Método do impalement do microelétrodo para gravar o potencial da membrana de uma artéria cerebral média Cannulated

Resumo

O objetivo preliminar deste artigo é fornecer detalhes de como gravar o potencial da membrana (V_m) da artéria cerebral média usando o método do impalement do microelétrodo. A artéria cerebral média canulada é equilibrada para ganhar o Tom miogênico, e a parede do vaso é empalada usando microeletrodos de alta resistência.

Resumo

O potencial de membrana (V_m) das células musculares lisas vasculares determina o tom do vaso e, portanto, o fluxo sanguíneo para um órgão. Mudanças na expressão e função de canais iônicos e bombas eletrogênicas que regulam V_m em condições de doença poderiam potencialmente alterar v_m, tônus vascular e fluxo sanguíneo. Assim, uma compreensão básica da eletrofisiologia e os métodos necessários para gravar com precisão V_m em Estados saudáveis e doentes são essenciais. Este método permitirá modulando V_m usando diferentes agentes farmacológicos para restaurar v_m. Embora existam vários métodos, cada um com suas vantagens e desvantagens, este artigo fornece protocolos para registro de V_m de vasos de resistência canulados, como a artéria cerebral média, utilizando o método de empalamento do microeletrodo. As artérias cerebrais médias podem ganhar o Tom myogenic em uma câmara do miógrafo, e a parede da embarcação é empalada usando microeletrodos da resistência elevada. O sinal de V_m é coletado através de um electrometer, digitalizado, e analisado. Este método fornece uma leitura exata do V_m de uma parede da embarcação sem danificar as pilhas e sem mudar a resistência da membrana.

Introdução

O potencial de membrana (V_m) de uma célula refere-se à diferença relativa da carga iónica através da membrana plasmática e a permeabilidade relativa da membrana a estes íons. O V_m é gerado pela distribuição diferencial de íons e é mantido por canais de íons e bombas. Os canais iônicos como K⁺, na⁺e CL⁻ contribuem substancialmente para o repouso V_m. As pilhas de músculo liso vasculares (VSMCs) expressam mais de quatro tipos diferentes de K⁺ Channels¹, dois tipos de CA^{2 +} Channels tensão-fechados (vgcc)², mais de dois tipos de CL⁻ canaletas^{3, 4. º , 5}, loja-operado CA^{2 +} canais⁶, estiramento-ativado catiões^7,8, e electrogénico sódio-potássio ATPase bombas⁹ em suas membranas plasmáticas, todos os quais podem ser envolvidos na regulação da V_m.

O V_m de VSMCs depende da pressão do lúmen. Em vasos não pressurizados, V_m varia de-50 a-65 MV, porém, em segmentos arteriais pressurizados, v_m varia de-37 a-47 MV¹⁰. A elevação da pressão intravascular faz com que os vsmcs despolarize¹¹, diminua o limiar para a abertura de vgcc, e aumente o afluxo do cálcio que contribui ao desenvolvimento do Tom myogenic¹². Pelo contrário, em vasos passivos ou não-pressurizados, a hiperpolarização da membrana, devido à alta atividade de K⁺ Channel, impedirá a abertura do vgcc, resultando em uma entrada de cálcio limitada e uma diminuição no cálcio intracelular, contribuindo para menos tônus vascular¹³. Assim, V_m devido às mudanças na pressão do lúmen parece desempenhar um papel essencial no desenvolvimento do Tom vascular, e ambos Vgcc e K⁺ canais desempenham um papel crucial na regulação da V_m.

V_m varia entre o tipo de embarcação e as espécies. V_m é-54 ± 1,3 MV em tiras arteriais mesentéricas superiores¹⁴,-45 ± 1 mV nas artérias cerebrais médias de ratos a 60 mmHg de pressão do lúmen¹²e-35 ± 1 mV em artérias parenquimatosas de ratos a 40 mmHg de pressão do lúmen¹⁵. O V_m de repouso gravado em músculo linfático de rato não esticado é de-48 ± 2 MV¹⁶. V_m de VSMCs cerebrais é mais negativo do que nas artérias periféricas. Na comparação, as artérias cerebrais médias Feline foram relatadas para ter um V_m de aproximadamente-70 MV, quando as artérias mesentérica e coronárias foram relatadas para ter-49 e-58 MV, respectivamente^17,18. As diferenças na V_m em leitos vasculares podem refletir as diferenças na expressão e função dos canais iônicos e das bombas eletrogênicas de sódio e potássio.

Os aumentos e as diminuições em V_m são referidos como a despolarização da membrana e a hiperpolarização, respectivamente. Essas alterações na V_m desempenham um papel central em muitos processos fisiológicos, incluindo gating de canal iônico, sinalização celular, contração muscular e propagação do potencial de ação. A uma pressão fixa, muitos compostos vasodilatadores endógenos e sintéticos que ativam canais K⁺ causam hiperpolarização da membrana, resultando em vasodilatação^1,13. Inversamente, a despolarização sustentada da membrana é vital na vasoconstrição agonista-induzida ou receptor-negociada¹⁹. V_m é uma variável crítica que não só regula CA^{2 +} afluxo através do vgcc¹³ , mas também influencia a liberação de CA^{2 +} de lojas internas^20,21 e CA^{2 +}-sensibilidade de o aparelho contrátil²².

Embora existam vários métodos para gravar V_m de diferentes tipos de células, os dados coletados a partir do método de empalamento de microeletrodos de vasos canulados parece ser mais fisiológico do que os dados obtidos a partir de VSMCs isolados. Quando gravado de VSMC isolado usando métodos atuais da braçadeira, V_m é visto como hyperpolarizations transientes espontâneos em VSMCs²⁴. VSMCs isolados não estão no Syncytium, e as mudanças na resistência da série podem contribuir ao comportamento oscilatório de V_m. Por outro lado, o comportamento oscilatório não é observado quando o V_m é gravado a partir de vasos intactos, provavelmente devido ao contato celular entre os VSMCs que estão no Syncytium na artéria e são somados em todo o vaso levando a um v_m ^{estável 24}. assim, a medida de V_m dos vasos pressurizados usando a técnica padrão do empalement do microelétrodo é relativamente próxima às circunstâncias physiological.

A gravação de V_m de vasos canulados poderia fornecer informações vitais, uma vez que v_m de vsmcs que estão em Syncytium é um dos principais determinantes do tônus vascular e fluxo sanguíneo, e a modulação do v_m poderia fornecer uma maneira de dilatar ou contraem os vasos sanguíneos. Assim, é essencial compreender a metodologia envolvida na gravação de V_m. Este artigo descreve a gravação intracelular de V_m das artérias cerebrais médias canulados (MCAS) usando um método do impalement do microelétrodo. Este protocolo descreverá como preparar MCAS, microeletrodos, configurar o eletrômetro e executar o método de empalamento para gravar V_m. Também, os dados representativos, os problemas comuns que foram encontrados ao usar este método e os problemas potenciais são discutidos.

Protocolo

Os ratos machos foram alojados na unidade de cuidados com animais da UMMC, que é aprovada pela Associação para avaliação e acreditação de cuidados com animais de laboratório (AAALAC). Os animais tiveram livre acesso à alimentação e à água durante todo o estudo. Os animais foram mantidos em ambiente controlado com temperatura a 24 ± 2 ° c, níveis de umidade de 60 – 80% e 12 h de luz/ciclos escuros. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais da UMMC.

1. preparação do equipamento

1. Coloque um amplificador de eletrômetro diferencial de canal duplo (veja a tabela de materiais) perto da câmara do vaso e no local pretendido.
2. Conecte a saída do canal a ou B do amplificador à entrada do canal do digitalizador com um cabo BNC-BNC.
3. Monte a sonda no micromanipulador e coloque-a perto do microscópio e do miografo. A configuração de gravação deve ser instalada em uma tabela sem vibrações.
4. Coloque os botões e interruptores na parte frontal do amplificador em posições que o configuram para este experimento, conforme descrito no manual.
5. Conecte a terra do banho à terra do circuito do amplificador através com um elétrodo apropriado. Similarmente, assegure-se de que a gaiola esteja aterrada ao chassi do amplificador.

2. preparação de microeletrodos e montagem

1. Use microeletrodos de vidro de borosilicato (veja a tabela de materiais) e puxe a ponta de vidro para ter um cone de 8 – 10 mm, diâmetro de < 1 μm e resistência de 80 – 120 MΩ quando preenchido com KCl de 3 M.
   1. Use um extrator padrão para conseguir um afilamento gradual curto usando as seguintes configurações: Heat = 650; velocidade = 20; puxar = 25; tempo = 250 e loop duas vezes para resistências mais elevadas e pontas menores. Consulte a tabela de materiais , pois as configurações são específicas do instrumento.
      Nota: Os diâmetros da ponta < 1 μm causarão dano mínimo à pilha quando empalados.
2. Encha o microelétrodo com o KCl de 3 M usando uma seringa do microfiber (veja a tabela de materiais).
   1. Puxe lentamente o êmbolo da seringa de microfibra para cima enquanto injetando o KCl de 3 M no microeletrodo para permitir que o fluido encha e impeça a formação de bolhas de ar no interior do microeletrodo.
   2. Encha o microeletrodo até ficar cheio e assegure-se de que não haja bolhas de ar antes de colocá-la no suporte do microeletrodo. Se as bolhas estiverem presentes, Bata suavemente no microeletrodo com um dedo para remover as bolhas.
3. Exercitando o cuidado, empurre firmemente o Shank do elétrodo no suporte através do furo furado. Se o excesso de fluido estiver presente, retire-o com um lenço.
4. Conecte o conjunto do suporte do eletrodo à sonda do amplificador. Conduza um teste do elétrodo, ajuste o offset da entrada, verifique a configuração zero e verific o escapamento da entrada da ponta de prova como por o manual do amplificador.
5. Meça a resistência do eletrodo usando um teste de eletrodo como mostrado na tabela 1.
6. Note-se que um eletrodo de trabalho exibe uma mudança de tensão DC positiva de 1 mV/MΩ na saída do canal. Por outro lado, se uma grande tensão aparece na saída do canal e no medidor, isso indica um eletrodo bloqueado ou quebrado.
7. Abra o software de gravação, atribua um nome ao arquivo e salve-o para análise futura em um software de armazenamento.

3. isolamento e canulação da artéria cerebral média

1. Preparação dos reagentes.
   1. Prepare a solução de sal fisiológico de cálcio normal e baixo (PSS), conforme descrito na tabela 2.
2. Prepare o miografo.
   1. Enxágüe a câmara miográfica (ver a tabela de materiais) com água destilada várias vezes para mantê-lo livre de detritos. Carregue a câmara com 5 mL de PSS normal.
   2. Encha ambas as cânulas de vidro com o PSS normal filtrado usando uma seringa de 5 – 10 mL. Encha com cuidado a cânula inteira e a tubulação unida sem introduzir nenhumas bolhas de ar.
   3. Prepare duas suturas de nylon do monofilamento (10-0, 0, 2 milímetros) com um Half-Knot cada um que usa o fórceps sem corte.
   4. Coloc os nós parcialmente fechados da sutura em ambas as cânulas ligeiramente longe da ponta usando o fórceps da dissecção um microscópio da dissecção. Mais tarde estes nós serão deslizados fora e amarrado com cuidado sobre as extremidades arteriais canulados para fixar a embarcação.
3. Isole e canular a artéria cerebral média.
   1. Induzir anestesia profunda em um rato de Sprague Dawley usando 2 – 4% de isoflurano inalatório.
   2. Decapitar o rato usando guilhotina anestesia profunda.
   3. Retire cuidadosamente o crânio usando um cortador de osso e uma tesoura.
   4. Retire o cérebro do crânio e coloque-o em 5 mL de PSS de baixo cálcio no gelo.
   5. Identifique e dissecar um segmento não ramificado da artéria cerebral média do rato (MCA) com um diâmetro interno de 100 – 200 μm do cérebro usando tesouras e fórceps da mola.
   6. Monte o MCA nas cânulas de vidro usando o fórceps fino e fixe apertando as suturas no miógrafo que contem o PSS normal.
   7. Feche a cânula distal para que não haja fluxo dentro das MCAs.
   8. Conecte a pipeta do entrada a um reservatório que prende PSS para permitir o controle da pressão intraluminal que será monitorada com um transdutor de pressão in-line.
   9. Visualize as MCAs canuladas usando uma câmera de dispositivo acoplada por carga (consulte a tabela de materiais) montada em um microscópio invertido e um software de imagem.
   10. Ajuste o comprimento axial do MCA a um comprimento aproximado onde deva aparecer nem rígido nem flaccid.
   11. Equilibrar a solução de banho com O₂ (95%) e CO₂ (5%) a 37 ° c para fornecer oxigenação adequada, temperatura e manter o pH em 7,4.
4. Empalar (penetrar na membrana plasmática celular) as células musculares lisas vasculares.
   1. Conecte o eletrodo de aterramento e mantenha-o imerso no PSS do miografo.
   2. Ilumine a câmara do vaso e olhe através do microscópio para visualizar a ponta do microelétrodo na solução do banho.
      Nota: Alternativamente, pode-se Visualizar o MCA e microeletrodo em um computador com um software de imagem.
   3. Use os controles do micromanipulador para mover a ponta do microeletrodo perto da parede externa do vaso sanguíneo. O micromanipulador e a ponta do microeletrodo devem estar em uma posição estável em relação ao tecido.
      Nota: Antes de iniciar experimentos, confirme que a tensão da membrana estabilizou. Se a tensão medida for instável, a ligação entre o eléctrodo e a célula não é selada, indicando um vazamento.
   4. Comece a gravação.
   5. Mova lentamente a ponta do microelétrodo para a embarcação, apontando para o centro da embarcação usando o curso ou o controle fino do micromanipulator.
      Nota: Ocasionalmente, uma pequena deflexão na gravação pode ser observada quando a ponta do microeletrodo contata uma membrana de fibra muscular.
   6. Quando a ponta vem na proximidade próxima à embarcação, avance o elétrodo para a frente em um movimento rápido usando o micromanipulador para empalbar a membrana do músculo.
   7. Neste ponto, pode-se começar a observar as alterações em V_m sendo gravado. Não toque no micromanipulador quando o microeletrodo empalaliza a membrana da célula.
      Nota: A diferença de tensão entre o eletrodo de registro e de referência diminui de 0 mV para entre-40 mV e-75 mV dependendo do nível de pressão intravascular ou outros estímulos excitatórios ou inibidores. Estas leituras caracterizam a diferença potencial do transmembrana da pilha atual.
   8. Realize vários empalamentos em uma única embarcação em diferentes áreas da embarcação sem danificar VSMCs para obter medições precisas.
   9. Após a gravação, use o manipulador para remover o microeletrodo em um movimento rápido.
   10. Interrompa a gravação e salve os arquivos de dados para análise posterior.

Resultados

O método apresentado pode ser usado confiantemente para gravar V_m em embarcações canulados. Um breve procedimento descrevendo como isolar MCA do cérebro é apresentado na Figura 1a. Após separar o cérebro do crânio, o MCA foi dissecado para fora e coloc em um prato de Petri que contem o baixo cálcio PSS. Parte do tecido conjuntivo que foi anexado também foi dissecado juntamente com MCA usando tesouras de mola e fórceps para evitar danos a...

Discussão

Este artigo fornece as etapas necessárias em como usar um método afiado do impalement do microelétrodo para gravar V_m de uma preparação canulados da embarcação. Este método é amplamente utilizado, e oferece gravações consistentes de alta qualidade de V_m que respondem a uma vasta gama de perguntas experimentais.

Algumas considerações críticas e etapas de solução de problemas são descritas aqui para garantir o sucesso do método. A qualidade do microeletrod...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser	Parkland scientific	V3000PK
Dissection microscope	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer Bone Cutter	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps	Fine science tools	11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt	Fine science tools	14008-14
Suture	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas Spring Scissors	Fine science tools	15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera	Qimaging, , BC	Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier	WPI	FD223A
In-line pressure transducer	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelectrodes	Warner Instruments LLC, CT	G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe)	WPI	MF28G67-5
Microelectrode holder	WPI	MEH1SF
Myograph	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
Puller	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
Vibration-free table	TMC	3435-14
Softwares
Clampex 10	Molecular devices
p Clamp 10	Molecular devices
Imaging software	Nikon, NY	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
Glucose	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761