Метод микроэлектрода Impalement для записи Мембраны Потенциал из канналедированной средней мозговой артерии

Резюме

Основная цель этой статьи заключается в предоставлении подробной информации о том, как записывать мембранный потенциал (V_м) из средней мозговой артерии с помощью метода микроэлектрода impalement. Каннулированная средняя мозговая артерия уравновешивают, чтобы получить миогенный тон, и стенка сосуда пронзили с помощью микроэлектродов высокого сопротивления.

Аннотация

Мембранныйпотенциал (V м) сосудистых гладких мышечных клеток определяет тонус сосудов и, таким образом, приток крови к органу. Изменения в экспрессии и функции ионных каналов и электрогенных насосов, которые регулируют V_м в условиях заболевания потенциально может изменить V_м,сосудистый тон, и кровоток. Таким образом, необходимо базовое понимание электрофизиологии и методов, необходимых для точной записи V_м в здоровых и больных состояниях. Этот метод позволит модулировать V_m с помощью различных фармакологических агентов для восстановления V_м. Хотя Есть несколько методов, каждый со своими преимуществами и недостатками, эта статья предоставляет протоколы для записи V_м из каннуляющих сосудов сопротивления, таких как средняя мозговая артерия с помощью метода микроэлектродов impalement. Средние мозговые артерии могут получить миогенный тон в миографической камере, а стенка сосуда пронзили с помощью микроэлектродов высокого сопротивления. Сигнал V_m собирается с помощью электрометра, оцифровывается и анализируется. Этот метод обеспечивает точное считывание V_м стенки сосуда, не повреждая клетки и не изменяя мембранное сопротивление.

Введение

Мембранный потенциал (V_м) клетки относится к относительной разнице ионного заряда по плазменной мембране и относительной проницаемости мембраны к этим ионам. V_m генерируется дифференциальным распределением ионов и поддерживается ионными каналами и насосами. Ионные каналы, такие как K^q, Na^,и Cl^й внести существенный вклад в отдых V_м. Сосудистые гладкие мышечные клетки (VSMCs) выражают более четырех различных типов Каналов K^{и 1}, два типа напряжения-gated Ca² "каналов (VGCC)², более двух типов Cl^- каналы^{3, 4 , 5}, магазин-управляемые каналы Ca² '6, растяжечныеканалы катионов^7,8,и электрогенные насосы натрия-калия ATPase⁹ в их плазменных мембранах, все из которых могут быть участвует в регулировании V_м.

V_м VSMCs зависит от давления промена. В ненагерметиковых судах V_m варьируется от -50 до -65 мВ, однако в герметике артериальных сегментов В м колеблется от -37 до -47 мВ^10. Повышение внутрисосудистого давления приводит к деполяризации ВСМК^11,снижает порог открытия VGCC, и увеличивает приток кальция, способствующий развитию миногенного тона^12. Напротив, в пассивных или ненагерметизированных сосудах мембранная гиперполяризация, из-за высокой активности канала K, предотвратит открытие VGCC, что приведет к ограниченному входу кальция и уменьшению внутриклеточного кальция, способствуя меньшему сосудистый тон¹³. Таким образом, V_m из-за изменений давления промена, как представляется, играют важную роль в развитии тонусов сосудов, и как VGCC и K^q каналы играют решающую роль в регулировании V_м.

V_m варьируется между типом судна и видом. V_м -54 - 1,3 мВ у морских свинок superior мезентериальных артериальных полос¹⁴, -45 и 1 мВ в крысиных средних мозговых артериях при давлении просвета60 мм рт. ст.^12,и -35 - 1 мВ в крысиных паранхмальных артериях при давлении 40 мм рт. ст. Отдых V_м записано в нерастянутой крысиной лимфатической мышце -48 и 2 мВ¹⁶. V_м церебральных VSMCs является более негативным, чем в периферических артериях. Для сравнения, кошачьих средних мозговых артерий, как сообщается, V_м около -70 мВ, в то время как мезентерические и коронарные артерии, как сообщается, -49 и -58 мВ, соответственно^17,18. Различия в V_м через сосудистые кровати могут отражать различия в экспрессии и функции ионных каналов и электрогенных натриево-калийных насосов.

Увеличение и уменьшение ВМ называют мембранной деполяризацией и гиперполярализацией, соответственно. Эти изменения в V_м играют центральную роль во многих физиологических процессах, включая ион-канал gating, сигнализация клеток, сокращение мышц, и действия потенциального распространения. При фиксированном давлении, многие эндогенные и синтетические сосудорасширяющие соединения, которые активируют каналы K^и вызывают мембранную гиперполяризацию, в результате чего вазодилатация^1,13. И наоборот, устойчивая деполяризация мембран имеет жизненно важное значение в агонист-индуцированной или рецепторо-опосредованного сосудосуживание¹⁹. V_m является критической переменной, которая не только регулирует приток Ca² "через VGCC^13, но и влияет на выпуск Ca^2" из внутренних магазинов^20,21 и Ca 2^{"чувствительность} контрактный аппарат²².

Хотя существует несколько методов записи V_м из различных типов клеток, данные, собранные из метода микроэлектрода прокола канналесора, как представляется, более физиологические, чем данные, полученные из изолированных VSMCs. При записи из изолированных VSMC с использованием текущих методов зажима, V_m рассматривается как спонтанные переходные гиперполяризации в VSMCs²⁴. Изолированные VSMCs не находятся в синцитии, и изменения в устойчивости серии могут способствовать колебационному поведению V_m. С другой стороны, колебальное поведение не наблюдается, когда V_m записывается из нетронутых сосудов, вероятно, из-за контакта клеток между VSMCs, которые находятся в синцитии в артерии и суммируются по всему сосуду, ведущей к стабильной V_м ²⁴. Таким образом, измерение V_м из под давлением сосудов с использованием стандартной методики микроэлектрода impalement относительно близко к физиологическим условиям.

Запись V_м из каннаулированных сосудов может обеспечить жизненно важную информацию, так как V_м VSMCs, которые находятся в синхронизации является одним из основных детерминантов сосудистого тона и кровотока, и модуляция V_м может обеспечить способ для разбавлять или сужают кровеносные сосуды. Таким образом, важно понимать методологию, связанную с записью V_m. В этой статье описывается внутриклеточная запись V_м из каннулялизных средних мозговых артерий (MCAs) с помощью метода микроэлектрода impalement. Этот протокол будет описывать, как подготовить MCAs, микроэлектроды, настроить электрометр и выполнить метод impalement для записи V_м. Также обсуждаются репрезентативные данные, общие проблемы, возникшие при использовании этого метода, и потенциальные проблемы.

протокол

Самцы крыс были размещены в центре по уходу за животными в УГМК, который одобрен Ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторного ухода за животными (AAALAC). На протяжении всего исследования животные имели свободный доступ к пище и воде. Звери содержались в контролируемой среде с температурой 24 х 2 градусов по Цельсию, уровень влажности 60-80% и 12 ч светлых/темных циклов. Все протоколы были утверждены Комитетом по уходу за животными и использованию УГМК.

1. Подготовка оборудования

1. Поместите двойной дифференциальный электрометр(см. ТаблицуМатериалов) близко к камере судна и в нужном месте.
2. Подключите выход канала усилителя A или B к вхотворцу канала дигитайзера с помощью кабеля BNC-BNC.
3. Установите зонд в микроманипулятор и поместите его рядом с микроскопом и миографом. Установка записи должна быть установлена на безвибрационном столе.
4. Поместите ручки и переключатели на передней панели усилителя в положениях, которые настраиваются на этот эксперимент, как описано в руководстве.
5. Соедините основу ванны с контурной площадкой усилителя с помощью соответствующего электрода. Аналогичным образом, убедитесь, что клетка приземляется на шасси усилителя.

2. Подготовка микроэлектродов и сборки

1. Используйте боросиликатные стеклянные микроэлектроды (см. таблицу материалов) и потяните стеклянный наконечник, чтобы иметь конус диаметром 8-10 мм, диаметром 1 мкм и сопротивлением 80-120 МЗ при заполнении 3 М ККЛ.
   1. Используйте стандартный шкив для достижения короткого постепенного конуса, используя следующие настройки: тепло 650; скорость - 20; тянуть No 25; время 250 и петля дважды для более высоких сопротивлений и меньших кончиков. Посмотреть таблицу материалов, как настройки инструмент-специфических.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр наконечника злт;1 мкм нанесет минимальный ущерб клетке при проколе.
2. Заполните микроэлектрод 3 M KCl с помощью шприца микроволокна (см. таблицу материалов).
   1. Медленно потяните поршень из шприца микроволокна вверх во время введения 3 M KCl в микроэлектрод, чтобы пространство для жидкости для заполнения и предотвратить образование пузырьков воздуха внутри микроэлектрода.
   2. Заполните микроэлектрод до полного и убедитесь, что Есть нет пузырьков воздуха, прежде чем поместить его в держатель микроэлектрода. Если пузырьки присутствуют, осторожно коснитесь микроэлектродой пальцем, чтобы удалить пузыри.
3. Осуществляя уход, твердо нажмите электрод хвостовик в держатель через скучно отверстие. Если избыток жидкости присутствует, удалить его с тканью.
4. Подключите сборку держателя электрода к зонду усилителя. Проведите тест на электрод, отрегулируйте смещение ввода, проверьте нулевую настройку и проверьте утечку ввода зонда в соответствии с руководством по усилителею.
5. Измерьте сопротивление электродов с помощью теста на электрод, как показано в таблице1.
6. Обратите внимание, что работающий электрод отображает положительный сдвиг напряжения ПОСТОЯННОГО ТОКа в 1 мВ/МЗ на выходе канала. С другой стороны, если большое напряжение появляется на выходе канала и на счетчике, это указывает на заблокированный или сломанный электрод.
7. Откройте программное обеспечение для записи, присвоите имя файлу и сохраните его для дальнейшего анализа в программном обеспечении для хранения.

3. Изоляция и кануляция средней мозговой артерии

1. Подготовка реагентов.
   1. Подготовка нормального и низкого кальция физиологического солевого раствора (PSS), как описано в таблице 2.
2. Приготовьте миограф.
   1. Промыть миографную камеру (см. таблицуматериалов) с дистиллированной водой несколько раз, чтобы держать его свободным от мусора. Загрузите камеру с 5 мл нормального PSS.
   2. Заполните обе стеклянные канюли с отфильтрованным нормальным PSS с помощью шприца 5-10 мл. Тщательно заполните всю канюли и прикрепленные трубки без введения каких-либо пузырьков воздуха.
   3. Приготовьте два монофилоновых нейлоновых шва (10-0, 0,02 мм) с половиной узла каждый с помощью тупых щипц.
   4. Поместите частично закрытые узлы шва на обе канюлях немного от кончика, используя рассечение щипцы под микроскопом вскрытия. Позже эти узлы будут соскользнул и связаны тщательно на каниulated артериальных концов для обеспечения судна.
3. Изолировать и канитулировать среднюю мозговую артерию.
   1. Индуцировать глубокую анестезию в Sprague Dawley крысы с помощью 2-4% вдыхаемых изофлуран.
   2. Обезглавить крысу с помощью гильотины под глубокой анестезией.
   3. Тщательно удалите череп с помощью костного резака и ножницами.
   4. Удалить мозг из черепа и поместить его в 5 мл низкого кальция PSS на льду.
   5. Определите и вскрывайте неразветвленный сегмент крысиной средней мозговой артерии (MCA) с внутренним диаметром 100-200 мкм от мозга с помощью пружинных ножниц и щипков.
   6. Установите MCA на стеклянные канюли с помощью тонких щипц и закрепите, затягивая швы в миографе, содержащем нормальный PSS.
   7. Закройте дистальной канюли, чтобы не было потока в РАМКАХ MCA.
   8. Подключите водоемную трубу к резервуару, удерживающего PSS, чтобы обеспечить контроль внутрилюмиального давления, которое будет контролироваться с помощью трансдуктора давления в линии.
   9. Визуализируйте cannulated MCA с помощью зарядной камеры устройства (см. Таблицаматериалов), установленной на перевернутом микроскопе и программном обеспечении для визуализации.
   10. Установите осевую длину MCA до приблизительной длины, где она должна появиться ни жесткой, ни вялой.
   11. Уравновесить раствор ванны с O₂ (95%) и CO₂ (5%) при температуре 37 градусов По Цельсию для обеспечения адекватной оксигенации, температуры и поддержания рН на уровне 7,4.
4. Impale (проникает в клеточную плазменную мембрану) сосудистые гладкие мышечные клетки.
   1. Соедините молотый электрод и держите его погруженным в PSS миографа.
   2. Осветите камеру сосуда и посмотрите через микроскоп, чтобы визуализировать кончик микроэлектрода в растворе ванны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, можно визуализировать MCA и микроэлектрод на компьютере, имеющего программное обеспечение для визуализации.
   3. Используйте элементы управления микроманипулятора для перемещения кончика микроэлектрода близко к внешней стенке кровеносных сосудов. Микроманипулятор и кончик микроэлектрода должны находиться в стабильном положении по отношению к ткани.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом экспериментов подтвердите, что напряжение мембраны стабилизировалось. Если измеренное напряжение нестабильно, связь между электродом и клеткой не запечатана, что указывает на утечку.
   4. Начните запись.
   5. Медленно двигайте кончик микроэлектрода к сосуду, нацеливаясь в центр сосуда, используя курс или тонкий контроль микроманипулятора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда, небольшое отклонение в записи может наблюдаться, когда микроэлектрод кончик контактов мембраны мышечного волокна.
   6. Когда наконечник приходит в непосредственной близости от сосуда, продвижение электрода вперед в одном быстром движении с помощью микроманипулятора, чтобы пронзить мембрану мышцы.
   7. На этом этапе можно начать наблюдать за изменениями в V m, записываемыми. Не прикасайтесь к микроманипулятору, когда микроэлектрод пронзает мембрану клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разница в напряжении между записью и эталонным электродом уменьшается от 0 мВ до -40 мВ до -75 мВ в зависимости от уровня внутрисосудистого давления или других возбуждающих или ингибирующих стимулов. Эти показания характеризуют трансмембранную потенциальную разницу текущей клетки.
   8. Выполните несколько проколов на одном судне в различных областях судна, не повреждая ВСМК, чтобы получить точные измерения.
   9. После записи используйте манипулятор для удаления микроэлектрода в одном быстром движении.
   10. Остановите запись и сохраните файлы данных для дальнейшего анализа.

Результаты

Представленный метод можно надежно использовать для записи V_м в каниulated сосудах. Краткая процедура, описывающая, как изолировать MCA от мозга представлена на рисунке 1A. После отделения мозга от черепа, MCA был расчленен и помещен в чашку Петри, содер?...

Обсуждение

Эта статья предоставляет необходимые шаги о том, как использовать острый метод микроэлектрода impalement для записи V_м от консервированной подготовки судна. Этот метод широко используется и предлагает высококачественные, последовательные записи V_m, которые отвечают на широкий ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser	Parkland scientific	V3000PK
Dissection microscope	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer Bone Cutter	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps	Fine science tools	11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt	Fine science tools	14008-14
Suture	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas Spring Scissors	Fine science tools	15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera	Qimaging, , BC	Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier	WPI	FD223A
In-line pressure transducer	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelectrodes	Warner Instruments LLC, CT	G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe)	WPI	MF28G67-5
Microelectrode holder	WPI	MEH1SF
Myograph	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
Puller	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
Vibration-free table	TMC	3435-14
Softwares
Clampex 10	Molecular devices
p Clamp 10	Molecular devices
Imaging software	Nikon, NY	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
Glucose	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761