Metodo di impalamento dei microelettrodi per registrare il potenziale della membrana da un'arteria cerebrale media cannulata

Riepilogo

L'obiettivo principale di questo articolo è quello difornire dettagli su come registrare il potenziale della membrana (V m) dall'arteria cerebrale media utilizzando il metodo di impalamento dei microelettrodi. L'arteria cerebrale media cannulata è equilibrata per ottenere un tono miogenico, e la parete del vaso è impalato utilizzando microelettrodi ad alta resistenza.

Abstract

Il potenzialedi membrana (V m) delle cellule muscolari limpiche vascolari determina il tono del vaso e quindi il flusso sanguigno a un organo. Cambiamenti nell'espressione e nella funzione dei canali ionici e delle pompe elettrogeniche che regolano V_m in condizioni di malattia potrebbero potenzialmente alterare V_m, tono vascolare e flusso sanguigno. Pertanto, una comprensione di base dell'elettrofisiologia e dei metodi necessari per registrare con precisione V_m in stati sani e malati sono essenziali. Questo metodo permetterà la modulazione V_m utilizzando diversi agenti farmacologici per ripristinare V_m. Anche se ci sono diversi metodi, ognuno con i suoi vantaggi e svantaggi, questo articolo fornisce protocolli per registrare V_m da vasi di resistenza cannulati come l'arteria cerebrale media utilizzando il metodo di impalamento dei microelettrodi. Le arterie cerebrali medie sono autorizzate a ottenere un tono miogenico in una camera miografica, e la parete del vaso è impalato utilizzando microelettrodi ad alta resistenza. Il segnale V_m viene raccolto attraverso un elettrometro, digitalizzato e analizzato. Questo metodo fornisce una lettura accurata del V_m di una parete del vaso senza danneggiare le cellule e senza modificare la resistenza della membrana.

Introduzione

Il potenziale della membrana (V_m) di una cellula si riferisce alla differenza relativa della carica ionica attraverso la membrana plasmatica e alla relativa permeabilità della membrana a questi ioni. Il V_m è generato dalla distribuzione differenziale degli ioni ed è mantenuto da canali ionici e pompe. I canali ionicicome K^,Na , e Cl^, contribuiscono in modo sostanziale al V_ma riposo. Le cellule muscolari limpiche (VSMC) esprimono più di quattro diversi tipi di canali K¹, due tipi di canali Ca^{2 ,} gated tensione (VGCC)², più di due tipi di CL^- canali^{3, 4 DEL psu' , 5}, canali Ca^{2 ,} gestiti in negozio⁶, canali di cation attivati in stretch^7,8e pompe APase di sodio elettrogeni che sonito novantano⁹ nelle loro membrane plasmatiche, tutte coinvolti nella regolamentazione del V_m.

Il V_m di VSMC dipende dalla pressione del lume. Nei recipienti non pressurizzati, V_m varia da -50 a -65 mV, tuttavia, nei segmenti arteriosi pressurizzati, V_m varia da -37 a -47 mV¹⁰. L'elevazione della pressione intravascolare fa depolarizzare le VSMC¹¹, diminuisce la soglia per l'apertura del VGCC e aumenta l'afflusso di calcio contribuendo allo sviluppo del tono miogenico¹². Al contrario, nei vasi passivi o non pressurizzati, l'iperpolarizzazione della membrana, dovuta all'elevata attività del canale K, impedirà l'apertura del VGCC, con conseguente ingresso limitato di calcio e una diminuzione del calcio intracellulare, contribuendo a meno tono vascolare¹³. Così, V_m a causa di cambiamenti nella pressione del lume sembra svolgere un ruolo essenziale nello sviluppo del tono vascolare, e sia VGCC e K^, canali svolgono un ruolo cruciale nella regolazione del V_m.

V_m varia tra il tipo di vaso e le specie. V_m è -54 x 1,3 mV in porcellino d'India superiore strisce arteriose mesentiche¹⁴, -451 mV nelle arterie cerebrali medie del ratto a 60 mmHg lumen pressione¹², e -35 - 1 mV in ratto arterie parenchyli a 40 mmHg lumen pressione¹⁵. Il v_m a riposo registrato nel muscolo linfatico del ratto non teso è -48 - 2 mV¹⁶. V_m di VSMC cerebrali è più negativo che nelle arterie periferiche. In confronto, le arterie cerebrali medie feline sono state segnalate per avere un V_m di circa -70 mV, mentre le arterie mesentiche e coronariche sono state segnalate per avere -49 e -58 mV, rispettivamente^17,18. Le differenze nel V_m attraverso letti vascolari possono riflettere le differenze nell'espressione e nella funzione dei canali ionici e delle pompe elettrogeniche di sodio-potassio.

Gli aumenti e le diminuzioni in V_m sono indicati come depolarizzazione della membrana e iperpolarizzazione, rispettivamente. Queste alterazioni in V_m svolgono un ruolo centrale in molti processi fisiologici, tra cui gating ionista-canale, segnalazione cellulare, contrazione muscolare, e potenziale di propagazione dell'azione. Ad una pressione fissa, molti composti vasodilatatori endogeni e sintetici che attivano i canali K - causano l'iperpolarizzazione della membrana, con conseguente vasodilazione^1,13. Al contrario, la depolarizzazione sostenuta della membrana è vitale nell'indottodagli agonisti o nell'vasoconia 19 mediata dal recettore. V_m è una variabile critica che non solo regola l'afflusso di Ca² o attraverso VGCC^13, ma influenza anche il rilascio di Ca^2, dai negozi interni^20,21 e Ca 2^-sensibilità di l'apparato contrattile²².

Mentre ci sono diversi metodi per registrare V_m da diversi tipi di cellule, i dati raccolti dal metodo di impalamento dei microelettrodi dei vasi cannulati sembrano essere più fisiologici dei dati ottenuti da VSMC isolati. Quando viene registrato da VSMC isolato utilizzando i metodi di morsetto correnti, V_m è visto come iperpolarizzazioni transitorie spontanee in VSMC²⁴. VsMC isolati non sono nel sinistium e le modifiche nella resistenza di serie possono contribuire al comportamento oscillatorio di V_m. D'altra parte, il comportamento oscillatorio non si osserva quando V_m è registrato da vasi intatti, probabilmente a causa del contatto cellulare-cellula tra VSMC che sono in sincronia nell'arteria e sono riassunti in tutta la nave che porta ad una stabile V_m ^24.Pertanto, la misurazione di V_m da vasi pressurizzati utilizzando la tecnica standard di impalamento dei microelettrodi è relativamente vicina alle condizioni fisiologiche.

La registrazione di V_m da vasi cannulati potrebbe fornire informazioni vitali, dal momento che V_m di VSMC che sono in sinistium è uno dei principali determinanti del tono vascolare e del flusso sanguigno, e la modulazione del V_m potrebbe fornire un modo per dilatare o i vasi sanguigni. Pertanto, è essenziale comprendere la metodologia coinvolta nella registrazione di V_m. Questo articolo descrive la registrazione intracellulare di V_m da arterie cerebrali medie cannulate (MCA) utilizzando un metodo di impalamento dei microelettrodi. Questo protocollo descrive come preparare Gli ICM, i microelettrodi, impostare l'elettrometro ed eseguire il metodo di impalamento per registrare V_m. Inoltre, vengono discussi i dati rappresentativi, i problemi comuni che si sono verificati durante l'utilizzo di questo metodo e i potenziali problemi.

Protocollo

I ratti maschi sono stati alloggiati presso l'Animal Care Facility dell'UMMC, approvato dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali di laboratorio (AAALAC). Gli animali hanno avuto libero accesso al cibo e all'acqua durante tutto lo studio. Gli animali sono stati mantenuti in un ambiente controllato con temperatura a 24 , 2 gradi centigradi, livelli di umidità del 60-80% e cicli di luce/buio di 12 h. Tutti i protocolli sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee dell'UMMC.

1. Preparazione dell'attrezzatura

1. Posizionare un amplificatore elettrometro differenziale a doppio canale (vedere il Tavolo deimateriali) vicino alla camera del vaso e nella posizione desiderata.
2. Collegare l'uscita del canale a o B dell'amplificatore all'ingresso del canale del digitalizzatore con un cavo BNC-BNC.
3. Montare la sonda nel micromanipolatore e posizionarla vicino al microscopio e al miografo. L'impostazione della registrazione deve essere installata su un tavolo privo di vibrazioni.
4. Posizionare le manopole e gli interruttori sulla parte anteriore dell'amplificatore in posizioni che lo configurano per questo esperimento come descritto nel manuale.
5. Collegare il terreno del bagno al terreno del circuito dell'amplificatore tramite un elettrodo appropriato. Allo stesso modo, assicurarsi che la gabbia sia messa a terra sul telaio dell'amplificatore.

2. Preparazione di microelettrodi e assemblaggio

1. Utilizzare microelettrodi in vetro borosilicato (vedi Il Tavolo dei Materiali) e tirare la punta di vetro per avere un cono di 8-10 mm, un diametro di <1 m e una resistenza di 80-120 Mz quando riempito con 3 M KCl.
   1. Utilizzare un tiratore standard per ottenere un breve cono graduale utilizzando le seguenti impostazioni: calore - 650; velocità : 20; tirare 25; 250 e loop due volte per resistenze più elevate e punte più piccole. Vedere la Tabella dei materiali poiché le impostazioni sono specifiche dello strumento.
      
2. Riempire il microelettrodo con 3 M KCl utilizzando una siringa in microfibra (vedi la Tabella dei Materiali).
   1. Tirare lentamente lo stantuffo della siringa in microfibra mentre si inietta il kCl 3 M nel microelettrodo per consentire il riempimento del fluido e per evitare la formazione di bolle d'aria all'interno del microelettrodo.
   2. Riempire il microelettrodo fino al massimo e assicurarsi che non vi siano bolle d'aria prima di inserirlo nel supporto del microelettrodo. Se sono presenti bolle, toccare delicatamente il microelettrodo con un dito per rimuovere le bolle.
3. Esercitare la cura, spingere saldamente il gambo dell'elettrodo nel supporto attraverso il foro annoiato. Se è presente liquido in eccesso, rimuoverlo con un tessuto.
4. Collegare il supporto dell'elettrodo alla sonda dell'amplificatore. Eseguire un test dell'elettrodo, regolare l'offset di ingresso, verificare l'impostazione zero e controllare la perdita di ingresso della sonda in base al manuale dell'amplificatore.
5. Misurare la resistenza agli elettrodi utilizzando un test dell'elettrodo come mostrato nella Tabella 1.
6. Si noti che un elettrodo funzionante visualizza uno spostamento di tensione DC positivo di 1 mV / M, all'uscita del canale. D'altra parte, se una grande tensione appare all'uscita del canale e sul misuratore, ciò indica un elettrodo bloccato o rotto.
7. Aprire il software di registrazione, assegnare un nome al file e salvarlo per analisi future in un software di memorizzazione.

3. Isolamento e cannulazione dell'arteria cerebrale di mezzo

1. Preparazione dei reagenti.
   1. Preparare la soluzione salina fisiologica normale e a basso calcio (PSS) come descritto nella tabella 2.
2. Prepara il miografo.
   1. Sciacquare la camera del miografo (vedi la tabella deimateriali) con acqua distillata più volte per mantenerla libera dai detriti. Caricare la camera con 5 mL di PSS normale.
   2. Riempire entrambe le cannule di vetro con PSS normale filtrato utilizzando una siringa da 5-10 mL. Riempire con cura l'intera cannula e il tubo allegato senza introdurre bolle d'aria.
   3. Preparare due suture di nylon monofilamento (10-0, 0,02 mm) con un mezzo nodo ciascuno con pinze smussate.
   4. Posizionare i nodi di sutura parzialmente chiusi su entrambe le cannule leggermente lontano dalla punta utilizzando pinze di dissezione al microscopio di dissezione. Più tardi questi nodi saranno scivolati via e legati con cura sulle estremità arteriose cannulate per fissare il vaso.
3. Isolare e cannulare l'arteria cerebrale media.
   1. Indurre l'anestesia profonda in un ratto Sprague Dawley utilizzando 2-4% isoflurane inalato.
   2. Decapitare il ratto usando ghigliottina in anestesia profonda.
   3. Rimuovere con attenzione il cranio con una fresa ossea e una forbice.
   4. Togliere il cervello dal cranio e metterlo in 5 mL di PSS a basso calcio sul ghiaccio.
   5. Identificare e sezionare un segmento non ramificato dell'arteria cerebrale media del ratto (MCA) con un diametro interno di 100-200 m dal cervello usando forbici e pinze a molla.
   6. Montare l'MCA sulle cannule di vetro con pinze sottili e fissarlo stringendo le suture nel miografo contenente PSS normale.
   7. Chiudere la cannula distale in modo che non ci sarà alcun flusso all'interno degli ICM.
   8. Collegare la pipetta di afflusso a un serbatoio che contiene PSS per consentire il controllo della pressione intraluminale che verrà monitorata con un trasduttore di pressione in linea.
   9. Visualizza gli MCA cannulati utilizzando una fotocamera del dispositivo accoppiata a carica (vedi la Tabella deimateriali) montata su un microscopio invertito e un software di imaging.
   10. Impostare la lunghezza assiale dell'MCA su una lunghezza approssimativa in cui non dovrebbe apparire né rigida né flaccida.
   11. La soluzione bagno con O₂ (95%) e CO₂ (5%) a 37 gradi centigradi per fornire un'adeguata ossigenazione, temperatura e per mantenere il pH a 7,4.
4. Impala (penetrare la membrana plasmatica cellulare) le cellule muscolari lisce vascolari.
   1. Collegare l'elettrodo di terra e tenerlo immerso nel PSS del miografo.
   2. Illuminare la camera del vaso e guardare attraverso il microscopio per visualizzare la punta del microelettrodo nella soluzione bagno.
      NOT: In alternativa, si può visualizzare l'MCA e microelettrodo su un computer con un software di imaging.
   3. Utilizzare i comandi del micromanipolatore per spostare la punta del microelettrodo vicino alla parete esterna del vaso sanguigno. Il micromanipolatore e la punta del microelettrodo devono trovarsi in una posizione stabile rispetto al tessuto.
      NOT: Prima di iniziare gli esperimenti, verificare che la tensione della membrana si sia stabilizzata. Se la tensione misurata è instabile, la connessione tra l'elettrodo e la cella non è sigillata, indicando una perdita.
   4. Iniziare la registrazione.
   5. Spostare lentamente la punta del microelettrodo verso la nave, puntando verso il centro della nave utilizzando il percorso o il controllo fine del micromanipolatore.
      NOT: Occasionalmente, una piccola deviazione nella registrazione può essere osservata quando la punta del microelettrodo contatta una membrana della fibra muscolare.
   6. Quando la punta arriva in prossimità della nave, far avanzare l'elettrodo in avanti in un movimento rapido utilizzando il micromanipolatore per impalare la membrana del muscolo.
   7. A questo punto, si può iniziare a osservare i cambiamenti in V_m in fase di registrazione. Non toccare il micromanipolatore quando il microelettrodo impalde la membrana della cellula.
      NOT: La differenza di tensione tra l'elettrodo di registrazione e l'elettrodo di riferimento diminuisce da 0 mV a -40 mV e -75 mV a seconda del livello di pressione intravascolare o di altri stimoli eccitatori o inibitori. Queste letture caratterizzano la differenza potenziale transmembrana della cellula corrente.
   8. Eseguire più impalementi su una singola nave in diverse aree della nave senza danneggiare le VSMC al fine di ottenere misurazioni accurate.
   9. Dopo la registrazione, utilizzare il manipolatore per rimuovere il microelettrodo in un movimento rapido.
   10. Interrompere la registrazione e salvare i file di dati per un'ulteriore analisi.

Risultati

Il metodo presentato può essere utilizzato in modo affidabile per registrare V_m in vasi cannulati. Una breve procedura che descrive come isolare MCA dal cervello è presentato in Figura 1A. Dopo aver diviso il cervello dal cranio, l'MCA è stato sezionato e posto in un piatto Petri contenente PSS a basso calcio. Parte del tessuto connettivo che è stato attaccato è stato anche sezionato insieme a MCA utilizzando forbici a molla e pinze per evitar...

Discussione

Questo articolo fornisce i passaggi necessari su come utilizzare un metodo di impalamento a microelettrodo affilato per registrare V_m dalla preparazione di un vaso cannulato. Questo metodo è ampiamente utilizzato e offre registrazioni coerenti e di alta qualità di V_m che rispondono a una vasta gamma di domande sperimentali.

Alcune considerazioni critiche e procedure per la risoluzione dei problemi sono descritte di seguito per garantire l'esito positivo del metodo. La q...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser	Parkland scientific	V3000PK
Dissection microscope	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer Bone Cutter	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps	Fine science tools	11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt	Fine science tools	14008-14
Suture	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas Spring Scissors	Fine science tools	15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera	Qimaging, , BC	Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier	WPI	FD223A
In-line pressure transducer	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelectrodes	Warner Instruments LLC, CT	G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe)	WPI	MF28G67-5
Microelectrode holder	WPI	MEH1SF
Myograph	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
Puller	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
Vibration-free table	TMC	3435-14
Softwares
Clampex 10	Molecular devices
p Clamp 10	Molecular devices
Imaging software	Nikon, NY	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
Glucose	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761