Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

Resumo

Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.

Resumo

A modificação pós-tralácida das proteínas pela pequena ubiquitina proteica está envolvida em muitos eventos celulares. Após a digestão tripé de proteínas ubiquitinadas, peptídeos com um remanescente diglíino conjugado ao grupo epsilon amino de lysina ('K-ε-diglycine' ou simplesmente 'diGly') podem ser usados para rastrear o local original de modificação. A imunopurificação eficiente dos peptídeos diGly combinados com a detecção sensível por espectrometria de massa resultou em um enorme aumento no número de locais de ubiquitinação identificados até o momento. Fizemos várias melhorias neste fluxo de trabalho, incluindo o fracionadode em fase inversa de pH off-line de peptídeos antes do procedimento de enriquecimento, e a inclusão de configurações mais avançadas de fragmentação de peptídeos no multipólo de roteamento de íons. Além disso, a limpeza mais eficiente da amostra usando um plugue baseado em filtro para reter as contas de anticorpos resulta em uma maior especificidade para peptídeos diGly. Essas melhorias resultam na detecção rotineira de mais de 23.000 peptídeos diGly de células cancerígenas do colo uterino humano (HeLa) sobre a inibição proteasome na célula. Mostramos a eficácia dessa estratégia para análise aprofundada dos perfis ubiquitino dos vários tipos de células diferentes e de amostras in vivo, como tecido cerebral. Este estudo apresenta uma adição original à caixa de ferramentas para análise de ubiquitina proteica para descobrir a ubiquitinome celular profunda.

Introdução

A conjugação de ubiquitina às proteínas marca-as para a degradação pelo proteasome e é um processo crucial na proteostasis. O grupo carboxyl c-terminal de ubiquitina forma uma ligação isopeptídeo com o grupo lysine ε-amino da proteína alvo^1,2. Além disso, a ubiquitina pode ser anexada a outros módulos de ubiquitina, resultando na formação de estruturas homogêneas (ou seja, K48 ou K11) ou ramificadas (i.e., heterogêneas ou mistas) estruturas de poliubiquitina^1,3. A função mais conhecida da ubiquitina é seu papel na degradação proteasômica, mediada pela poliubiquitina ligada ao K48. No entanto, tornou-se claro que tanto a mono- como a poliubiquitina também desempenham papéis em muitos processos que são independentes da degradação pelo proteasome. Por exemplo, as cadeias ligadas ao K63 têm papéis não degradativos no tráfico intracelular, degradação lisossômica, sinalização de quinase e resposta de dano de DNA^4,5. Os outros seis tipos de ligação são menos abundantes e seus papéis ainda são em grande parte enigmáticos, embora as primeiras indicações sobre suas funções na célula estejam surgindo, em grande parte devido ao desenvolvimento de novas ferramentas para permitir a detecção específica de ligação^6,7.

A espectrometria de massa tornou-se uma ferramenta indispensável para análises de proteome e hoje em dia milhares de proteínas diferentes de praticamente qualquer fonte biológica podem ser identificadas em um único experimento. Uma camada adicional de complexidade é apresentada por modificações pós-traduções (PTMs) de proteínas (por exemplo, fosforilação, metilação, acetilação e ubiquitinação) que podem modular a atividade proteica. A identificação em larga escala de proteínas portadoras de PTM também foi possível graças aos desenvolvimentos no campo de espectrometria de massa. A estequiometria relativamente baixa de peptídeos portadores de PTMs em comparação com suas contrapartes não modificadas apresenta um desafio técnico e passos de enriquecimento bioquímico são geralmente necessários antes da análise de espectrometria de massa. Ao longo das últimas duas décadas, vários métodos específicos de enriquecimento foram desenvolvidos para a análise de PTMs.

Devido aos papéis multifacetados da ubiquitina proteica na célula, há uma grande demanda para o desenvolvimento de métodos analíticos para a detecção de locais de ubiquitina em proteínas⁸. A aplicação de métodos espectrométricos de massa levou a uma explosão do número de locais de ubiquitina identificados em proteínas de mosca-das-frutas, camundongos, humanos e leveduras^{99,10,,11,,12,,13,,14}. Um passo importante foi apresentado pelo desenvolvimento de estratégias de enriquecimento baseadas em imunoprecipitação no nível do peptídeo usando anticorpos direcionados contra o motivo remanescente k-ε-GG (também referido como "diglycine" ou "diGly"). Estes peptídeos diGly são produzidos após a digestão de proteínas ubiquitinas usando tripsina como protease^15,16.

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho otimizado para enriquecer para peptídeos diGly usando imunopurificação e detecção subseqüente por espectrometria de massa orbitrap. Usando uma combinação de várias modificações dos fluxos de trabalho existentes, especialmente nas fases de preparação da amostra e espectrometria de massa, agora podemos identificar rotineiramente mais de 23.000 peptídeos diGly de uma única amostra de células HeLa tratadas com um proteasome inibidor e ~10.000 de células HeLa não tratadas. Aplicamos este protocolo a lysates de rotulagem de isótopos não rotulados e estáveis com aminoácidos na cultura celular (SILAC) rotulados células HeLa, bem como a amostras endógenas, como tecido cerebral.

Este fluxo de trabalho apresenta uma valiosa adição ao repertório de ferramentas para a análise de locais de ubiquitina, a fim de descobrir a ubiquitinome profunda. O protocolo a seguir descreve todas as etapas do fluxo de trabalho em detalhes.

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (EDC) da Erasmus MC.

1. Preparação da amostra

1. Células cultivadas
   1. Selecione uma linha de interesse celular (por exemplo, HeLa ou osteossarcoma [U2OS]) e crie as células no Minimal Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco, complementada com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor (FBS) e 100 unidades/mL penicilina/estreptomicina.
   2. Para experimentos de proteômica quantitativa, as células de cultura no DMEM não possuem arginina e lysina. O meio deve ser suplementado com soro bovino fetal dialisado de 10% (FBS), 100 unidades/mL penicilina/estreptomicina e alanina-glutamina. Faça dois tipos de mídia adicionando lysina convencional e arginina ('Light' Medium) ou lysine-8⁽¹³C₆; ¹⁵N₂) e arginina-10⁽¹³C₆; ¹⁵N₄) ('Heavy' Medium), respectivamente.
   3. Lotes de culturas de células em Meio Leve (ou seja, sem rótulo) e Meio Pesado (ou seja, rotulado, SILAC) para pelo menos seis duplicações antes da expansão e tratamento para garantir que todas as proteínas da cultura Heavy Medium sejam rotuladas com isótopos estáveis pesados contendo isótopos estáveis pesados contendo isótopos estáveis pesados contendo isótopos estáveis pesados contendo isótopos estáveis pesados contendo Aminoácidos.
   4. Trate as células por 8 h com 10 μM do inibidor proteasome bortezomib ou um volume equivalente de DMSO como um tratamento simulado. Lave as células com PBS, dissocie-as usando 1% de tripsina/EDTA e pelota as células.
   5. Lyse a pelota celular de uma placa de cultura de 150 cm² por condição testada em 2 mL de gelo frio 50 mM Tris-HCl (pH = 8,2) com 0,5% de desoxicolato de sódio (DOC). Ferva o lysate a 95 °C por 5 min e sônica por 10 min (ajuste "H" para o sônico listado na Tabela de Materiais) a 4 °C. Não recomendamos o uso de inibidores de deubiquitinase como n-etilmaleimida (NEM), pois isso pode introduzir modificações proteicas indesejadas que podem complicar a identificação de peptídeos.
2. Tecido cerebral in vivo
   1. Ao utilizar tecido in vivo, lite o tecido em um tampão frio de gelo contendo 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 12 mM de sódio DOC e 12 mM de sódio N-lauroylsarcosinato¹⁷. Sonice o lysate por 10 min (ajuste "H" para o sônico listado na Tabela de Materiais) a 4 °C e ferva o lysato por 5 min a 95 °C.
3. Quantificar a quantidade total de proteína usando um kit de ensaio de proteína BCA de absorção colorimétrica. A quantidade total de proteína deve ser de pelo menos vários miligramas para uma imunoprecipitação de peptídeos diGly bem sucedida (IP). Para os experimentos SILAC, misture as proteínas leves e pesadas rotuladas em uma razão 1:1 com base na quantidade total de proteínas.
4. Reduza todas as proteínas usando 5 mM 1,4-dithiothreitol por 30 min a 50 °C e, posteriormente, alquila-las com iodoacetamide de 10 mM por 15 min no escuro. Realizar digestão proteica com Lys-C (proporção enzima-substrato de 1:200) por 4 h seguido de digestão noturna com tripsina (razão enzima-substrato de 1:50) a 30 °C ou à temperatura ambiente (RT).
5. Adicione ácido trifluoroacético (TFA) à amostra digerida a uma concentração final de 0,5% e centrifugue a amostra a 10.000 x g por 10 min, a fim de precipitar e remover todo o detergente. Coletar o sobrenadante contendo os peptídeos para fracionamento subseqüente.

2. Fracionamento de peptídeos offline

1. Use cromatografia de fase reversa de pH alto (RP) c18 com material de fase estacionária polimérico (300 Å, 50 μM; ver Tabela de Materiais) carregado em um cartucho de coluna vazio para fracionar os peptídeos tripés. O tamanho do leito de fase estacionária deve ser ajustado à quantidade de proteína digerível a ser fracionado. Prepare um cartucho vazio de coluna de 6 mL (ver Tabela de Materiais) preenchido com 0,5 g de material de fase estacionária para ~10 mg de digestão de proteínas. A relação proteína digesta a fase estacionária deve ser de aproximadamente 1:50 (c/w).
2. Carregue os peptídeos na coluna preparada e lave a coluna com aproximadamente 10 volumes de coluna de 0,1% TFA, seguido por aproximadamente 10 volumes de coluna súdo de H₂O.
3. Eluir os peptídeos em três frações com volumes de 10 colunas de solução de formato de amônio de 10 mM (pH = 10) com 7%, 13,5% e 50% de acetonitrilo (AcN), respectivamente. Liofilo todas as frações para a completude.
4. Use anticorpos remanescentes de ubiquitina (K-ε-GG) conjugados à proteína A agarose beads para o imunoenriquecimento de peptídeos diGly. Como a quantidade exata de anticorpos por lote de contas é de propriedade e não divulgada pelo fabricante, recomenda-se usar a mesma definição para um lote de contas como o fabricante faz para evitar confusão. Lave um lote dessas contas 2x com PBS e divida o chorume de contas em seis frações iguais. Consulte a Figura 1 para um esquema experimental detalhado.
5. Dissolver as três frações de peptídeos coletadas na etapa 2.3 em 1,4 mL de um tampão composto por 50 mM MOPS, fosfato de sódio de 10 mM e 50 mM NaCl (pH = 7,2), e girar os detritos.
6. Adicione os sobrenatantes das frações às contas de anticorpos diGly e incubar por 2 h a 4 °C em uma unidade rotadora. Gire as contas e transfira o sobrenadante para um lote fresco de contas de anticorpos e incuba novamente por 2 h a 4 °C.
7. Armazene os sobrenatantes para análise subsequente de proteome global (GP).
8. Transfira as contas de cada fração para uma ponta de pipeta de 200 μL equipada com um plugue de filtro GF/F para reter as contas. Coloque a ponta da pipeta com as contas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL equipado com um adaptador de ponta centrífuga. Lave as contas 3x com 200 μL de tampão IAP gelado e, posteriormente, 3x com 200 μL de gelo-frio milliQ H₂O. Gire a coluna a 200 x g por 2 min antes de cada passo de lavagem, mas tome cuidado para não deixar a coluna secar. Eluir os peptídeos usando 2 ciclos de 50 μL de 0,15% TFA.
9. Dessalificar os peptídeos usando uma ponta de estágio C18 (essencialmente uma ponta de pipeta de 200 μL com dois discos C18) e secá-los para completar usando centrifugação de vácuo.

3. Nanofluxo LC-MS/MS

1. Realize experimentos LC-MS/MS em um espectrômetro de massa sensível acoplado a um sistema LC de nanofluxo.
2. Use uma coluna de fase invertida de 50 cm embalada internamente com um diâmetro interno de 75 μm embalado com resina CSH130 (3,5 μm, 130 Å) e eluie os peptídeos com um gradiente de 2-28% (AcN, 0,1% FA) sobre 120 min a 300 nL/min. Alternativamente, use colunas de LC disponíveis comercialmente com propriedades similares. Mantenha a coluna a 50 °C usando um forno de coluna, por exemplo (ver Tabela de Materiais).
3. Faça a análise de espectrometria de massa.
   1. O espectrômetro de massa deve ser operado no modo de aquisição dependente de dados (DDA). Os espectros de massa MS1 devem ser coletados em alta resolução (por exemplo, 120.000), com uma configuração de meta de controle de ganho automatizado (AGC) de 4E5 e um tempo máximo de injeção de 50 ms no caso de um espectrômetro de massa Orbitrap.
   2. Realize a análise de espectrometria de massa no modo "Maior Intensidade Primeiro" primeiro. Dessa forma, o íon mais intenso é selecionado primeiro para fragmentação, depois o segundo mais alto, e assim por diante, usando o método de velocidade máxima com um tempo total de ciclo de 3 s. Posteriormente, realize uma segunda rodada de análise DDA MS no modo "Menor Intensidade Primeiro", de modo que o íon menos intenso seja selecionado primeiro, depois o segundo mais baixo, e assim por diante. Essa estratégia garante a detecção ideal de peptídeos de abundancy muito baixos.
   3. Filtrar os íons precursores de acordo com seus estados de carga (2-7 cargas) e atribuição de pico monoisotópico. Exclua os precursores previamente interrogados dinamicamente para 60 s. Isole os precursores do peptídeo com um filtro de massa quadrúpole definido para uma largura de 1,6 Th.
   4. Coletar espectros MS2 na armadilha de íons em um AGC de 7E3 com um tempo máximo de injeção de 50 ms e energia de colisão HCD de 30%.

4. Análise de dados

1. Analise os arquivos brutos de espectrometria de massa usando um mecanismo de pesquisa apropriado, como o conjunto de software MaxQuant livremente disponível com base no mecanismo de busca de Andrômeda^18,19. No MaxQuant, selecione as configurações padrão com algumas adaptações indicadas abaixo. Defina a especificidade da enzima para tripsina, com o número máximo de decotes perdidos elevado para três. Coloque a lysina com um remanescente diGly (+114.04 Da), oxidação de metionina e acetilação n-terminal como modificações variáveis, e definir carbamidometilação de cisteína como uma modificação fixa.
2. Realizar pesquisas de banco de dados contra um arquivo FASTA contendo seqüências proteicas baixadas, por exemplo, do repositório Uniprot(https://www.uniprot.org/downloads)combinado com uma isca e um banco de dados de contaminantes comum padrão que é fornecido automaticamente pelo MaxQuant. Defina a taxa de detecção falsa (FDR) para 1% e defina a pontuação mínima para peptídeos modificados (diGly) para 40 (valor padrão). Exclua peptídeos identificados com um resíduo de lysina diGly modificado do terminal C de análises posteriores.
3. Para a análise quantitativa dos arquivos de experimento SILAC, defina a multiplicidade como "2" e repita a etapa 4.2.
4. Realize todas as análises a jusante (por exemplo, estatísticas, análises de ontologia genética) com o módulo Perseus²⁰ do pacote de software MaxQuant.

Resultados

As proteínas ubiquitadas deixam um remanescente de diglycine 114,04 no resíduo de lysina alvo quando as proteínas são digeridas com tripsina. A diferença de massa causada por este motivo foi usada para reconhecer inequivocamente o local da ubiquitina em um experimento de espectrometria de massa. A estratégia que descrevemos aqui é um método de última geração para o enriquecimento e posterior identificação de peptídeos diGly por nanofluxo LC-MS/MS(Figura ...

Discussão

O protocolo descrito aqui foi aplicado a amostras de diversas fontes biológicas, como células cultivadas e tecido in vivo. Em todos os casos identificamos milhares de peptídeos diGly, desde que a quantidade total de entrada de proteínas fosse de pelo menos 1 mg. O enriquecimento utilizando anticorpos específicos é altamente eficiente, uma vez que apenas no máximo 100-150 peptídeos diGly muito baixos abundantes foram identificados a partir de lysatos celulares inteiros se não foram aplicados procedimentos de enri...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithioerythritol	Sigma-Aldrich	D8255
3M Empore C18 Octadecyl disks	Supelco	66883-U	product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Ammonium formate	Sigma-Aldrich	70221
Bortezomib	UBPbio
CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å	Waters
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	34869
DMEM	ThermoFisher
EASY-nanoLC 1200	ThermoFisher
FBS	Gibco
GF/F filter plug	Whatman	1825-021
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125
Lysine, Arginine	Sigma-Aldrich
Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)	Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC)	Wako Pure Chemicals	129-02541
NanoLC oven	MPI design, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodium salt	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	ThermoFisher
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher / Pierce	23225
PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles	Agilent Technologies	PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit	Cell Signaling Technologies	5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge	Waters	WAT036790	Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	30970
Tris-base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Trypsin, TPCK Treated	ThermoFisher	20233