축수 된 중간 대뇌 동맥에서 멤브레인 전위를 기록하는 마이크로 전극 Impalement 방법

요약

이 문서의 주요 목표는 미세 전극 impalement방법을 사용하여 중간 대뇌 동맥에서 막 전위 (Vm)를 기록하는 방법에 대한 세부 정보를 제공하는 것입니다. 굴절된 중간 대뇌 동맥은 근진한 톤을 얻기 위해 평형화되고, 혈관 벽은 높은 저항 성 미세 전극을 사용하여 찔려있습니다.

초록

혈관 평활근 세포의 막 전위 (V m)는 혈관 톤을 결정하고 따라서 장기에 혈류를 결정합니다. 질병 조건에서 V m을 조절하는 이온 채널 및 전기 생성 펌프의 발현 및 기능의 변화는 잠재적으로 V_m,혈관 톤 및 혈류를 변화시킬 수 있습니다. 따라서, 전기생리학에 대한 기본적인 이해와 건강하고 병들린 상태에서 Vm을 정확하게 기록하는 데 필요한 방법이 필수적이다. 이 방법을 사용하면 다른 약리학 적 에이전트를 사용하여 V m을 변조하여 V m을 복원 할 수_{있습니다.} 여러 가지 방법이 있지만, 각각의 장점과 단점을 가지고 있지만, 이 문서는 미세 전극 임팔레이 방법을 사용하여 중간 대뇌 동맥과 같은 혼수 저항 혈관으로부터 Vm을 기록하는 프로토콜을 제공한다. 중간 대뇌 동맥은 myograph 챔버에서 myogenic 톤을 얻기 위하여 허용되고, 혈관 벽은 높은 저항 마이크로 전극을 사용하여 찔려 있습니다. V_m 신호는 전계를 통해 수집되고 디지털화되고 분석됩니다. 이 방법은 세포를 손상시키지 않고 멤브레인 저항을 변경하지 않고 용기 벽의 Vm을 정확하게 판독할 수 있습니다.

서문

세포의 멤브레인전위(Vm)는 혈장 막을 가로지르는 이온 전하의 상대적 차이와 이러한 이온에 대한 멤브레인의 상대적 투과성을 지칭한다. Vm은 이온의 차동 분포에 의해 생성되며 이온 채널 과 펌프에 의해 유지됩니다. K⁺, Na⁺및 Cl과 같은 이온 채널은 휴식 V_M에실질적으로 기여합니다. 혈관 평활근 세포 (VSMC)는 K⁺ 채널^1,전압 게이트 Ca2⁺ 채널 (VGCC)^2의두 가지 유형의 4 가지 유형 이상을 표현하고, 2 가지 유형의 Cl^- 채널^{3, 4개 , 5,}상점 운영 Ca²⁺ 채널^6,스트레치 활성화 양이온 채널⁷,^8,그리고 전기 발생 나트륨 - 칼륨 ATPase 펌프⁹ 플라즈마 멤브레인, 모두 될 수있다 V_m의규제에 관여 .

VSMC의 Vm은 루멘 압력에 따라 달라집니다. 비가압 용기에서 V_m은 -50에서 -65 mV까지 다양하지만 가압 동맥 세그먼트에서는 Vm 범위가 -37에서 -47 mV^10입니다. 혈관 내 압력의 상승은 VSMC가^11을탈분극하게 하고, VGCC 개방에 대한 임계값을 감소시키고, 근조톤(12)의 발달에 기여하는 칼슘 유입을 증가시킨다. 반대로, 수동 또는 비가압 혈관에서, 높은 K⁺ 채널 활동으로 인해 막 과분극은 VGCC가 열리지 못하게하여 제한된 칼슘 진입과 세포 내 칼슘의 감소를 초래하여 세포 내 칼슘의 감소를 감소시킵니다. 혈관 톤¹³. 따라서, 루멘 압력의 변화로 인하여 Vm은 혈관 톤 발달에 필수적인 역할을 하는 것으로 보이며, VGCC 및 K+ 채널 모두 Vm의 조절에 중요한 역할을 한다.

V m은 혈관 유형과 종에 따라 다릅니다. Vm은 기니피그 우수한 장간막 동맥 스트립에서 -54±1.3 mV로, 60 mmHg 루멘 압력에서 랫트 중대동맥에서-45±1 mV, 및 -35±1 mV에서 40 mmHg 루멘 압력에서 랫트 자작동맥에서^15. 뻗지 않은 쥐 림프근육에서 기록된 쉬잉 Vm은 -48±2 mV^16이다. 대뇌 VSMC의 V_m은 말초 동맥에서 보다 더 부정적인. 이에 비해, 고양이 중대동맥은 약 -70 mV의Vm을 가지는 것으로 보고되었으며, 장간막 및 관상동맥은 각각 -49 및-58 mV를 가지는 것으로 보고되었다. 혈관 층에서 V m의 차이는 이온 채널 및 전기 발생 나트륨 칼륨 펌프의 발현 및 기능의 차이를 반영할 수 있다.

Vm의 증가 및 감소는 각각 막 탈분극 및 과분극으로 지칭된다. V m에서 이러한 변경 많은 생리 적 프로세스에 중앙 역할을, 이온 채널 게이팅을 포함 하 여, 세포 신호, 근육 수축, 그리고 행동 잠재적인 전파. 고정 된 압력에서, K⁺ 채널을 활성화하는 많은 내인성 및 합성 혈관 확장제 화합물은 막 과분극을 일으켜 혈관 확장 1,^13을초래합니다. 반대로, 지속된 막 탈분극은 작용제 유도 또는 수용체 매개 혈관^{수축(19)에서}필수적이다. V m은 VGCC^13을 통해 Ca²⁺ 유입을 조절할 뿐만 아니라 내부 매장^20,21 및 Ca²⁺-감도에서 Ca^2+의 출시에도 영향을 미치는 중요한 변수입니다. 수축 장치^22.

상이한 세포 유형에서 Vm을 기록하는 몇 가지 방법이 있지만, 종면 용기의 미세 전극 몰백 방법으로부터 수집된 데이터는 분리된 VSMC로부터 얻은 데이터보다 더 생리적인 것으로 보인다. 현재 클램프 방법을 사용하여 격리 된 VSMC에서 기록 할 때 Vm은 VSMC^24에서자발적인 과도 과분극으로 간주됩니다. 격리된 VSMC는 동기화되지 않으며, 시리즈 저항의 변화는 V m의 진동 거동에기여할 수 있다. 다른 한편으로는, 진동 거동은 Vm이 손상되지 않은 혈관에서 기록될 때 관찰되지 않으며, 아마도 동맥내 동기화에 있는 VSMC 사이의 세포 세포 접촉으로 인해 혈관 전체에 걸쳐 합산되어 안정적인 V_m으로 ^{이어집니다. 24.}따라서, 표준 미세 전극 임팔레이 기술을 사용하여 가압 용기로부터 V m의 측정은 생리적 조건에 상대적으로 가깝다.

동기화된 VSMC의 Vm은 혈관 톤과 혈류의 주요 결정요인 중 하나이며 Vm의 변조는 팽창 또는 혈관을 수축. 따라서, V_m을 기록하는 데 관련된 방법론을 이해하는 것이 필수적이다. 이 기사에서는 미세 전극 impalement 방법을 사용하여 조개형 중간 대뇌 동맥 (MCA)에서 V m의 세포 내 기록을 설명합니다. 이 프로토콜은 MCA, 마이크로 전극을 준비하고, 전기계를 설정하고 V m을기록하는 impalement 방법을 수행하는 방법을 설명합니다. 또한 이 방법을 사용할 때 발생한 대표적인 데이터, 일반적인 문제 및 잠재적인 문제에 대해서도 논의합니다.

프로토콜

수컷 쥐는 UMMC의 동물 관리 시설에 보관되었으며, 이는 실험실 동물 관리 협회 (AAALAC)의 평가 및 인증협회의 승인을 받았습니다. 동물들은 연구 기간 내내 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다. 동물은 온도가 24±2°C, 습도 수준이 60-80% 및 12h 의 빛/어두운 사이클로 통제된 환경에서 유지되었다. 모든 프로토콜은 UMMC의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 장비 준비

1. 이중 채널 차동 전계 증폭기(재료 표참조)를 용기 챔버 가까이에 배치하고 원하는 위치에 배치합니다.
2. 증폭기 채널 A 또는 B의 출력을 BNC-BNC 케이블로 디지타이저의 채널 입력에 연결합니다.
3. 현미경 조작기에 프로브를 장착하고 현미경과 근사근처에 놓습니다. 녹음 설정은 진동이 없는 테이블에 설치해야 합니다.
4. 설명서에 설명된 대로 이 실험을 위해 노브와 스위치를 앰프 전면에 배치합니다.
5. 적절한 전극을 통해 배전그라운드를 앰프의 회로 접지에 연결합니다. 마찬가지로 케이지가 앰프의 섀시에 접지되었는지 확인합니다.

2. 마이크로 전극 및 조립의 준비

1. borosilicate 유리 마이크로 전극 (재료의 표 참조)를 사용하고 3 M KCl로 채워질 때 8-10mm 테이퍼, 직경 <1 μm 및 80-120 MΩ의 저항을 가지고 유리 팁을 당깁니다.
   1. 열 = 650 : 다음 설정을 사용하여 짧은 점진적 테이퍼를 달성하기 위해 표준 풀러를 사용; 속도 = 20; 끌어오기 = 25; 시간 = 250 높은 저항과 작은 팁에 대한 두 번 루프. 설정은 계측기별으로 되어 있는지 를 참조하십시오.
      참고: 팁 직경 <1 μm은 찔려 세포가 손상될 때 최소한의 손상을 유발합니다.
2. 마이크로화이버 주사기를 사용하여 3M KCl로 마이크로 전극을 채웁니다(재료 표 참조).
   1. 마이크로화이버 주사기의 플런저를 천천히 당기면서 3M KCl을 마이크로 전극에 주입하여 유체가 채워질 공간을 허용하고 마이크로 전극 내부의 기포 형성을 방지합니다.
   2. 마이크로 전극이 가득 차있을 때까지 채우고 마이크로 전극 홀더에 넣기 전에 기포가 없는지 확인하십시오. 거품이 있는 경우 손가락으로 마이크로 전극을 가볍게 눌러 거품을 제거합니다.
3. 주의를 기울여 전극 생크를 지루한 구멍을 통해 홀더에 단단히 밀어 넣습니다. 과잉 유체가 존재하는 경우 조직으로 제거하십시오.
4. 전극 홀더 어셈블리를 증폭기 프로브에 연결합니다. 증폭기 매뉴얼에 따라 전극 테스트를 수행하고, 입력 오프셋을 조정하고, 제로 설정을 확인하고, 프로브 입력 누설을 확인합니다.
5. 표1과 같이 전극 시험을 사용하여 전극 저항을 측정합니다.
6. 작동 전극은 채널 출력에서 1mV/MΩ의 양극 DC 전압 시프트를 표시합니다. 반면에 채널 출력과 미터에 큰 전압이 나타나면 차단또는 파손된 전극을 나타냅니다.
7. 레코딩 소프트웨어를 열고 파일에 이름을 할당하고 저장 소프트웨어에서 향후 분석을 위해 저장합니다.

3. 중간 대뇌 동맥의 격리 및 통조림

1. 시약을 준비합니다.
   1. 표2에 기재된 바와 같이 정상 및 저칼슘 생리염액(PSS)을 준비한다.
2. 근사학을 준비합니다.
   1. 근사체 챔버(재료 표참조)를 증류수로 여러 번 헹구어 이물질이 없도록 합니다. 일반 PSS의 5 mL로 챔버를로드합니다.
   2. 5-10 mL 주사기를 사용하여 여과된 일반 PSS로 두 유리 캐뉼라를 채웁니다. 기포를 전혀 도입하지 않고 캐뉼라 전체와 부속 튜브를 조심스럽게 채웁니다.
   3. 무딘 집게를 사용하여 각각 반 매듭으로 두 개의 모노필라멘트 나일론 봉합사 (10-0, 0.02 mm)를 준비하십시오.
   4. 부분적으로 닫힌 봉합사 매듭을 해부 현미경으로 해부 집게를 사용하여 팁에서 약간 떨어진 두 캐뉼러에 놓습니다. 나중에 이 매듭은 미끄러져 서서히 굴절된 동맥 끝에 묶여 혈관을 고정합니다.
3. 중간 대뇌 동맥을 분리하고 칸넬화합니다.
   1. 2-4% 흡입 된 이소플루란을 사용하여 스프라그 다울리 쥐에서 깊은 마취를 유도하십시오.
   2. 깊은 마취하에 기요틴을 사용하여 쥐를 참수하십시오.
   3. 조심스럽게 뼈 커터와 가위를 사용하여 두개골을 제거합니다.
   4. 두개골에서 뇌를 제거하고 얼음에 낮은 칼슘 PSS의 5 mL에 배치합니다.
   5. 스프링 가위와 집게를 사용하여 뇌에서 내경 100-200 μm의 쥐 중간 대뇌 동맥 (MCA)의 분기되지 않은 세그먼트를 식별하고 해부하십시오.
   6. MCA를 미세 한 집게를 사용하여 유리 캐뉼라에 장착하고 일반 PSS를 포함하는 근사계의 봉합사를 조여 고정하십시오.
   7. MCA 내에서 흐름이 없도록 말단 캐뉼라를 닫습니다.
   8. 유입 파이펫을 PSS를 보유한 저장소에 연결하여 인라인 압력 변환기로 모니터링되는 내발 압을 제어할 수 있습니다.
   9. 반전된 현미경 및 이미징 소프트웨어에 장착된 충전 결합 장치 카메라(재료 표참조)를 사용하여 캐뉼형 MCA를 시각화합니다.
   10. MCA의 축 길이를 강성도 flaccid도 나타나지 않아야 하는 대략적인 길이로 설정합니다.
   11. O₂ (95%)로 목욕 용액 의 평형화 및_CO2 (5%) 37 °C에서 적절한 산소화, 온도를 제공하고 7.4에서 pH를 유지합니다.
4. Impale (세포 혈장 막 관통) 혈관 평활근 세포.
   1. 접지 전극을 연결하고 myograph의 PSS에 침지 유지합니다.
   2. 용기 챔버를 조명하고 현미경을 통해 목욕 용액에서 미세 전극의 끝을 시각화합니다.
      참고: 대안적으로, 이미징 소프트웨어를 갖는 컴퓨터에서 MCA 및 마이크로전극을 시각화할 수 있다.
   3. 마이크로 조작기의 컨트롤을 사용하여 미세 전극의 끝을 혈관의 외벽에 가깝게 이동시다. 마이크로 전극의 미세 조작기와 끝은 조직과 관련하여 안정적인 위치에 있어야합니다.
      참고: 실험을 시작하기 전에 멤브레인 전압이 안정화되었는지 확인하십시오. 측정된 전압이 불안정한 경우 전극과 셀 간의 연결이 밀봉되지 않아 누출을 나타냅니다.
   4. 레코딩을 시작합니다.
   5. 마이크로 전극의 끝을 용기쪽으로 천천히 이동하여 미세 조작기의 과정 또는 미세 제어를 사용하여 용기의 중심을 조준합니다.
      참고: 때때로, 마이크로전극 팁이 근육 섬유 막에 접촉할 때 기록에서 작은 편향이 관찰될 수 있다.
   6. 팁이 용기에 근접하면 마이크로 조작기를 사용하여 한 번의 빠른 동작으로 전극을 전진하여 근육의 막을 뚫습니다.
   7. 이 시점에서 기록되는 Vm의 변경 내용을 관찰하기 시작할 수 있습니다. 마이크로 전극이 세포의 막을 뚫을 때 마이크로 조작기만 두지 마십시오.
      참고: 기록 및 기준 전극 사이의 전압 차이는 혈관 내 압력 또는 기타 흥분성 또는 억제 자극의 수준에 따라 0 mV에서 -40 mV 및 -75 mV 사이로 감소합니다. 이 판독값은 현재 세포의 막 횡단 전위 차를 특성화합니다.
   8. 정확한 측정을 위해 VSMC를 손상시키지 않고 선박의 다른 영역에서 단일 용기에 여러 개의 함선을 수행합니다.
   9. 기록 후, 조작기를 사용하여 한 번의 빠른 움직임으로 마이크로 전극을 제거합니다.
   10. 추가 분석을 위해 기록을 중지하고 데이터 파일을 저장합니다.

결과

제시된 방법은 굴절된 용기에서 Vm을 기록하는 데 안정적으로 사용될 수 있다. 뇌에서 MCA를 격리하는 방법을 설명하는 간단한 절차가 그림 1A에제시되어 있습니다. 두개골에서 뇌를 분리 한 후, MCA는 해부하고 낮은 칼슘 PSS를 포함하는 페트리 접시에 배치되었다. 부착 된 결합 조직의 일부는 또한 격리 하는 동안 MCA에 손상을 방지 하기 위해 ?...

토론

이 문서에서는 날카로운 미세 전극 임팔레이 방법을 사용하여 굴절된 용기 준비로부터 Vm을 기록하는 방법에 대한 필요한 단계를 제공합니다. 이 방법은 널리 사용되며 광범위한 실험 적 질문에 대답하는 고품질의 일관된 V_m 기록을 제공합니다.

메서드의 성공을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 고려 사항 및 문제 해결 단계가 여기에 설명되어 있습니다. 마이크?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser	Parkland scientific	V3000PK
Dissection microscope	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer Bone Cutter	Fine science tools	16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps	Fine science tools	11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt	Fine science tools	14008-14
Suture	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas Spring Scissors	Fine science tools	15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera	Qimaging, , BC	Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier	WPI	FD223A
In-line pressure transducer	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
Micromanipulator	Thor labs	PCS-5400
Microelectrodes	Warner Instruments LLC, CT	G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe)	WPI	MF28G67-5
Microelectrode holder	WPI	MEH1SF
Myograph	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
Puller	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
Vibration-free table	TMC	3435-14
Softwares
Clampex 10	Molecular devices
p Clamp 10	Molecular devices
Imaging software	Nikon, NY	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
Glucose	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761