Méthode d'empalement de microélectrode pour enregistrer le potentiel de membrane d'une artère cérébrale moyenne cannulated

Résumé

L'objectif principal de cet article est de fournir des détails sur la façon d'enregistrer le potentiel membranaire (V_m) de l'artère cérébrale moyenne en utilisant la méthode d'impalement de microélectrode. L'artère cérébrale moyenne cannulated est équilibrepour obtenir le tonus myogénique, et la paroi du vaisseau est empalé à l'aide de microélectrodes à haute résistance.

Résumé

Le potentiel membranaire (V_m) des cellules musculaires vasculaires lisses détermine le tonus des vaisseaux et donc le flux sanguin vers un organe. Les changements dans l'expression et la fonction des canaux ioniques et des pompes électrogéniques qui régulent V_m dans les conditions de la maladie pourraient potentiellement altérer V_m, tonalité vasculaire, et le flux sanguin. Ainsi, une compréhension de base de l'électrophysiologie et les méthodes nécessaires pour enregistrer avec précision V_m dans des états sains et malades sont essentiels. Cette méthode permettra de moduler V_m à l'aide de différents agents pharmacologiques pour restaurer V_m. Bien qu'il existe plusieurs méthodes, chacune avec ses avantages et ses inconvénients, cet article fournit des protocoles pour enregistrer V_m à partir de vaisseaux de résistance cannulés tels que l'artère cérébrale centrale en utilisant la méthode d'empalement de microélectrode. Les artères cérébrales moyennes sont autorisées à obtenir un tonus myogénique dans une chambre myographique, et la paroi du vaisseau est empalée à l'aide de microélectrodes à haute résistance. Le signal V_m est recueilli à l'aumoyen d'un électromètre, numérisé et analysé. Cette méthode fournit une lecture précise du V_m d'une paroi de navire sans endommager les cellules et sans changer la résistance de membrane.

Introduction

Le potentiel membranaire (V_m) d'une cellule se réfère à la différence relative de charge ionique à travers la membrane plasmatique et à la perméabilité relative de la membrane à ces ions. Le V_m est généré par la distribution différentielle des ions et est maintenu par des canaux ioniques et des pompes. Les canaux ioniques tels que K ^,Na^etCl contribuent substantiellement au v_mau repos . Les cellules musculaires vasculaires et lisses (VSMC) expriment plus de quatre types différents de canaux K¹, deux types de canaux Ca 2^(VGCC) (VGCC)², plus de deux types de canaux Cl ^{3, 4 ( en} plus) ^{, 5}, canaux Ca^{2 mD} exploités en magasin⁶, canaux de cation à activation extensible^7,8, et pompes ATPase de sodium-potassium électrogéniques⁹ dans leurs membranes plasmatiques, qui peuvent toutes être impliqués dans la réglementation de V_m.

Le V_m des VSMC dépend de la pression lumineuse. Dans les navires non pressurisés, V_m varie de -50 à -65 mV, cependant, dans les segments artériels pressurisés, V_m varie de -37 à -47 mV¹⁰. L'élévation de la pression intravasculaire provoque des VSMC pour dépolariser¹¹, diminue le seuil pour l'ouverture de VGCC, et augmente l'afflux de calcium contribuant au développement du tonique myogénique^12. Au contraire, dans les vaisseaux passifs ou non pressurisés, l'hyperpolarisation membranaire, due à une activité élevée du canal K, empêchera le VGCC de s'ouvrir, ce qui entraînera une entrée limitée de calcium et une diminution du calcium intracellulaire, contribuant à moins tonalité vasculaire¹³. Ainsi, V_m en raison de changements dans la pression lumen semble jouer un rôle essentiel dans le développement du tonalité vasculaire, et les deux vGCC et K^canaux jouent un rôle crucial dans la réglementation de V_m.

V_m varie selon le type de navire et les espèces. V_m est de -54 à 1,3 mV dans les bandes artérielles mésentériques supérieures supérieures de cobaye^14,-45 - 1 mV dans les artères cérébrales moyennes de rat à la pression lumen de 60 mmHg^12,et -35 - 1 mV dans les artères parenchymal de rat à la pression lumen de 40 mmHg^15. Le V_m au repos enregistré dans le muscle lymphatique non tendu de rat est -48 - 2 mV^16. V_m des VSMC cérébraux est plus négatif que dans les artères périphériques. En comparaison, les artères cérébrales moyennes félines ont été rapportées pour avoir un_{V m} d'environ -70 mV, alors que les artères mésentériques et coronaires ont été rapportées pour avoir -49 et -58 mV, respectivement^17,18. Les différences dans le_{V m} à travers les lits vasculaires peuvent refléter les différences dans l'expression et la fonction des canaux ioniques et des pompes électrogéniques sodium-potassium.

Les augmentations et les diminutions de V_m sont appelées dépolarisation et hyperpolarisation membranaires, respectivement. Ces altérations dans V_m jouent un rôle central dans de nombreux processus physiologiques, y compris le gating ion-canal, la signalisation cellulaire, la contraction musculaire, et la propagation potentielle d'action. À une pression fixe, de nombreux composés vasodilatateurs endogènes et synthétiques qui activent les canaux K causent l'hyperpolarisation de la membrane, entraînant une vasodilatation^1,13. Inversement, la dépolarisation soutenue de membrane est essentielle dans la vasoconstriction agoniste-induite ou réceptrice-négociée^19. V_m est une variable critique qui non seulement réglemente l'afflux de Ca^{2 par} le biais de VGCC^13, mais influence également la libération de Ca² 'des magasins internes^20,21 et Ca²-sensibilité de l'appareil contractuel²².

Bien qu'il existe plusieurs méthodes pour enregistrer V_m de différents types de cellules, les données recueillies à partir de la méthode d'empalement des microélectrodes des vaisseaux cannulés semblent être plus physiologiques que les données obtenues à partir de VSMC isolés. Lorsqu'il est enregistré à partir de VSMC isolés à l'aide des méthodes actuelles de pince, V_m est considéré comme des hyperpolarisations transitoires spontanées dans les VSMC²⁴. Les VSMC isolés ne sont pas dans le syncytium, et les changements dans la résistance de série peuvent contribuer au comportement oscillatoire de V_m. D'autre part, le comportement oscillatoire n'est pas observé lorsque V_m est enregistré à partir de vaisseaux intacts, probablement en raison du contact cellule-cellule entre les VSMC qui sont en syncytium dans l'artère et sont résumés dans tout le navire menant à un V_m ^{stable 24}. Ainsi, la mesure de V_m des vaisseaux pressurisés utilisant la technique standard d'empalement de microélectrode est relativement proche des conditions physiologiques.

L'enregistrement de V_{m à} partir de vaisseaux cannulés pourrait fournir des informations vitales, puisque V_m de VSMC s'il est en syncytium est l'un des principaux déterminants du tonience vasculaire et du flux sanguin, et la modulation du_{V m} pourrait fournir un moyen de dilater ou constrictent les vaisseaux sanguins. Il est donc essentiel de comprendre la méthodologie impliquée dans l'enregistrement de V_m. Cet article décrit l'enregistrement intracellulaire de V_m des artères cérébrales moyennes cannulated (MCAs) utilisant une méthode d'empalement de microélectrode. Ce protocole décrira comment préparer les MCA, les microélectrodes, mettre en place l'électromètre et effectuer la méthode d'empalement pour enregistrer V_m. En outre, les données représentatives, les questions communes qui ont été rencontrées lors de l'utilisation de cette méthode et les questions potentielles sont discutées.

Protocole

Les rats mâles ont été logés dans l'établissement de soins aux animaux de l'UMMC, qui est approuvé par l'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Les animaux ont eu un accès gratuit à la nourriture et à l'eau tout au long de l'étude. Les animaux ont été maintenus dans un environnement contrôlé avec une température de 24 à 2 oC, des niveaux d'humidité de 60 à 80 % et des cycles de lumière/obscurité de 12 h. Tous les protocoles ont été approuvés par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux de l'UMMC.

1. Préparation de l'équipement

1. Placez un amplificateur d'électromètre différentiel à double canal (voir la Table des Matériaux)près de la chambre du navire et à l'endroit désiré.
2. Connectez la sortie du canal A ou B de l'amplificateur à l'entrée du canal du numériseur avec un câble BNC-BNC.
3. Montez la sonde dans le micromanipulateur et placez-la près du microscope et du myographe. La configuration d'enregistrement doit être installée sur une table sans vibrations.
4. Placez les boutons et les interrupteurs sur l'avant de l'amplificateur dans des positions qui le configurent pour cette expérience comme décrit dans le manuel.
5. Connectez le sol du bain au terrain de circuit de l'amplificateur par l'intermédiaire d'une électrode appropriée. De même, assurez-vous que la cage est mise à la terre sur le châssis de l'amplificateur.

2. Préparation des microélectrodes et de l'assemblage

1. Utilisez des microélectrodes en verre borosilicate (voir la Table des Matériaux) et tirez la pointe de verre pour avoir un cône de 8 à 10 mm, un diamètre de 1 m et une résistance de 80 à 120 M'lorsqu'il est rempli de 3 M KCl.
   1. Utilisez un tire-lasseur standard pour obtenir un court cône graduel en utilisant les réglages suivants : chaleur 650; vitesse de 20; tirer 25; temps 250 et boucle deux fois pour des résistances plus élevées et des pointes plus petites. Voir le tableau des matériaux car les paramètres sont spécifiques à l'instrument.
      REMARQUE: Les diamètres de l'astuce de 1 m et plus causeront des dommages minimes à la cellule lorsqu'elle est empalée.
2. Remplissez la microélectrode à l'aide d'une seringue en microfibre (voir le Tableau des matériaux).
   1. Tirez lentement le piston de la seringue en microfibre tout en injectant le KCl de 3 M dans le microélectrode pour laisser de l'espace au fluide se remplir et pour empêcher la formation de bulles d'air à l'intérieur de la microélectrode.
   2. Remplissez le microélectrode jusqu'à ce qu'il soit plein et assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air avant de le placer dans le porte-microélectrode. Si des bulles sont présentes, appuyez doucement sur le microélectrode avec un doigt pour enlever les bulles.
3. Exercer des soins, pousser fermement la tige d'électrode dans le support à travers le trou ennuyé. En cas d'excès de liquide, retirez-le avec un tissu.
4. Connectez l'assemblage du support d'électrode à la sonde de l'amplificateur. Effectuez un essai d'électrode, ajustez le décalage d'entrée, vérifiez le réglage zéro et vérifiez la fuite d'entrée de sonde selon le manuel d'amplificateur.
5. Mesurer la résistance aux électrodes à l'aide d'un test d'électrode, comme le montre le tableau 1.
6. Notez qu'une électrode de travail affiche un décalage de tension DC positif de 1 mV/M à la sortie du canal. D'autre part, si une grande tension apparaît à la sortie du canal et sur le compteur, cela indique une électrode bloquée ou cassée.
7. Ouvrez le logiciel d'enregistrement, attribuez un nom au fichier et enregistrez-le pour une analyse future dans un logiciel de stockage.

3. Isolement et cannulation de l'artère cérébrale moyenne

1. Préparation des réactifs.
   1. Préparer une solution de sel physiologique normale et faible en calcium (PsS) telle que décrite dans le tableau 2.
2. Préparez le myographe.
   1. Rincer la chambre myographique (voir la Table des Matériaux) avec de l'eau distillée plusieurs fois pour la garder exempte de débris. Chargez la chambre avec 5 ml de PSS normal.
   2. Remplissez les deux boîtes en verre d'un PSS normal filtré à l'aide d'une seringue de 5 à 10 ml. Remplissez soigneusement la canule entière et le tube attaché sans introduire de bulles d'air.
   3. Préparer deux sutures en nylon monofilament (10-0, 0,02 mm) avec un demi-noeud chacune à l'aide de forceps émoussés.
   4. Placez les noeuds de suture partiellement fermés sur les deux canudes légèrement loin de la pointe à l'aide de forceps de dissection sous un microscope de dissection. Plus tard, ces noeuds seront glissés et attachés soigneusement sur les extrémités artérielles cannulées pour sécuriser le navire.
3. Isoler et canuler l'artère cérébrale moyenne.
   1. Induire une anesthésie profonde chez un rat Sprague Dawley en utilisant 2 à 4 % d'isoflurane inhalé.
   2. Décapiter le rat à l'aide de guillotine sous anesthésie profonde.
   3. Retirez soigneusement le crâne à l'aide d'un coupe-os et d'un ciseau.
   4. Retirez le cerveau du crâne et placez-le dans 5 ml de PSS faible en calcium sur la glace.
   5. Identifiez et disséquez un segment non ramifié de l'artère cérébrale moyenne de rat (MCA) avec un diamètre intérieur de 100-200 m du cerveau utilisant des ciseaux de ressort et des forceps.
   6. Montez le MCA sur les canules en verre à l'aide de forceps fins et fixez-les en resserrant les sutures dans le myographie contenant un PSS normal.
   7. Fermez la canule distale de sorte qu'il n'y aura pas de flux dans les MCA.
   8. Connectez la pipette d'entrée à un réservoir contenant PSS pour permettre le contrôle de la pression intraluminale qui sera surveillée à l'occasion d'un transducteur de pression en ligne.
   9. Visualisez les MCA cannulés à l'aide d'une caméra couplée à la charge (voir le Tableau des matériaux)montée sur un microscope inversé et un logiciel d'imagerie.
   10. Définir la longueur axiale du MCA à une longueur approximative où il ne doit apparaître ni rigide ni flasque.
   11. Équilibrez la solution de bain avec O₂ (95%) et CO₂ (5%) à 37 oC pour fournir une oxygénation, une température et un pH adéquats à 7,4.
4. Impale (pénétrer la membrane plasmatique cellulaire) les cellules musculaires vasculaires lisses.
   1. Connectez l'électrode du sol et gardez-la immergée dans le PSS du myographie.
   2. Illuminez la chambre du navire et regardez à travers le microscope pour visualiser la pointe de la microélectrode dans la solution de bain.
      REMARQUE: Alternativement, on peut visualiser le MCA et le microélectrode sur un ordinateur ayant un logiciel d'imagerie.
   3. Utilisez les commandes du micromanipulateur pour déplacer la pointe du microélectrode près de la paroi externe du vaisseau sanguin. Le micromanipulateur et la pointe du microélectrode doivent être dans une position stable par rapport au tissu.
      REMARQUE: Avant de commencer les expériences, confirmez que la tension de la membrane s'est stabilisée. Si la tension mesurée est instable, la connexion entre l'électrode et la cellule n'est pas scellée, ce qui indique une fuite.
   4. Commencez l'enregistrement.
   5. Déplacez lentement l'extrémité du microélectrode vers le navire, en visant le centre du navire en utilisant le cours ou le contrôle fin du micromanipulateur.
      REMARQUE: De temps en temps, une petite déviation dans l'enregistrement peut être observée quand la pointe de microélectrode entre en contact avec une membrane de fibre musculaire.
   6. Lorsque la pointe se trouve à proximité du vaisseau, avancez l'électrode vers l'avant en un seul mouvement rapide à l'aide du micromanipulateur pour empaler la membrane du muscle.
   7. À ce stade, on peut commencer à observer les changements dans V_m étant enregistré. Ne touchez pas au micromanipulateur lorsque le microélectrode empale la membrane de la cellule.
      REMARQUE: La différence de tension entre l'électrode d'enregistrement et de référence diminue de 0 mV à entre -40 mV et -75 mV selon le niveau de pression intravasculaire ou d'autres stimuli excitateurs ou inhibiteurs. Ces lectures caractérisent la différence potentielle transmembranaire de la cellule actuelle.
   8. Effectuer plusieurs empalements sur un seul navire dans différentes zones du navire sans endommager les VSMC afin d'obtenir des mesures précises.
   9. Après l'enregistrement, utilisez le manipulateur pour enlever le microélectrode en un seul mouvement rapide.
   10. Arrêtez l'enregistrement et enregistrez les fichiers de données pour une analyse plus approfondie.

Résultats

La méthode présentée peut être utilisée de façon fiable pour enregistrer V_m dans des navires cannulés. Une brève procédure décrivant comment isoler le MCA du cerveau est présentée à la figure 1A. Après avoir séparé le cerveau du crâne, le MCA a été disséqué et placé dans un plat de Petri contenant le PSS bas de calcium. Une partie du tissu conjonctif qui a été attaché a également été disséqué avec MCA utilisant des cis...

Discussion

Cet article fournit les étapes nécessaires sur la façon d'utiliser une méthode d'empalement de microélectrode forte pour enregistrer V_m à partir d'une préparation de navire cannulated. Cette méthode est largement utilisée, et offre des enregistrements cohérents de haute qualité de V_m qui répondent à un large éventail de questions expérimentales.

Certaines considérations critiques et des étapes de dépannage sont décrites ici pour assurer le succès de la...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser	Parkland scientific	V3000PK
Dissection microscope	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer Bone Cutter	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps	Fine science tools	11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt	Fine science tools	14008-14
Suture	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas Spring Scissors	Fine science tools	15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera	Qimaging, , BC	Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier	WPI	FD223A
In-line pressure transducer	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelectrodes	Warner Instruments LLC, CT	G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe)	WPI	MF28G67-5
Microelectrode holder	WPI	MEH1SF
Myograph	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
Puller	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
Vibration-free table	TMC	3435-14
Softwares
Clampex 10	Molecular devices
p Clamp 10	Molecular devices
Imaging software	Nikon, NY	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
Glucose	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761