Mikroelektrot Impalement yöntemi bir kanüle orta serebral arter membran potansiyelini kaydetmek için

Özet

Bu makalenin birincil amacı, mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemini kullanarak orta serebral arter membran potansiyelinin (V_m) nasıl kaydetilme ayrıntılarını sağlamalıdır. Kanüle orta serebral arter miyojenik tonu elde etmek için dengelenmiş, ve damar duvarı yüksek direnç mikroelektrotları kullanılarak kazığa olduğunu.

Özet

Membran potansiyeli (V_m) vasküler pürüzsüz kas hücrelerinin damar tonu ve böylece bir organ kan akışını belirler. Hastalık koşullarında V_m düzenleyen iyon kanalları ve elektrojenik pompalar ifade ve fonksiyon değişiklikleri potansiyel v_mdeğiştirebilir, vasküler ton, ve kan akışı. Böylece, Elektrofizyoloji temel bir anlayış ve doğru sağlıklı ve hastalıklı Devletler V_m kaydetmek için gerekli yöntemleri esastır. Bu yöntem v m 'yi geri yüklemek için farklı farmakolojik ajanlar kullanarak modül V_m izin verecektir. Her ne kadar çeşitli yöntemler vardır, her biri avantajları ve dezavantajları ile, bu makalede mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi kullanarak orta serebral arter gibi kanüllü direnç damarlarından V_m kaydetmek için protokoller sağlar. Orta serebral arterlerin bir miyografi odasında miyojenik tonu elde etmek için izin verilir, ve damar duvarı yüksek direnç mikroelektrotlar kullanılarak kazığa. V_m sinyali, Digitized ve analiz edilen bir elektrometre aracılığıyla toplanır. Bu yöntem, hücrelere zarar vermeden ve membran direncini değiştirmeden bir damar duvarının V_m 'nin doğru bir şekilde okunmasını sağlar.

Giriş

Bir hücrenin membran potansiyeli (V_m), plazma membranında iyonik şarjın göreceli farkını ve membranın bu iyonlara göreli geçirgenliğini ifade eder. V_m , iyonların diferansiyel dağılımı ile üretilir ve iyon kanalları ve pompaları ile korunur. K⁺, na⁺ve CL gibi Iyon kanalları, dinlenme V_m'ye önemli ölçüde katkıda bulunur. Vasküler pürüzsüz Kas hücreleri (VSMCs) dört farklı türde K⁺ kanal¹, iki tip gerilim-Gated CA^{2 +} kanal (Vgcc)², iki tip CL⁻ kanal^{3, 4 , 5}, mağaza tarafından işletilen CA^{2 +} kanallar⁶, Stretch-aktive Kif kanalları^7,8, ve elektrojenik Sodyum-Potasyum ATPaz pompaları⁹ plazma membranlarında, hepsi olabilir V_mdüzenlenmesi dahil.

VSMCs V_m lümen basıncına bağlıdır. Basınçlı olmayan damarlarda, V_m -50 ila-65 MV arasındadır, ancak basınçlı arter segmentlerinde v_m -37-47 MV¹⁰arasındadır. İntravasküler basınç yükselmesi VSMCs¹¹depolarize neden olur, vgcc açılış için eşik azalır ve miyokojenik ton gelişimine katkı kalsiyum akımı artar¹². Aksine, pasif veya basınçlı olmayan damarlarda, yüksek K⁺ kanal aktivitesi nedeniyle membran hiperpolarizasyonu, VGCC 'nin açılmasını önleyecek, sınırlı kalsiyum girişine ve hücre içi kalsiyum azalmasına neden olur, daha az katkı vasküler ton¹³. Böylece, lümen basıncında yapılan değişikliklerden dolayı V_m , vasküler ton gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır ve hem VGCC hem de K⁺ kanalları v_m'nin düzenlenmesi konusunda önemli bir rol oynamaktadır.

V_m gemi tipi ve türler arasında değişir. V_m -54 ± 1,3 MV içinde Gine domuzu üstün mezenterik arter şeritleri¹⁴,-45 ± 1 mV Rat orta serebral arterlerde içinde 60 mmHg lümen basıncı¹², ve-35 ± 1 mV sıçan parankimal arter içinde 40 mmHg lümen basıncı¹⁵. Uzanmış sıçan lenfatik kas içinde kaydedilen istirahat V_m -48 ± 2 mV¹⁶. V_m serebral VSMCs periferik arterlerde daha negatiftir. Karşılaştırıldığında, kedi orta serebral arterlerin yaklaşık bir V_m olduğu bildirilmiştir-70 MV, mezenterik ve koroner arterlerin olması bildirildi iken-49 ve-58 MV, sırasıyla^17,18. Vasküler yataklarda V_m 'deki farklar iyon kanallarının ve elektrojenik Sodyum-Potasyum pompaların ifade ve fonksiyonlarında farklılıklar gösterebilir.

V_m 'de artar ve azalır, sırasıyla membran depolarizasyon ve hiperpolarizasyon olarak adlandırılır. V_m 'deki bu değişiklikler, iyon kanallı gating, hücre sinyalizasyon, kas kasılma ve eylem potansiyel yayılma gibi birçok fizyolojik süreçte merkezi bir rol oynamaktadır. Sabit bir basınçta, K⁺ kanallarını aktive eden birçok endojen ve sentetik vazodilatör bileşiği membran hiperpolarizasyonuna neden olur ve vazodikasyon^1,13ile sonuçlanır. Tersine, sürekli membran depolarizasyon agonist kaynaklı veya reseptör aracılı vazokonstriksiyon¹⁹hayati önem taşımaktadır. V_m yalnızca vgcc¹³ aracılığıyla CA^{2 +} akımı düzenleyen değil, aynı zamanda CA 2^{+ '} nın dahili mağazalardan^20,21 ve CA^{2 +}-duyarlılığından etkileneceği kritik bir değişkendir kontril cihaz²².

Farklı hücre türlerinden V_m kaydetmek için çeşitli yöntemler olsa da, kanüle damarların mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi toplanan veriler izole vsmcs elde edilen verilerden daha fizyolojik gibi görünüyor. Mevcut kelepçe yöntemlerini kullanarak yalıtılmış VSMC 'den kaydedildiğinde, V_m VSMCs²⁴' te spontan geçici hiperpolarizasyon olarak görülür. Yalıtılmış VSMCs syncytium değildir ve seri direncinde yapılan değişiklikler V_m'nin osiloryumu davranışına katkıda bulunabilir. Öte yandan, v_m bozulmamış damarlardan kaydedildiğinde osilasyon davranışı görülmez, muhtemelen arter içinde restorasyonudur olan ve istikrarlı bir V_m ^{'ye giden gemi boyunca toplanan vsmcs arasında hücre hücresi teması nedeniyle 24}. böylece, standart mikroelektrot Kazığa oturtma tekniği kullanılarak basınçlı damarlardan V_m ölçümü, fizyolojik koşullara nispeten yakındır.

Kanule edilen damarlardan v_m kayıt hayati bilgi sağlayabilir, restorasyonudur v_m vsmcs vasküler ton ve kan akışının önemli belirleyici biridir, ve v_m modülasyon dilate ya da bir yol sağlayabilir kan damarlarını sıkı sıkıdır. Böylece, V_mkaydında yer alan metodolojisi anlamak önemlidir. Bu makalede, mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi kullanılarak kanüle orta serebral arterlerden (MCAS) V_m hücre içi kayıt açıklanmaktadır. Bu protokol MCAS hazırlamak için nasıl açıklayacaktır, mikroelektrotlar, elektrometre kurmak ve V_mkaydetmek için Kazığa oturtma yöntemi gerçekleştirmek. Ayrıca, temsili veri, bu yöntem ve olası sorunları kullanırken karşılaşılan ortak sorunlar ele alınmıştır.

Protokol

Erkek fareler, laboratuvar hayvan bakımı (AAALAC) değerlendirme ve akreditasyon için dernek tarafından onaylanmış UMMC, hayvan bakım tesisinde yer aldı. Hayvanların çalışma boyunca yiyecek ve suya ücretsiz erişimi vardı. Hayvanlar kontrollü bir ortamda 24 ± 2 °C sıcaklıkta, 60 – 80% ve 12 saat ışık/karanlık Döngülerde nem seviyeleri ile korundu. Tüm protokoller UMMC hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. ekipmanların hazırlanması

1. Bir çift kanallı diferansiyel elektrometre amplifikatör yerleştirin ( malzeme tablosunabakın) gemi odasına yakın ve istenilen yerde.
2. A veya B amplifikatör kanalının çıkışını BNC-BNC kablosuyla çizim tablası kanalı girişine bağlayın.
3. Prob Mikromanipülatör Mount ve mikroskop ve miyografi yakın yerleştirin. Kayıt kurulumunun titreşimsiz bir tabloya yüklenmesi gerekir.
4. Manuel olarak açıklandığı gibi, bu deneme için yapılandırdığınız pozisyonlara amplifikatör ön kolu ve anahtarları yerleştirin.
5. Uygun bir elektrot ile banyo zemini amplifikatörün devre zemine bağlayın. Benzer şekilde, kafesin amplifikatörün şasisine topraklandığından emin olun.

2. Mikroelektrotlar ve montajın hazırlanması

1. Borosilikat cam mikroelektrotları kullanın (malzeme tablosuna bakın) ve 3 M KCl ile doldurulduğunda, 8 – 10 mm Konik, < 1 μm çapı ve 80 – 120 MΩ direnç için cam ucunu çekin.
   1. Aşağıdaki ayarları kullanarak kısa aşamalı bir konik elde etmek için standart bir çektirme kullanın: ısı = 650; hız = 20; çekme = 25; zaman = 250 ve daha yüksek dirençleri ve daha küçük ipuçları için iki kez döngü. Ayarlar cihaza özgü olduğu için malzeme tablosuna bakın.
      Not: < 1 μm ipucu çapları, impaled sırasında hücreye minimal hasara neden olur.
2. Mikroelektrot mikrofiber şırınga kullanarak 3 M KCl ile doldurun (bkz. malzeme tablosu).
   1. Sıvı doldurmak ve mikroelektrot içinde hava kabarcıkları oluşumunu önlemek için boşluk sağlamak için mikroelektrot içine 3 M KCl enjekte ederken yavaşça mikrofiber şırınga pistonu çekin.
   2. Mikroelektrot tam kadar doldurun ve mikroelektrot tutucusuna yerleştirmeden önce hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Eğer kabarcıklar varsa, yavaşça kabarcık kaldırmak için bir parmak ile mikroelektrot dokunun.
3. Bakım egzersiz, sıkıca Fore delik aracılığıyla tutucu içine elektrot SAP itin. Aşırı sıvı varsa, bir doku ile çıkarın.
4. Elektrot tutucu aksamını amplifikatör sondasına bağlayın. Bir elektrot testi gerçekleştirin, giriş uzaklığını ayarlayın, sıfır ayarını doğrulayın ve amplifikatör kılavuzuna göre prob giriş sızıntısını kontrol edin.
5. Tablo 1' de gösterildiği gibi bir elektrot testi kullanarak elektrot direncini ölçün.
6. Çalışan bir elektrot, kanal çıktısında 1 mV/MΩ pozitif bir DC voltaj kayması gösterir. Öte yandan, kanal çıkışına ve ölçer üzerinde büyük bir voltaj görünüyorsa, bu bir bloke veya kırık elektrot gösterir.
7. Kayıt yazılımını açın, dosyaya bir ad atayın ve bir depolama yazılımında gelecekteki analiz için kaydedin.

3. Orta serebral arter izolasyon ve kanülasyon

1. Reaktifleri hazırlama.
   1. Tablo 2' de açıklandığı gibi normal ve düşük kalsiyum fizyolojik tuz çözeltisi (PSS) hazırlayın.
2. Miyografı hazırlayın.
   1. Myograph odası durulayın ( malzeme tablosunabakın) enkaz ücretsiz tutmak için birden çok kez damıtılmış su ile. Oda 5 mL normal PSS ile yükleyin.
   2. 5 – 10 mL şırınga kullanılarak filtrelenmiş normal PSS ile hem cam kanüller doldurun. Dikkatle tüm kanül ve bağlı boru herhangi bir hava kabarcıkları tanıtmadan doldurun.
   3. Hazırlamak iki monofilament naylon sütürler (10-0, 0,02 mm) bir yarım düğüm her künt forseps kullanarak.
   4. Bir diseksiyon mikroskop altında diseksiyon forseps kullanarak her iki kanüller üzerinde biraz uzak ucu kısmen kapalı dikiş knot yerleştirin. Daha sonra bu düğümler kapalı kaydırılacak ve dikkatli bir şekilde kanüle arter üzerine damar güvenli bağlı biter.
3. Orta serebral arter izole ve cannulate.
   1. 2-4% inhale Isoflurane kullanarak bir Sprague Dawley sıçan derin anestezi teşvik.
   2. Derin anestezinin altında Giyotin kullanarak sıçan başını atar.
   3. Kafatasını bir kemik kesici ve bir makas kullanarak dikkatlice çıkarın.
   4. Kafatasından beyin çıkarın ve buzda düşük kalsiyum PSS 5 mL yerleştirin.
   5. Yay makas ve forseps kullanarak beynin 100 – 200 μm iç çapı ile sıçan orta serebral arter (MCA) bir undalched segment tanımlamak ve ortadan kaldırır.
   6. MCA 'Yı cam kanüller üzerine ince forseps kullanarak takın ve normal PSS içeren miyografda sütürler sıkarak sabitleyin.
   7. Böylece MCAs içinde hiçbir akış olmayacaktır distal kanül kapatın.
   8. Inlow pipet, bir satır içi basınç dönüştürücünün izlenmesi için intraluminal basınç kontrolü için izin vermek için PSS tutan bir rezervuar bağlayın.
   9. Tersine çevrilmiş bir mikroskop ve görüntüleme yazılımı üzerine monte edilen, şarj bağlantılı bir cihaz kamerası ( malzeme tablosunabakın) kullanarak kanule edilmiş MCAS 'ı görselleştirin.
   10. MCA 'nın eksenel uzunluğunu, sert ya da flaccid görünmesi gereken yaklaşık bir uzunlukta ayarlayın.
   11. O₂ ile banyo çözeltisi equilibrate (% 95) ve CO₂ (% 5) 37 °C ' de yeterli oksijenasyon, sıcaklık ve pH sağlamak için 7,4.
4. Impale (hücre plazma membranı nüfuz) vasküler pürüzsüz Kas hücreleri.
   1. Zemin elektrot bağlayın ve myograph PSS içine batırılmış tutun.
   2. Banyo çözeltisinde mikroelektrot ucunu görselleştirmek için gemi odasını aydınlatın ve mikroskop üzerinden bakabilirsiniz.
      Not: Alternatif olarak, bir görüntü yazılımı olan bir bilgisayarda MCA ve mikroelektrot görselleştirebilirsiniz.
   3. Mikroelektrot ucunu kan damarının dış duvara yakın taşımak için mikromanipülatörün denetimlerini kullanın. Mikromanipülatör ve mikroelektrot ucu doku ile ilgili olarak istikrarlı bir konumda olmalıdır.
      Not: Denemelere başlamadan önce, membran voltajının stabilize edildiğini onaylayın. Ölçülen voltaj kararsız ise, elektrot ve hücre arasındaki bağlantı mühürlenmez, bir sızıntı olduğunu gösterir.
   4. Kayıt başlasın.
   5. Mikro elektrot ucunu yavaşça gemiye doğru hareket ettirin ve mikromanipülatörün kurs veya ince kontrolünü kullanarak geminin merkezini hedefliyoruz.
      Not: Bazen, mikroelektrot ucu bir kas fiber membran temas ettiğinde kayıtta küçük bir saptırma görülebilir.
   6. Ucu gemi yakın geldiğinde, kas membranı kazığa oturtmak Mikromanipülatör kullanarak bir hızlı hareket içinde elektrot ileriye ilerlemek.
   7. Bu noktada, kaydedilmiş olan V_m değişiklikleri gözlemlemeye başlayabilirsiniz. Mikroelektrot hücrenin membranı impales zaman Mikromanipülatör dokunmayın.
      Not: Kayıt ve referans elektrot arasındaki voltaj farkı, intravasküler basınç veya diğer uyarıcı veya inhibitör uyaranların düzeyine bağlı olarak 0 mV-40 mV ve-75 mV arasında azalır. Bu ölçümler, geçerli hücrenin transmembran potansiyel farkını karakterize eder.
   8. Doğru ölçümler elde etmek için VSMCs zarar vermeden geminin farklı bölgelerinde tek bir gemi üzerinde birden fazla impalements gerçekleştirin.
   9. Kayıt olduktan sonra, tek bir hızlı harekette mikroelektrot kaldırmak için manipülatör kullanın.
   10. Kaydı durdurun ve daha fazla analiz için veri dosyalarını kaydedin.

Sonuçlar

Sunulan yöntem, kanüle edilen damarlarda V_m kaydetmek için güvenilir bir şekilde kullanılabilir. MCA 'yı beyinden nasıl yalıtmayı anlatan kısa bir prosedür Şekil 1a'da sunulmuştur. Beyni kafatasından ayırdıktan sonra, MCA dışarı disseke ve düşük kalsiyum PSS içeren bir petri çanak yerleştirilir. Bağlı olan bağ dokusunun bir kısmı da MCA ile birlikte, izolasyon sırasında MCA 'ya zarar vermemek için yay makas ve fors...

Tartışmalar

Bu makalede, bir kanüle damar hazırlama V_m kaydetmek için keskin bir mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi kullanmak için gerekli adımları sağlar. Bu yöntem yaygın olarak kullanılır ve yüksek kaliteli, tutarlı bir dizi deneysel soruya cevap V_m kayıtları sunuyor.

Bazı kritik hususlar ve sorun giderme adımları, yöntemin başarısını sağlamak için burada açıklanmıştır. Mikroelektrot (netlik ve direnç) ve hücresel Proses kalitesi V_m'...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser	Parkland scientific	V3000PK
Dissection microscope	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer Bone Cutter	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps	Fine science tools	11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt	Fine science tools	14008-14
Suture	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas Spring Scissors	Fine science tools	15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera	Qimaging, , BC	Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier	WPI	FD223A
In-line pressure transducer	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelectrodes	Warner Instruments LLC, CT	G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe)	WPI	MF28G67-5
Microelectrode holder	WPI	MEH1SF
Myograph	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
Puller	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
Vibration-free table	TMC	3435-14
Softwares
Clampex 10	Molecular devices
p Clamp 10	Molecular devices
Imaging software	Nikon, NY	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
Glucose	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761