de vidrio de borosilicato (ver la Tabla de Materiales) y tire de la punta de vidrio para tener un cónico de 8-10 mm, diámetro de <1 m y resistencia de 80-120 M cuando se llena con 3 M KCl.
   1. Utilice un tirador estándar para lograr un cono gradual corto utilizando los siguientes ajustes: calor 650; velocidad 20; tirar 25; tiempo 250 y bucle dos veces para mayores resistencias y puntas más pequeñas. Consulte la Tabla de materiales, ya que los ajustes son específicos del instrumento.
      NOTA: Los diámetros de la punta <1 m causarán un daño mínimo a la celda cuando se empala.
2. Llene el microelectrodo con 3 M DeKCl utilizando una jeringa de microfibra (ver la Tabla de Materiales).
   1. Tire lentamente del émbolo de la jeringa de microfibra hacia arriba mientras inyecta el KCl de 3 M en el microelectrodo para permitir que el fluido se llene y para evitar la formación de burbujas de aire dentro del microelectrodo.
   2. Llene el microelectrodo hasta que esté lleno y asegúrese de que no haya burbujas de aire antes de colocarlo en el soporte del microelectrodo. Si hay burbujas, toque suavemente el microelectrodo con un dedo para eliminar las burbujas.
3. Ejerciendo cuidado, empuje firmemente el vástago del electrodo en el soporte a través del agujero perforado. Si hay exceso de líquido, retírelo con un pañuelo de papel.
4. Conecte el conjunto del soporte del electrodo a la sonda del amplificador. Realice una prueba de electrodos, ajuste el desplazamiento de entrada, verifique la configuración cero y compruebe la fuga de entrada de la sonda según el manual del amplificador.
5. Mida la resistencia de los electrodos mediante una prueba de electrodos como se muestra en la Tabla1.
6. Tenga en cuenta que un electrodo de trabajo muestra un desplazamiento de voltaje de CC positivo de 1 mV/M en la salida del canal. Por otro lado, si aparece una tensión grande en la salida del canal y en el medidor, esto indica un electrodo bloqueado o roto.
7. Abra el software de grabación, asigne un nombre al archivo y guárdelo para su análisis futuro en un software de almacenamiento.

3. Aislamiento y cannulación de la arteria cerebral media

1. Preparar los reactivos.
   1. Preparar la solución de sal fisiológica (PSS) normal y baja en calcio como se describe en la Tabla2.
2. Preparen el miógrafo.
   1. Enjuague la cámara de miógrafo (ver la Tabla de Materiales)con agua destilada varias veces para mantenerla libre de residuos. Cargue la cámara con 5 ml de PSS normal.
   2. Llene ambas cánulas de vidrio con PSS normal filtrada utilizando una jeringa de 5-10 ml. Llene cuidadosamente toda la cánula y el tubo adjunto sin introducir burbujas de aire.
   3. Preparar dos suturas de nylon monofilamento (10-0, 0.02 mm) con medio nudo cada una usando fórceps contundentes.
   4. Coloque los nudos de sutura parcialmente cerrados en ambas cánulas ligeramente lejos de la punta usando fórceps de disección bajo un microscopio de disección. Más tarde estos nudos se deslizarán y se atarán cuidadosamente en los extremos arteriales canulados para asegurar el vaso.
3. Aísle y cinrara la arteria cerebral media.
   1. Inducir anestesia profunda en una rata Sprague Dawley mediante el uso de 2-4% de isoflurano inhalado.
   2. Decapitar a la rata usando guillotina bajo anestesia profunda.
   3. Retire cuidadosamente el cráneo con un cortador de huesos y una tijera.
   4. Retire el cerebro del cráneo y colóquelo en 5 ml de PSS bajo en calcio sobre hielo.
   5. Identificar y diseccionar un segmento no ramificado de la arteria cerebral media de rata (MCA) con un diámetro interno de 100–200 m del cerebro usando tijeras de resorte y fórceps.
   6. Monte el MCA en las cánulas de vidrio con fórceps finos y asegúrelo apretando las suturas en el miógrafo que contiene PSS normal.
   7. Cierre la cánula distal de modo que no haya flujo dentro de los MCA.
   8. Conecte la pipeta de entrada a un depósito que sostenga PSS para permitir el control de la presión intraluminal que se controlará con un transductor de presión en línea.
   9. Visualice los MCA cannulados utilizando una cámara de dispositivo acoplada por carga (consulte la Tabla de materiales)montada en un microscopio invertido y un software de imágenes.
   10. Establezca la longitud axial del MCA en una longitud aproximada donde no debería aparecer ni rígida ni flácida.
   11. Equilibrar la solución de baño con O₂ (95%) y CO₂ (5%) a 37 oC para proporcionar una oxigenación adecuada, temperatura y mantener el pH a 7,4.
4. Empalar (penetrar en la membrana plasmática celular) las células musculares lisas vasculares.
   1. Conecte el electrodo de tierra y manténgalo sumergido en el PSS del miógrafo.
   2. Ilumina la cámara del recipiente y mira a través del microscopio para visualizar la punta del microelectrodo en la solución de baño.
      NOTA: Alternativamente, se puede visualizar el MCA y el microelectrodo en un ordenador que tiene un software de imágenes.
   3. Utilice los controles del micromanipulador para mover la punta del microelectrodo cerca de la pared externa del vaso sanguíneo. El micromanipulador y la punta del microelectrodo deben estar en una posición estable en relación con el tejido.
      NOTA: Antes de comenzar los experimentos, confirme que el voltaje de la membrana se ha estabilizado. Si la tensión medida es inestable, la conexión entre el electrodo y la célula no está sellada, lo que indica una fuga.
   4. Comience la grabación.
   5. Mueva lentamente la punta del microelectrodo hacia el recipiente, apuntando hacia el centro del recipiente utilizando el curso o el control fino del micromanipulador.
      NOTA: Ocasionalmente, se puede observar una pequeña desviación en la grabación cuando la punta del microelectrodo entra en contacto con una membrana de fibra muscular.
   6. Cuando la punta se acerca al recipiente, avance el electrodo hacia adelante en un movimiento rápido utilizando el micromanipulador para empalar la membrana del músculo.
   7. En este punto, uno puede comenzar a observar los cambios en V_m que se están registrando. No toque el micromanipulador cuando el microelectrodo empalse la membrana de la célula.
      NOTA: La diferencia de tensión entre el electrodo de grabación y de referencia disminuye de 0 mV a entre -40 mV y -75 mV dependiendo del nivel de presión intravascular u otros estímulos excitatorios o inhibitorios. Estas lecturas caracterizan la diferencia potencial transmembrana de la célula actual.
   8. Realizar múltiples empalamientos en un solo recipiente en diferentes áreas del recipiente sin dañar los VSMCs con el fin de obtener mediciones precisas.
   9. Después de la grabación, utilice el manipulador para eliminar el microelectrodo en un movimiento rápido.
   10. Detenga la grabación y guarde los archivos de datos para su posterior análisis.

Resultados

El método presentado se puede utilizar de forma fiable para grabar V_m en recipientes canulados. En la Figura 1Ase presenta un breve procedimiento que describe cómo aislar la MCA del cerebro. Después de separar el cerebro del cráneo, el MCA fue diseccionado y colocado en una placa de Petri que contiene PSS de calcio bajo. Parte del tejido conectivo que se unía también se diseccionó junto con MCA usando tijeras de resorte y fórceps para evita...

Discusión

Este artículo proporciona los pasos necesarios sobre cómo utilizar un método de empalamiento de microelectrodos nítidos para registrar V_m desde la preparación de un recipiente cannulado. Este método es ampliamente utilizado, y ofrece grabaciones consistentes y de alta calidad de V_m que responden a una amplia gama de preguntas experimentales.

Algunas consideraciones críticas y pasos de solución de problemas se describen aquí para garantizar el éxito del método. ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser	Parkland scientific	V3000PK
Dissection microscope	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer Bone Cutter	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps	Fine science tools	11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt	Fine science tools	14008-14
Suture	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas Spring Scissors	Fine science tools	15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera	Qimaging, , BC	Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier	WPI	FD223A
In-line pressure transducer	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelectrodes	Warner Instruments LLC, CT	G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe)	WPI	MF28G67-5
Microelectrode holder	WPI	MEH1SF
Myograph	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
Puller	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
Vibration-free table	TMC	3435-14
Softwares
Clampex 10	Molecular devices
p Clamp 10	Molecular devices
Imaging software	Nikon, NY	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
Glucose	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761