שיטת החלוקה של מיקרו-אלקטרודה להקלטת פוטנציאל ממברנה מעורק מוחי אמצעי של קאננולוב

Summary

המטרה העיקרית של מאמר זה היא לספק פרטים כיצד להקליט פוטנציאל ממברנה (V_m) מעורק המוח האמצעי באמצעות שיטת החלוקה של המיקרואלקטרודה. העורק האמצעי של המוח הבינוני הוא בינוני כדי לצבור טון מיוגני, והקיר כלי מופד באמצעות מיקרואלקטרודות עמידות גבוהה.

Abstract

פוטנציאל ממברנה (V_m) של תאים וסקולרית חלקה שרירים קובע את הטון כלי ולכן זרימת הדם לאיבר. שינויים בביטוי ובתפקוד של ערוצי יונים ומשאבות אלקטרוגניים המסדירים V_m בתנאי מחלה עלול לשנות v_m, הטון כלי דם, זרימת הדם. לפיכך, הבנה בסיסית של האלקטרופיזיולוגיה והשיטות הדרושות לתיעוד מדויק של V_m במדינות בריאות וחולות חיוניות. שיטה זו תאפשר V_m מאפטינג באמצעות סוכני תרופתי שונים כדי לשחזר v_m. למרות שישנן מספר שיטות, כל אחד עם יתרונות וחסרונות, מאמר זה מספק פרוטוקולים להקליט V_m מכלי התנגדות can, כמו עורק המוח האמצעי באמצעות שיטת החלוקה מיקרואלקטרודה. העורקים האמצעיים מורשים לצבור טון מיוגני בחדר מיוגרף, וקיר כלי הקיבול מופד באמצעות מיקרואלקטרודות עמידות גבוהה. האות V_m נאסף דרך מד חשמלית, סרוקים, ומנותח. שיטה זו מספקת קריאה מדויקת של V_m של קיר כלי מבלי לפגוע בתאים ומבלי לשנות את התנגדות הקרום.

Introduction

פוטנציאל הממברנה (V_m) של תא מתייחס להפרש היחסי של המטען היוני על פני קרום הפלזמה והחדירות היחסיות של הקרום ליונים אלה. ה-V_m מופק על ידי התפלגות דיפרנציאלית של יונים והוא מתוחזק על ידי ערוצי יונים ומשאבות. ערוצי יונים כגון K⁺, Na⁺, ו- Cl לתרום באופן משמעותיעל V מנוחה. תאי שריר וסקולריים חלקים (VSMCs) מבטאים יותר מארבעה סוגים שונים של K⁺ ערוצים¹, שני סוגים של Ca מגודרת מתח^{2 +} ערוצים (וומשפ)², יותר משני סוגים של הערוצים Cl^{3, ד , 5}, Ca מופעל החנות^{2 +} ערוצים⁶, מתיחה מופעל ערוצי הקטיון^7,8, ו אלקטרוגניים נתרן אשלגן משאבות atpase⁹ בקרום הפלזמה שלהם, כולם עשויים להיות מעורב בוויסות של V_m.

המבקרים של VSMCs תלויים בלחץ של לומן. בכלי שאינו מווסת, V_m משתנה מ-50 ל-65 mV, עם זאת, במקטעים עורקים בלחץ, V_m טווחים מ-37 כדי-47 mV¹⁰. העלאת הלחץ הintravascular גורמת ל-VSMCs להקטטת¹¹, מקטינה את הסף לפתיחת ומדינת ומגבירה את הזרמת הסידן לפיתוח הטון היוגני¹². להיפך, בכלי של פסיבי או לא בלחץ, היפרפולריזציה ממברנה, בשל פעילות גבוהה K⁺ ערוץ, תמנע vgcc ש מפתיחה, וכתוצאה מכך כניסת סידן מוגבלת ירידה סידן תאיים, תורם פחות וסקולרית מגוון¹³ כך, V_m בשל שינויים בלחץ לומן מופיע לשחק תפקיד חיוני בפיתוח הטון כלי דם, הן vgcc ו-K⁺ ערוצים לשחק תפקיד מכריע בוויסות של V_m.

V_m משתנה בין סוג כלי ומינים. V_m הוא-54 ± 1.3 mV ב החזיר גינאה מעולה רצועות עורק מצע¹⁴,-45 ± 1 mV בתוך העורקים התיכונה במוח באמצע בשנת 60 mmhg לומן¹², ו-35 ± 1 mV ב החולדה בתוך העורק העכברוש בשנת 40 משעה לומן לחץ¹⁵. V_m מנוחה הקליט שריר לימפטי עכברוש לא מתוח הוא-48 ± 2 mV¹⁶. V_m של המוח VSMCs שלילי יותר מאשר בעורקים היקפיים. לעומת זאת, העורקים האמצעיים הביניים של חתולים דווחו להיות V_m של כ-70 mV, בעוד מסנטרמית ועורקים כליליים דווחו יש-49 ו-58 mV, בהתאמה^17,18. הבדלים ב V_m על פני מיטות כלי הדם עשויים לשקף את ההבדלים בביטוי ותפקוד של ערוצי יונים ומשאבות אלקטרוגניים נתרן אשלגן.

עליות וירידות ב V_m מכונים דפולריזציה קרום ו hyperpolarization, בהתאמה. שינויים אלה ב-V_m לשחק תפקיד מרכזי בתהליכים פיסיולוגיים רבים, כולל ערוץ יון הערוצים, איתות התא, התכווצות שרירים, פעולה פוטנציאלית התפשטות. בלחץ קבוע, הרבה אנדוגני וחומרים סינתטיים vasodilator המפעילים K⁺ ערוצים לגרום היפרפולריזציה ממברנה, וכתוצאה מכך vasodשיער^1,13. לעומת זאת, הממברנה הקרום המתמשכת היא חיונית ב אגוניסט-המושרה או קולטן בתיווך מתווך¹⁹. V_m הוא משתנה קריטי שלא רק מווסת את ca^{2 +} זרם דרך vgcc¹³ אלא גם משפיע על שחרורו של ca^{2 +} מחנויות פנימיות^20,21 ו-ca²-רגישות של את מנגנון הקונאקטולה²²

אמנם ישנן מספר שיטות כדי להקליט V_m מסוגי תאים שונים, נתונים שנאספו מהשיטה החלוקה של המיקרו אלקטרודה של כלי הקנוליום נראה פיזיולוגי יותר מאשר נתונים שהתקבלו VSMCs מבודדים. כאשר הוקלט מ VSMC מבודדים באמצעות שיטות התפס הנוכחי, V_m הוא נראה כמו היפרפולציות חולף ספונטנית ב Vsmc²⁴. VSMCs מבודדים אינם בסינציציום, והשינויים בהתנגדות הסדרה עשויים לתרום להתנהגות הנדנוד של V_m. מצד שני, התנהגות מנדנוד לא נצפתה כאשר V_m נרשם מכלי שלמים, כנראה בגלל מגע תא תא בין VSMCs כי הם בתוך syncytium בעורק ומואבקים ברחבי הכלי המוביל V m יציבה ²⁴. לפיכך, המדידה של V_m מכלי הלחץ באמצעות טכניקת החלוקה המיקרואלקטרודה הסטנדרטית קרובה יחסית לתנאים הפיזיולוגיים.

הקלטת V_m מכלי הקיבול יכול לספק מידע חיוני, מאז V_m של vsmcs כי הם בסינציציום הוא אחד הדטרמיניזם העיקרי של הטון וזרימת הדם, והאפנון של V_m יכול לספק דרך להתרחב או כלי דם נוקשים. לכן, חיוני להבין את המתודולוגיה הכרוכה בהקלטת V_m. מאמר זה מתאר הקלטה תאיים של V_m מתוך העורקים האמצעיים הבינוני canנולה (mcas) באמצעות שיטת מימון מיקרואלקטרודה. פרוטוקול זה יתאר כיצד להכין MCAs, microelectrodes, להגדיר את מד האלקטו לבצע את שיטת החלוקה כדי להקליט V_m. כמו כן, נתונים מייצגים, בעיות נפוצות שאירעו בעת שימוש בשיטה זו ונדונו בעיות פוטנציאליות.

Protocol

העכברושים הזכרים שוכנו במתקן לטיפול בבעלי חיים ב UMMC, אשר אושרה על ידי האגודה להערכת והסמכה של טיפול בבעלי חיים מעבדה (AAALAC). לבעלי החיים הייתה גישה חופשית למזון ולמים במהלך המחקר. בעלי חיים שמרו בסביבה מבוקרת עם טמפרטורה של 24 ± 2 ° צ', רמות לחות של 60-80% ו 12 h מחזורי אור/כהה. כל הפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשימוש UMMC.

1. הכנת ציוד

1. מניחים מגבר כפול בערוץ התקשורת הדיפרנציאלי (ראה טבלת החומרים) קרוב לחדר הקיבול ובמיקום הרצוי.
2. חבר את הפלט של ערוץ המגבר A או B לכניסת הערוץ של התקן הדיגיטציה עם כבל BNC-BNC.
3. הרכב המקדח במיקרומניפולציה ומניחים אותו ליד המיקרוסקופ והיוגרף. יש להתקין את כיוונון ההקלטה על שולחן ללא רטט.
4. הצב את הידיות והמתגים בחזית המגבר במיקומים הקובעים את התצורה שלו לניסוי זה כמתואר במדריך.
5. לחבר את הקרקע אמבטיה לשטח המעגל של המגבר דרך עם האלקטרודה המתאימה. באופן דומה, ודא שהכלוב מקורקע למארז המגבר.

2. הכנת מיקרואלקטרודות והרכבה

1. השתמש מיקרואלקטרודות זכוכית בורוסיליקט (לראות את הטבלה של חומרים) ולמשוך את העצה זכוכית יש 8 – 10 מ"מ להתחדד, קוטר של < 1 יקרומטר ו התנגדות של 80 – 120 MΩ כאשר מתמלא 3 M kcl.
   1. השתמש בפולר רגיל כדי להשיג להתחדד הדרגתית קצר באמצעות ההגדרות הבאות: חום = 650; מהירות = 20; למשוך = 25; time = 250 ולולאה פעמיים לעמידות גבוהה יותר ועצות קטנות יותר. עיין בטבלת החומרים כאשר ההגדרות הן ספציפיות לכלי.
      הערה: העצה קטרים < 1 יקרומטר יגרום נזק מינימלי לתא כאשר שופד.
2. ממלאים את המיקרואלקטרודה עם 3 מטרים מתוך מזרק מיקרופייבר (ראו את שולחן החומרים).
   1. משוך באיטיות את הבוכנה של מזרק מיקרופייבר תוך הזרקת 3 מ ' KCl לתוך המיקרואלקטרודה כדי לאפשר מקום לנוזל למלא ולמנוע היווצרות בועות אוויר בתוך המיקרואלקטרודה.
   2. למלא את המיקרואלקטרודה עד מלא ולהבטיח כי אין בועות אוויר לפני הצבת אותו במחזיק מיקרואלקטרודה. אם הבועות הם נוכחים, הקש בעדינות על מיקרואלקטרודה עם אצבע כדי להסיר את הבועות.
3. פעילות גופנית, לדחוף בחוזקה את האלקטרודה לתוך המחזיק דרך חור משועמם. אם נוזל עודף קיים, להסיר אותו עם רקמה.
4. חבר את מכלול מחזיק האלקטרודות לגשוש המגבר. ביצוע בדיקת אלקטרודה, כוונן את היסט הקלט, ודא אפס הגדרה ובדוק את דליפת קלט הבדיקה לפי המדריך למגבר.
5. מדידת עמידות האלקטרודה באמצעות בדיקת אלקטרודה כפי שמוצג בטבלה 1.
6. שים לב שאלקטרודה עובדת מציגה משמרת חיובית של מתח DC של 1 mV/MΩ בפלט הערוץ. מצד שני, אם מתח גדול מופיע על הפלט הערוץ ועל מד, זה מצביע על אלקטרודה חסומה או שבורה.
7. פתח את תוכנת ההקלטה, הקצה שם לקובץ ושמור אותו לניתוח עתידי בתוכנת אחסון.

3. בידוד והצינורית של עורק המוח האמצעי

1. הכנת הריאגנטים.
   1. הכינו פתרון רגיל ונמוך של סידן פיזיולוגי (PSS) כמתואר בטבלה 2.
2. הכן את היוגרף.
   1. לשטוף את החדר מיוגרף (לראות את הטבלה של חומרים) עם מים מזוקקים פעמים מרובות כדי לשמור את זה ללא פסולת. טען את התא עם 5 מ ל של PSS נורמלי.
   2. ממלאים את שתי הצינורית זכוכית עם PSS רגיל מסוננים באמצעות מזרק 5-10 מ"ל. מלאו בזהירות את הצינורית כולה ואת הצינורות המצורפים בלי להציג בועות אוויר.
   3. הכינו שני תפרים מונופינט (10-0, 0.02 מ"מ) עם חצי קשר כל אחד באמצעות מלקחיים קהה.
   4. מניחים את התפר הסגור חלקית על שתי הצינורית מעט מהקצה באמצעות מלקחיים לחיתוך תחת מיקרוסקופ לנתיחה. מאוחר יותר הקשרים האלה החליקה וקשרו בזהירות על קצות העורקים הקנולסיים כדי לאבטח את כלי הקיבול.
3. . בידוד וצינורית בעורק האמצעי
   1. לגרום להרדמה מעמיקה בחולדה מג דאולי באמצעות 2 – 4% בשאיפה.
   2. ערוף את ראשו של העכברוש. באמצעות גיליוטינה בהרדמה עמוקה
   3. הסר בזהירות את הגולגולת באמצעות חותך העצם ומספריים.
   4. להסיר את המוח מהגולגולת ולמקם אותו ב 5 מ ל של סידן נמוך PSS על קרח.
   5. לזהות ולבתר קטע בלתי מסועף של עורק המוח האמצעי של עכברוש (MCA) עם קוטר פנימי של 100-200 יקרומטר מהמוח באמצעות מספריים באביב מלקחיים.
   6. הר MCA על הצינורית זכוכית באמצעות מלקחיים עדינים ומאובטח על ידי הידוק התפרים בתוך מיוגרף המכיל PSS נורמלי.
   7. , תסגור את הצינורית הזאת. כך שלא תהיה זרימה בתוך המקאס
   8. חבר את הצנרת הנכנס למאגר המחזיק PSS כדי לאפשר שליטה של לחץ intraluminal אשר יהיה מפוקח עם מתמר לחץ בתוך השורה.
   9. המחש את MCAs מקאס באמצעות מצלמת התקן בתשלום (ראה את טבלת החומרים) רכוב על מיקרוסקופ הפוך ותוכנת דימות.
   10. הגדר את אורך הציר של MCA לאורך משוער שבו הוא אמור להופיע לא נוקשה ולא רפוי.
   11. באמצעות שיווי משקל הפתרון עם O₂ (95%) ו-CO₂ (5%) ב 37 ° c כדי לספק חמצן מספקת, טמפרטורה כדי לשמור על pH ב 7.4.
4. לדקור (לחדור את קרום פלזמה התא) התאים שריר חלק כלי הדם.
   1. לחבר את האלקטרודות הקרקע ולשמור אותו שקוע PSS של מיוגרף.
   2. יאיר את תא כלי הקיבול והסתכל דרך המיקרוסקופ כדי להמחיש את קצה המיקרואלקטרודה בתמיסה של האמבט.
      הערה: לחילופין, ניתן לדמיין את ה-MCA והמיקרואלקטרודה במחשב בעל תוכנת דימות.
   3. השתמש בבקרי המיקרומניפולציה כדי להזיז את קצה המיקרואלקטרודה קרוב לקיר החיצוני של כלי הדם. המיקרומניפולציה וקצה המיקרואלקטרודה חייבים להיות במצב יציב ביחס לרקמה.
      הערה: , לפני תחילת הניסויים. אשרו שמתח הקרום התייצב אם המתח הנמדד אינו יציב, החיבור בין האלקטרודה לבין התא אינו אטום, ומצביע על דליפה.
   4. . התחילו בהקלטה
   5. הזיזו לאט את קצה המיקרואלקטרודה לעבר כלי הקיבול, המכוונים למרכז הכלי באמצעות כמובן או שליטה עדינה על המיקרומניפולציה.
      הערה: מדי פעם, הסטה קטנה בהקלטה עשויה להיות נצפתה כאשר הטיפ מיקרואלקטרודה קשר קרום סיבי השריר.
   6. כאשר העצה מגיעה בסמיכות לכלי הקיבול, העבר את האלקטרודה קדימה בתנועה מהירה אחת באמצעות המיקרומניפולציה כדי לבודד את קרום השריר.
   7. בשלב זה, ניתן להתחיל להתבונן בשינויים ב-V_m המוקלטת. אין לגעת במיקרומניפולציה כאשר המיקרואלקטרודה מחלק את קרום התא.
      הערה: ההבדל בין מתח בין ההקלטה והיעץ האלקטרודה פוחתת מ -0 mV ל בין-40 mV ו-75 mV בהתאם לרמת הלחץ הintravascular או גירויים אחרים או גירוי מעכבות. קריאות אלה מאפיינות את ההפרש הפוטנציאלי האפשרי של התא הנוכחי.
   8. ביצוע מספר רב של מבצעים על כלי אחד באזורים שונים של הכלי מבלי לפגוע VSMCs כדי לקבל מדידות מדויקות.
   9. לאחר ההקלטה, השתמש מניפולטור כדי להסיר את המיקרואלקטרודה בתנועה אחת מהירה.
   10. עצור את ההקלטה ושמור קבצי נתונים לצורך ניתוח נוסף.

תוצאות

ניתן להשתמש בשיטה המוצגת באופן אמין להקלטת V_m בכלי קננולזה. הליך קצר המתאר כיצד לבודד את MCA מהמוח מוצג באיור 1A. לאחר הפרדת המוח מהגולגולת, הMCA הייתה מגולגלת ומונחת בצלחת פטרי המכילה את הסידן הנמוך PSS. חלק מרקמת החיבור כי היה מצורף גם היה גזור יחד עם MCA בא...

Discussion

מאמר זה מספק את השלבים הדרושים על אופן השימוש בשיטת החלוקה מיקרואלקטרודה חדה כדי להקליט את V_m מהכנה של כלי קיבול. שיטה זו משמשת רבות, ומציעה הקלטות באיכות גבוהה ועקביות של V_m העונים על מגוון רחב של שאלות נסיוניות.

מספר שיקולים קריטיים ושלבי פתרון בעיות מתוארים כאן ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser	Parkland scientific	V3000PK
Dissection microscope	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer Bone Cutter	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps	Fine science tools	11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt	Fine science tools	14008-14
Suture	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas Spring Scissors	Fine science tools	15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera	Qimaging, , BC	Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier	WPI	FD223A
In-line pressure transducer	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelectrodes	Warner Instruments LLC, CT	G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe)	WPI	MF28G67-5
Microelectrode holder	WPI	MEH1SF
Myograph	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
Puller	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
Vibration-free table	TMC	3435-14
Softwares
Clampex 10	Molecular devices
p Clamp 10	Molecular devices
Imaging software	Nikon, NY	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
Glucose	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761