JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نقدم طريقة لتنقية والكشف وتحديد الببتيدات diGly التي تنشأ من البروتينات في كل مكان من عينات بيولوجية معقدة. الطريقة المعروضة قابلة للاستنساخ وقوية وتتفوق على الأساليب المنشورة فيما يتعلق بمستوى عمق تحليل كل يوم.

Abstract

التعديل بعد التحويل ية للبروتينات بواسطة البروتين الصغير في كلمكانفيا تشارك في العديد من الأحداث الخلوية. بعد الهضم الtryptic من البروتينات في كل مكان، يمكن استخدام الببتيدات مع بقايا diglycine مترافقة مع مجموعة أمينية إبسيلون من الليسين ('K-а-diglycine' أو ببساطة 'diGly') لتتبع موقع التعديل الأصلي. وقد أدى التنقية المناعية الفعالة من الببتيدات diGly جنبا إلى جنب مع الكشف الحساس عن طريق قياس الطيف الكتلي إلى زيادة كبيرة في عدد مواقع التعامي التي تم تحديدها حتى الآن. لقد قمنا بإجراء العديد من التحسينات على سير العمل هذا ، بما في ذلك تجزئة المرحلة العكسية عالية في عدم الاتصال بـ pH من الببتيدات قبل إجراء الإثراء ، وإدراج إعدادات تجزئة الببتيد الأكثر تقدمًا في متعدد القطب لتوجيه الأيون. أيضا، تنظيف أكثر كفاءة من العينة باستخدام المكونات القائمة على مرشح من أجل الاحتفاظ حبات الأجسام المضادة يؤدي إلى مزيد من التحديد للببتيدات diGly. هذه التحسينات تؤدي إلى الكشف الروتيني لأكثر من 23،000 الببتيدات diGly من خلايا سرطان عنق الرحم البشرية (هيلا) التحلل على تثبيط البروتينفي الخلية. نظهر فعالية هذه الاستراتيجية للتحليل المتعمق لمحات كليوموكلوتينوم من عدة أنواع مختلفة من الخلايا وفي عينات الجسم الحي، مثل أنسجة الدماغ. تقدم هذه الدراسة إضافة أصلية إلى صندوق الأدوات لتحليل انتشار البروتين للكشف عن كل يوم في كل مكان خلوي عميق.

Introduction

اقتران ubiquitin إلى البروتينات علامات عليها لتدهور من قبل proteasome وهي عملية حاسمة في البروتوستاس. مجموعة C-المحطة الكاربوكسيلي من ubiquitin يشكل رابطة isopeptide مع مجموعة ليسين من البروتين المستهدف1,2. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إرفاق ubiquitin بوحدات ubiquitin الأخرى ، مما يؤدي إلى تشكيل هياكل بوليوبيكوتين متجانسة (أي K48 أو K11) أو متفرعة (أي غير متجانسة أو مختلطة) هياكل البوليوبيكوتين1،3. الوظيفة الأكثر شهرة من ubiquitin هو دوره في تدهور بروتياسومي، بوساطة polyubiquitin K48 المرتبطة. ومع ذلك ، فقد أصبح من الواضح أن كل من أحادية ، وكذلك polyubiquitination تلعب أيضا أدوارا في العديد من العمليات التي هي مستقلة عن تدهور من قبل proteasome. على سبيل المثال، سلاسل K63 المرتبطة لها أدوار غير مُنُهِية في الاتجار داخل الخلايا، وتدهور الليسوسومي، وإشارات الكيناز، واستجابة تلف الحمض النووي4،,5. الأنواع الستة الأخرى الروابط هي أقل وفرة وأدوارها لا تزال غامضة إلى حد كبير، على الرغم من أن المؤشرات الأولى حول وظائفها في الخلية بدأت تظهر، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى تطوير أدوات جديدة لتمكين الكشف عن الروابط الخاصة6,7.

أصبح قياس الطيف الكتلي أداة لا غنى عنها لتحليل البروتينات وفي الوقت الحاضر يمكن تحديد الآلاف من البروتينات المختلفة من أي مصدر بيولوجي تقريبًا في تجربة واحدة. يتم تقديم طبقة إضافية من التعقيد عن طريق التعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) من البروتينات (على سبيل المثال، الفوسفور، الميثيل، الأسيتيل، وubiquitination) التي يمكن أن تعدل نشاط البروتين. كما أصبح التحديد الواسع النطاق للبروتينات الحاملة لـ PTM ممكناً بسبب التطورات في مجال قياس الطيف الكتلي. إن قياس الببتيدات المنخفض نسبياً والحامل لـ PTMs مقارنة بنظيراتها غير المعدلة يمثل تحدياً تقنياً، وخطوات الإثراء البيوكيميائية ضرورية بشكل عام قبل تحليل قياس الطيف الكتلي. وعلى مدى العقدين الماضيين، تم تطوير عدة أساليب تخصيب محددة مختلفة لتحليل تدابير التخصيب المتعددة الجوانب.

بسبب الأدوار المتعددة الأوجه للبروتين في كل مكان في الخلية ، هناك طلب كبير على تطوير الطرق التحليلية للكشف عن مواقع التعامي على البروتينات8. وقد أدى تطبيق أساليب الطيف الشامل إلى انفجار عدد المواقع المحددة في كل مكان في ذبابة الفاكهة والفأر والإنسان والخميرة البروتينات9،10،1111،12،13،14. وقد تم تقديم خطوة رئيسية من خلال تطوير استراتيجيات الإثراء القائمة على الترسيب المناعي على مستوى الببتيد باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد زخارف بقايا K-а-GG (يشار إليها أيضًا باسم "diglycine" أو "diGly"). يتم إنتاج هذه الببتيدات diGly عند هضم البروتينات في كل مكان باستخدام التربسين كما البروتياز15,16.

هنا ، نقدم سير عمل محسن لإثراء الببتيدات diGly باستخدام الببتيدات المناعية والكشف اللاحق عن طريق قياس الطيف الكتلي Orbitrap. باستخدام مزيج من عدة تعديلات على سير العمل الحالي ، وخاصة في إعداد العينة ومراحل قياس الطيف الكتلي ، يمكننا الآن تحديد أكثر من 23000 ببتيد diGly بشكل روتيني من عينة واحدة من خلايا HeLa تعامل مع بروتيجسوم مثبط و ~ 10،000 من خلايا هيلا غير المعالجة. لقد طبقنا هذا البروتوكول على الليسات من كل من تسمية النظائر غير المسماة ومستقرة مع الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (SILAC) المسماة خلايا هيلا وكذلك إلى عينات داخلية مثل أنسجة الدماغ.

يقدم سير العمل هذا إضافة قيمة إلى ذخيرة أدوات لتحليل مواقع الكلى من أجل الكشف عن الكلوتينيوم العميق. يصف البروتوكول التالي كافة خطوات سير العمل بالتفصيل.

Protocol

وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها على جميع الأساليب الموصوفة هنا التابعة لإيراسموس إم سي.

1. إعداد عينة

  1. الخلايا المثقفة
    1. حدد خط الخلية ذات الاهتمام (على سبيل المثال، HeLa أو خلايا العظام [U2OS] الخلايا) وتنمو الخلايا في جلبكو الحد الأدنى النسر المتوسطة (DMEM) تكملها حرارة 10٪ مصل البقر الجنين المنشط (FBS) و 100 وحدة / مل البنسلين / العقديات.
    2. لتجارب البروتيوميات الكمية، الخلايا الثقافية في DMEM تفتقر إلى أرجينين وليسين. يجب أن تستكمل المتوسطة مع 10٪ مصل البقري الجنيني dialyzed (FBS), 100 وحدة / مل البنسلين / العقديات, وألانين الجلوتامين. جعل نوعين من وسائل الإعلام عن طريق إضافة إما الليسين التقليدية وأرجينين ('الضوء' المتوسطة) أو ليسين-8(13C6; 15N2)وأرجينين-10(13C6; 15N4)('الثقيلة' المتوسطة)، على التوالي.
    3. دفعات الاستزراع من الخلايا في المتوسط الخفيف (أي غير المسمى) والمتوسطة الثقيلة (أي المسمى، SILAC) لمدة ست مرات على الأقل قبل التوسع والعلاج للتأكد من أن جميع البروتينات في الثقافة المتوسطة الثقيلة تحمل نظائر مستقرة ثقيلة تحتوي على الأحماض الأمينية.
    4. علاج الخلايا لمدة 8 ساعة مع 10 ميكرومتر من bortezomib مثبط البروتينأو ما يعادل حجم DMSO كعلاج وهمي. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، وفصلها باستخدام 1٪ التربسين / EDTA، وبيليه الخلايا.
    5. ليس بيليه الخلية من واحد 150 سم2 لوحة الثقافة لكل حالة اختبارها في 2 مل من الجليد الباردة 50 mM تريس-HCl (درجة الحموضة = 8.2) مع 0.5% ديوكشولات الصوديوم (DOC). يغلي lysate في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة وسونيكات لمدة 10 دقيقة (وضع "H" لسونيكاتور المدرجة في جدول المواد)في 4 درجة مئوية. نحن لا ننصح باستخدام مثبطات deubiquitinase مثل N-ethylmaleimide (NEM), لأن هذا قد إدخال تعديلات البروتين غير المرغوب فيها التي يمكن أن تعقد التعرف على الببتيد.
  2. في الأنسجة الدماغ الماوس على الجسم الحي
    1. عند استخدام في أنسجة الجسم الحي، lyse الأنسجة في عازلة الجليد الباردة التي تحتوي على 100 mM تريس-HCl (درجة الحموضة = 8.5)، 12 mM الصوديوم DOC، و 12 mm الصوديوم ن-lauroylsarcosinate17. Sonicate lysate لمدة 10 دقيقة (وضع "H" لsonicator المدرجة في جدول المواد)في 4 درجة مئوية وتغلي lysate لمدة 5 دقيقة في 95 درجة مئوية.
  3. كمية إجمالي كمية البروتين باستخدام امتصاص اللون BCA مجموعة فحص البروتين. يجب أن تكون الكمية الإجمالية للبروتين على الأقل عدة ملليغرام لناجحة diGly الببتيد المناعيال (الملكية الفكرية). بالنسبة لتجارب SILAC، تخلط البروتينات الخفيفة والثقيلة في نسبة 1:1 استنادًا إلى إجمالي كمية البروتين.
  4. تقليل جميع البروتينات باستخدام 5 mM 1,4-dithiothreitol لمدة 30 دقيقة في 50 درجة مئوية وalkylate ثم لهم مع iodoacetamide 10 mM لمدة 15 دقيقة في الظلام. إجراء هضم البروتين مع ليس-C (1:200 نسبة إنزيم إلى الركيزة) لمدة 4 ساعات تليها الهضم بين عشية وضحاها مع التربسين (1:50 نسبة الإنزيم إلى الركيزة) في 30 درجة مئوية أو في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. إضافة حمض ثلاثي الفلورواسيك (TFA) إلى العينة المهضومة إلى تركيز نهائي قدره 0.5٪ والطرد المركزي للعينة عند 10,000 × ز لمدة 10 دقيقة من أجل تسريع وإزالة جميع المنظفات. جمع supernatant التي تحتوي على الببتيدات للكسر اللاحقة.

2. تجزئة الببتيد دون اتصال

  1. استخدام درجة الحموضة العالية في المرحلة العكسية (RP) C18 الكروماتوغرافيا مع مادة المرحلة الثابتة البوليمرية (300 Å, 50 μM; انظر جدول المواد)محملة في خرطوشة عمود فارغة لكسر الببتيدات التربكية. يجب تعديل حجم السرير المرحلة الثابتة إلى كمية هضم البروتين لتكون مجزأة. إعداد فارغة 6 مل خرطوشة العمود (انظر جدول المواد)مليئة 0.5 غرام من المواد المرحلة الثابتة ل ~ 10 ملغ من هضم البروتين. يجب أن يكون هضم البروتين إلى نسبة المرحلة الثابتة حوالي 1:50 (ث / ث).
  2. قم بتحميل الببتيدات على العمود المعد واغسل العمود بحوالي 10 مجلدات عمود بنسبة 0.1٪ TFA، متبوعاً بحوالي 10 مجلدات عمود من H2O.
  3. يلخ الببتيدات إلى ثلاثة كسور مع 10 أحجام عمود من 10 mm ammonium formate الحل (pH = 10) مع 7٪، 13.5٪، و 50٪ الأسيتونتريل (AcN)، على التوالي. Lyophilize جميع الكسور إلى اكتمال.
  4. استخدام الأجسام المضادة في كل مكان (K-а-GG) مترافقة مع البروتين A حبات agarose للإثراء المناعي من الببتيدات diGly. لأن المبلغ الدقيق للجسم المضاد لكل دفعة من الخرز هو معلومات الملكية وليس الكشف عنها من قبل الشركة المصنعة، فمن المستحسن استخدام نفس التعريف لدفعة من الخرز كما يفعل الصانع من أجل تجنب الارتباك. غسل دفعة واحدة من هذه الخرز 2x مع برنامج تلفزيوني وتقسيم الطين حبة إلى ستة كسور متساوية. انظر الشكل 1 للاطلاع على مخطط تجريبي مفصل.
  5. حل كسور الببتيد الثلاثة التي تم جمعها في الخطوة 2.3 في 1.4 مل من عازل يتكون من 50 mM MOPS، و10 mM فوسفات الصوديوم، و 50 mM NaCl (pH = 7.2)، ويدور أسفل الحطام.
  6. إضافة الناسات من الكسور إلى حبات الأجسام المضادة diGly واحتضان لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية على وحدة دوار. تدور أسفل الخرز ونقل supernatant إلى دفعة جديدة من حبات الأجسام المضادة واحتضان مرة أخرى لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية.
  7. تخزين المواد الخارقة لتحليل البروتيوم العالمي اللاحق (GP).
  8. نقل الخرز من كل كسر إلى 200 μL تلميح ماصة مجهزة قابس مرشح GF / F للاحتفاظ الخرز. ضع طرف الماصة مع الخرز في أنبوب طرد مركزي صغير بـ 1.5 مل مجهز بمحول تلميح طرد مركزي. غسل الخرز 3x مع 200 ميكرولتر من الجليد الباردة IAP عازلة و3x في وقت لاحق مع 200 ميكرولتر من الجليد الباردة milliQ H2O. تدور أسفل العمود في 200 × ز لمدة 2 دقيقة قبل كل خطوة غسل، ولكن يجب الحرص على عدم السماح العمود تشغيل الجافة. تمل الببتيدات باستخدام دورتين من 50 ميكرولتر من 0.15٪ TFA.
  9. desalt الببتيدات باستخدام تلميح المرحلة C18 (أساسا 200 μL تلميح pipette مع اثنين من الأقراص C18) وتجفيفها إلى اكتمال باستخدام الطرد المركزي فراغ.

3. نانوتدفق LC-MS/MS

  1. إجراء تجارب LC-MS/MS على مطياف كتلة حساسة إلى جانب نظام LC تدفق نانو.
  2. استخدم عمودًا داخليًا مربّعًا بطول 50 سمًا مع قطر داخلي بطول 75 ميكرومتر ًا محشوًا براتنج CSH130 (3.5 ميكرومتر، 130 Å) وزل الببتيدات بتدرج 2-28٪ (AcN، 0.1٪ FA) على بعد 120 دقيقة عند 300 nL/min. بدلاً من ذلك، استخدم أعمدة LC المتاحة تجاريًا مع خصائص مماثلة. احتفظ بالعمود عند 50 درجة مئوية باستخدام فرن عمود، على سبيل المثال (انظر جدول المواد).
  3. إجراء تحليل قياس الطيف الكتلي.
    1. يجب تشغيل مطياف الكتلة في وضع الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA). يجب جمع أطياف كتلة MS1 بدقة عالية (على سبيل المثال، 120,000)، مع تحديد هدف التحكم الآلي في الكسب (AGC) من 4E5 ووقت حقن أقصى قدره 50 مللي ثانية في حالة مطياف كتلة Orbitrap.
    2. إجراء تحليل قياس الطيف الكتلي في وضع "أعلى كثافة أولاً". بهذه الطريقة ، يتم تحديد الأيون الأكثر كثافة أولاً للتجزئة ، ثم ثاني أعلى ، وهكذا دواليك ، باستخدام طريقة السرعة القصوى مع وقت دورة إجمالي 3 ثوانٍ. في وقت لاحق، قم بإجراء جولة ثانية من تحليل DDA MS في وضع "أدنى كثافة أولاً"، بحيث يتم تحديد الأيون الأقل كثافة أولاً، ثم ثاني أدنى، وهكذا دواليك. تضمن هذه الاستراتيجية الكشف الأمثل عن الببتيدات المنخفضة جدًا.
    3. تصفية الأيونات السلائف وفقا لولايات تهمة (2-7 التهم) وإحالة ذروة monoisotopic. استبعاد السلائف التي تم استجوابها سابقا بشكل حيوي لمدة 60 s. عزل سلائف الببتيد مع مرشح كتلة رباعية السلسلة تعيين إلى عرض 1.6 Th.
    4. جمع أطياف MS2 في فخ أيون في AGC من 7E3 مع الحد الأقصى لوقت الحقن من 50 مللي ثانية وطاقة الاصطدام HCD من 30٪.

4 - تحليل البيانات

  1. تحليل الملفات الخام الطيفية الشامل باستخدام محرك بحث مناسب مثل مجموعة برامج MaxQuant المتاحة بحرية على أساس محرك البحث أندروميدا18،19. في MaxQuant، حدد الإعدادات الافتراضية مع بعض التعديلات المشار ة أدناه. تعيين خصوصية الإنزيم لالتربسين، مع الحد الأقصى لعدد الانقسامات غاب رفعت إلى ثلاثة. تعيين ليسين مع بقايا diGly (+114.04 دا)، أكسدة الميثيونين وN-المحطة النهائية الأسيتيل كتعديلات متغيرة، وتعيين كارباميدوميثيليشن من السيستين كتعديل ثابت.
  2. إجراء عمليات البحث في قاعدة البيانات مقابل ملف FASTA يحتوي على تسلسلات البروتين التي تم تنزيلها من، على سبيل المثال، مستودع Uniprot(https://www.uniprot.org/downloads)جنبا إلى جنب مع شرك وقاعدة بيانات الملوثات الشائعة القياسية التي يتم توفيرها تلقائيا من قبل MaxQuant. تعيين معدل الاكتشاف الزائف (FDR) إلى 1٪ وتعيين الحد الأدنى للنقاط للببتيدات المعدلة (diGly) إلى 40 (القيمة الافتراضية). استبعاد الببتيدات التي تم تحديدها مع بقايا الليسين المعدلة C-terminal من مزيد من التحليل.
  3. للتحليل الكمي لملفات تجربة SILAC، قم بتعيين التعدد إلى "2" وكرر الخطوة 4.2.
  4. إجراء جميع التحليلات المصب (على سبيل المثال، الإحصاءات، تحليلات علم الأنطولوجيا الجينية) مع وحدة بيرسيوس20 من مجموعة برامج MaxQuant.

النتائج

البروتينات في كل مكان ترك 114.04 دا بقايا diglycine على بقايا الليسين الهدف عندما يتم هضم البروتينات مع التربسين. تم استخدام الفرق الكتلي الناجم عن هذا الزخرف ة للتعرف بشكل لا لبس فيه على موقع التعامي في تجربة قياس الطيف الكتلي. الاستراتيجية التي نصفها هنا هي طريقة حديثة لإثراء ?...

Discussion

تم تطبيق البروتوكول الموصوف هنا على عينات من مصادر بيولوجية مختلفة، مثل الخلايا المستزرعة وفي أنسجة الجسم الحي. في جميع الحالات حددنا الآلاف من الببتيدات diGly، شريطة أن يكون إجمالي كمية مدخلات البروتين 1 ملغ على الأقل. الإثراء باستخدام أجسام مضادة محددة فعالة للغاية ، بالنظر إلى أنه تم تحد?...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

هذا العمل هو جزء من مشروع "البروتينات في العمل"، وهو برنامج للمركز الهولندي للبروتيوميات الذي تموله المنظمة الهولندية للبحث العلمي كجزء من خارطة الطريق الوطنية على نطاق واسع مرافق البحوث (المشروع رقم 184.032.201 ).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DithioerythritolSigma-AldrichD8255
3M Empore C18 Octadecyl disksSupelco66883-Uproduct discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Ammonium formateSigma-Aldrich70221
BortezomibUBPbio
CSH130 resin, 3.5 μm, 130 ÅWaters
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich34869
DMEMThermoFisher
EASY-nanoLC 1200ThermoFisher
FBSGibco
GF/F filter plugWhatman1825-021
IodoacetamideSigma-AldrichI6125
Lysine, ArginineSigma-Aldrich
Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC)Wako Pure Chemicals129-02541
NanoLC ovenMPI design, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodium saltSigma-AldrichL-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometerThermoFisher
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher / Pierce23225
PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particlesAgilent TechnologiesPL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) KitCell Signaling Technologies5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac CartridgeWatersWAT036790Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970
Tris-baseSigma-AldrichT6066
Tris-HClSigma-AldrichT5941
Trypsin, TPCK TreatedThermoFisher20233

References

  1. Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
  2. Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
  3. Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
  4. Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
  5. Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
  6. Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
  7. Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
  8. Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
  9. Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
  10. Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
  11. Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
  12. Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).
  13. Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
  14. Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
  15. Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
  16. Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
  17. Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
  18. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  19. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  20. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
  21. Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
  22. Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
  23. Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
  24. Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157 ubiquitination ubiquitin ubiquitinome PTM diGly

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved