איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

Summary

אנו מציגים שיטה לטיהור, איתור וזיהוי של פפטידים diGly שמקורם בחלבונים אוביקטיביים מדגימות ביולוגיות מורכבות. השיטה המוצגת מופצת, איתנה, ומבצעת שיטות שפורסמו ביחס לרמת העומק של האנליזה האוביקווינופית.

Abstract

השינוי הפוסט-ממדי של חלבונים על ידי החלבון הקטן אוביקוויפין מעורב באירועים סלולריים רבים. לאחר העיכול הטריפטי של חלבונים אוביקוויטיים, פפטידים עם שארית דיגליצין מצוזרת לקבוצת האמינו אפסילון של ליזין (K-ε-diglycine ' או פשוט ' diGly ') ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר האתר המקורי שינוי. החיסונית יעילה של פפטידים diGly בשילוב עם זיהוי רגיש על ידי ספקטרומטר מסה הביא לעלייה עצומה במספר האתרים אוביקווינציה שזוהו עד היום. עשינו מספר שיפורים בזרימת עבודה זו, כולל גבוהה במצב לא מקוון pH-שלב לאחור השבר של פפטידים לפני הליך העשרה, והכללת הגדרות פיצול פפטיד מתקדמות יותר ב-multipole הניתוב יונים. גם, ניקוי יעיל יותר של המדגם באמצעות תקע מבוסס מסנן כדי לשמור על חרוזים הנוגדן תוצאות ספציפיות יותר עבור פפטידים diGly. שיפורים אלה התוצאה של הגילוי השגרתי של יותר מ 23,000 diGly פפטידים מתאי סרטן צוואר הרחם האנושי (הלה) תא lysates על עיכוב פרוטאסדום בתא. אנו מראים את היעילות של אסטרטגיה זו לניתוח מעמיק של הפרופילים אוביקווינוביים של מספר סוגי תאים שונים ובדגימות vivo, כגון רקמת המוח. מחקר זה מציג תוספת מקורית לארגז הכלים עבור ניתוח אוביקווינציה חלבונים כדי לחשוף את אוביקוויבידום הסלולר עמוק.

Introduction

בניין של אוביקוויב לחלבונים מסמן אותם עבור השפלה על ידי פרוטאסדום והוא תהליך מכריע ב פרוטאוסטזיס. C-טרמינל קרבוקסילי הקבוצה של הצורות אוביקוויב בקשר עם הקבוצה ליזין ε-אמינו של חלבון היעד^1,2. בנוסף, אוביקוויב יכול להיות מצורף מודולים אחרים אוביקוויב, וכתוצאה מכך היווצרות של הומוגנית (כלומר, K48 או K11) או מסוקנים (כלומר¹, הטרוגנית או מעורב) polyubiquitin^{מבנים 1,3}. הפונקציה הידועה ביותר של אוביקוויב היא תפקידה השפלה פרוטאספאל, בתיווך על ידי K48 מקושרים polyubiquitin. עם זאת, התברר כי הן מונו, כמו גם polyubiquitination גם לשחק תפקידים בתהליכים רבים כי הם עצמאיים של השפלה על ידי פרוטאסדום. למשל, רשתות מקושרות K63 יש תפקידים nondegradative בסחר תאיים, השפלה ליסוזומיום, איתות קינאז, ואת הנזק DNA תגובה^4,5. שישה סוגי ההצמדה האחרים הם פחות שופע ותפקידם הם עדיין במידה רבה, למרות הסימנים הראשונים על התפקודים שלהם בתא הם המתעוררים, בעיקר בגלל התפתחות של כלים חדשניים כדי לאפשר זיהוי ספציפי הצמדה^6,7.

ספקטרומטר מסה הפכה כלי הכרחי עבור ניתוחים פרוטדום וכיום אלפי חלבונים שונים כמעט כל מקור ביולוגי ניתן לזהות בניסוי אחד. שכבה נוספת של מורכבות מוצגת על ידי שינויים בפוסט-שינוי (למשל, זירחון, מתילציה, מרחלציה ואוביקווינציה) אשר יכולים לווסת את פעילות החלבונים. זיהוי בקנה מידה גדול של חלבונים PTM הנושאת גם התאפשר על ידי התפתחויות בשדה ספקטרומטר המסה. הסטואיצ'ימטריה הנמוכה יחסית של פפטידים הנושאים את הדבר המקביל לעמיתיהם שאינם שונו מציג אתגר טכני ושלבי העשרה ביוכימיים נחוצים בדרך כלל לפני ניתוח הספקטרומטר ההמוני. במהלך שני העשורים האחרונים פותחו מספר שיטות העשרה ספציפיות לניתוח של "פטין".

בגלל התפקידים הרב ביותר של אוביקוויטים חלבונים בתא, יש דרישה גדולה לפיתוח שיטות אנליטיות לאיתור אתרים אוביקווינציה על חלבונים⁸. היישום של שיטות ספקטרומטרי המוני הוביל לפיצוץ של מספר האתרים המזוהים אוביקווילנציה בתוך מעוף פירות, עכבר, אדם, ושמרים חלבונים^{9,10,11,12,13,14}. צעד מרכזי הוצג על ידי פיתוח אסטרטגיות העשרה המבוססות על immunoprecipitation ברמה פפטיד באמצעות נוגדנים בבימויו של K-ε-GG מוטיב שארית (המכונה גם "diglycine" או "diGly"). הפפטידים האלה מיוצרים על העיכול של חלבונים אוביקטילביים באמצעות טריפסין כפרוטאז^15,16.

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה ממוטבת כדי להעשיר את הפפטידים diGly באמצעות immunopurification ובעקבות גילוי על ידי ספקטרומטר המסה של אורדרראפ. באמצעות שילוב של מספר שינויים של זרימות עבודה קיימות, במיוחד בהכנה לדוגמה ובשלבים ספקטרומטר המסה, עכשיו אנחנו יכולים לזהות באופן שגרתי יותר מ 23,000 הפפטידים diGly ממדגם אחד של תאי הלה שטופלו עם פרוטאסדום מעכבי ו-~ 10,000 מתאי הלה לא מטופל. יש לנו להחיל את הפרוטוקול הזה כדי lysates מתוך תיוג איזוטופ יציב ו יציבה עם חומצות אמינו בתרבות התא (SILAC) המסומנים תאי הלה, כמו גם לדגימות אנדוגניים כגון רקמת המוח.

זרימת עבודה זו מציגה תוספת רבת ערך לרפרטואר של כלים לניתוח של האתרים אוביקווינציה על מנת לחשוף את אוביקוויבידום עמוק. הפרוטוקול הבא מתאר את כל השלבים של זרימת העבודה בפירוט.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (EDC) של ארסמוס MC.

1. הכנה לדוגמא

1. תאים מתורבתים
   1. בחר קו תא של עניין (למשל, הלה או אוסטאוסרקומה [U2OS] תאים) ולגדול את התאים בינונית נשר מינימלי של דולבקה (DMEM) שיושלם עם 10% חום בלתי מופעל באמצעות סרום העוברי (FBS) ו 100 יחידות/לסטרפטומיצין.
   2. עבור ניסויים כמותיים הפרוטקומאים, התרבות תאים ב dmem חסר ארגינין ו ליזין. המדיום חייב להיות שיושלם עם 10% סרום העוברי העובר דיאליזה (fbs), 100 יחידות/סטרפטומיצין ו-mL, ו אלכין-גלוטמין. ליצור שני סוגים של מדיה על ידי הוספת ליזין קונבנציונאלי ו ארגינין (' אור ' בינוני) או ליזין-8 (¹³ג₆; ¹⁵N₂) ו-arginine 10 (¹³ג₆; ¹⁵N₄) (' כבד ' בינוני), בהתאמה.
   3. התרבות אצוות של תאים בינוני בהיר (כלומר, ללא תווית) ו בינונית כבד (כלומר, מתויג, SILAC) עבור לפחות שישה טווח לפני התרחבות וטיפול כדי לוודא כי כל החלבונים בתרבות בינונית כבדה מתויגים עם איזוטופ יציב כבד המכיל חומצות אמינו.
   4. לטפל בתאים עבור 8 h עם 10 μM של מעכבי מעכב פרוטאסדום או נפח שווה ערך של DMSO כטיפול מבוים. רחץ את התאים עם PBS, הנתק אותם באמצעות 1% טריפסין/EDTA, וכלה את התאים.
   5. Lyse את הגלולה תא מ 1 150 ס מ² לוחית התרבות לכל תנאי נבדק 2 מ ל של קרח קר 50 mM טריס-HCl (pH = 8.2) עם 0.5% נתרן deאוקסיכולולאואט (DOC). מרתיחים את הליפוסט ב 95 ° c עבור 5 דקות ו sonicate עבור 10 דקות (הגדרת "H" עבור sonicator המפורטים בטבלה של חומרים) ב 4 ° c. אנחנו לא ממליצים על השימוש של מעכבי ביוקווינואז כמו N-ethylmaleimide (NEM), כי זה עשוי להציג שינויים חלבון לא רצויים שיכולים לסבך זיהוי פפטיד.
2. ברקמת מוח vivo העכבר
   1. כאשר משתמשים ברקמה vivo, lyse את הרקמה בתוך מאגר קר קרח המכיל 100 mM טריס-HCl (pH = 8.5), 12 mM נתרן DOC, ו 12 מ"מ נתרן N-lauroylsarcosinate¹⁷. Sonicate הליפוסט במשך 10 דקות (הגדרת "H" לsonicator המפורטים בטבלת החומרים) ב -4 ° c ומרתיחים את הליפוסט במשך 5 דקות ב 95 ° c.
3. ככמת את סכום החלבון הכולל באמצעות שיטת התאמת החלבון BCA. הסכום הכולל של החלבון צריך להיות לפחות כמה מיליגרם עבור immunoprecipitation פפטיד מוצלחת של diGly (IP). עבור ניסויים SILAC לערבב את האור ואת החלבונים המסומנים כבדים ביחס 1:1 בהתבסס על כמות החלבון הכולל.
4. להפחית את כל החלבונים באמצעות 5 מ"מ 1, 4-dithioitol עבור 30 דקות ב 50 ° c ולאחר מכן לאחר מכן האלדול אותם עם 10 מילימטר מאשר במשך 15 דקות בחושך. לבצע עיכול חלבון עם Lys-C (1:200 יחס אנזימים למצע) עבור 4 שעות ואחריו העיכול לילה עם טריפסין (1:50 יחס אנזים למצע) ב 30 ° צ' או בטמפרטורת החדר (RT).
5. הוסף חומצה trifluoroacetic (TFA) למדגם מתעכל לריכוז הסופי של 0.5% ו צנטריפוגה את המדגם ב 10,000 x g עבור 10 דקות כדי לזרז ולהסיר את כל חומרי הניקוי. לאסוף את סופרנטנט המכיל את הפפטידים עבור המהומה הבאה.

2. משבר פפטיד לא מקוון

1. השתמש גבוהה pH לאחור שלב (RP) סי18 כרומטוגרפיה עם חומר נייח בשלב הקבוע (300 Å, 50 μM; ראה טבלת חומרים) נטען לתוך מחסנית עמודה ריקה כדי לאנגיופלסטיקה את הפפטידים טריפטיים. הגודל הנייח של מיטת הפאזה חייב להיות מותאם לכמות החלבונים שניתן לעכל. הכינו מחסנית עמודה ריקה בגובה 6 מ ל (ראו טבלת חומרים) המלאה ב-0.5 גרם של חומר נייח בשלב של ~ 10 מ ג של תקציר חלבונים. תקציר חלבון ליחס שלב נייח צריך להיות כ 1:50 (w/w).
2. טען את הפפטידים על הטור המוכן ושטוף את העמודה עם כ 10 כרכים של עמודות של 0.1% TFA, ואחריו כ 10 כרכים של עמודות של H₂O.
3. Elute הפפטידים לתוך שלושה שברים עם 10 כרכים של עמודות 10 מ"מ הפתרון אמוניום (pH = 10) עם 7%, 13.5%, ו 50% acetonitrile (AcN), בהתאמה. ליאופליז כל השברים לשלמות.
4. השתמש אוביקוויב שארית מוטיב (K-ε-GG) נוגדנים מצוזרת לחלבון מחרוזת agarose עבור העשרת הפפטידים של diGly. בגלל הסכום המדויק של הנוגדן לכל אצווה של חרוזים הוא מידע קנייני ולא נחשף על ידי היצרן, מומלץ להשתמש באותה הגדרה עבור אצווה של חרוזים כמו היצרן עושה כדי למנוע בלבול. לשטוף חבילה אחת של החרוזים האלה 2x עם PBS ולפצל לתוך שישה שברים שווים. ראה איור 1 עבור ערכה ניסיונית מפורטת.
5. לפזר את שלושת השברים פפטיד שנאספו בשלב 2.3 ב1.4 mL של מאגר המורכב 50 מ ל מגבים, 10 מ"מ נתרן פוספט, ו 50 מ"מ (pH = 7.2), ולסובב את השברים.
6. הוסיפו את הסופרנטנים של השברים לחרוזי הנוגדן diGly ו הדגירה עבור 2 h ב 4 ° c על יחידת מסובבי. לסובב את החרוזים ולהעביר את supernatant לתוך אצווה טרייה של חרוזי נוגדן ו הדגירה שוב 2 h ב 4 ° c.
7. לאחסן את סופרנטנים עבור ניתוח פרוטדום הכללית הבאים (GP).
8. להעביר את החרוזים מכל שבר לתוך הקצה 200 μL הצינורות מצויד תקע GF/F מסנן לשמור את החרוזים. לשים את העצה הצינורות עם החרוזים לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL מצויד במתאם קצה צנטריפוגה. לשטוף את החרוזים 3x עם 200 μL של מאגר IAP קר קרח ולאחר מכן 3x עם 200 μL של קרח קר מילי מילימטר₂O. ספין לאורך העמודה ב 200 x g עבור 2 דקות לפני כל צעד לשטוף, אבל להיזהר לא לתת את העמודה לרוץ יבש. אליוט הפפטידים באמצעות 2 מחזורים של 50 μL של 0.15% TFA.
9. Desalt הפפטידים באמצעות תיאור שלב סי18 (למעשה טיפ 200 μL הפיפטה עם שני דיסקים סי18) ולייבש אותם לשלמות באמצעות צנטריפוגה ואקום.

3. ננופרופיל LC-MS/MS

1. בצע ניסויים LC-MS/MS על ספקטרומטר מסה רגיש בשילוב עם מערכת LC nanoflow.
2. השתמש ב-house ארוז 50 ס מ היפוך-שלב הטור עם קוטר 75 יקרומטר הפנימי ארוז עם שרף CSH130 (3.5 יקרומטר, 130 Å) ו elute הפפטידים עם הדרגתי של 2 ל 28% (acn, 0.1% FA) מעל 120 דקות ב 300 nL/min. לחילופין, השתמש בעמודות LC מסחריות זמינות עם מאפיינים דומים שמור את העמודה ב 50 ° צ' באמצעות תנור עמודה, למשל (ראה טבלת חומרים).
3. בצע את ניתוח הספקטרומטר המסה.
   1. על ספקטרומטר המסה להיות מופעל במצב רכישה תלוית נתונים (לוד). ספקטרום המסה MS1 יש לאסוף ברזולוציה גבוהה (למשל, 120,000), עם בקרת רווח אוטומטי (AGC) הגדרת היעד של 4E5 וזמן הזרקה מקסימלית של 50 ms במקרה של ספקטרומטר המסה של אורבראפ.
   2. בצע תחילה את ניתוח הספקטרומטר המסה במצב ' עוצמה גבוהה ביותר '. בדרך זו, היון האינטנסיבי ביותר נבחר ראשון לפיצול, אז השני הגבוה ביותר, וכן הלאה, באמצעות שיטת המהירות העליונה עם זמן מחזור כולל של 3 s. לאחר מכן, בצע סיבוב שני של ניתוח הדה-לילי במצב "העוצמה הנמוכה ביותר הראשונה", כך שהיון העמוק ביותר ייבחר קודם, ואז השני הנמוך ביותר, וכן הלאה. אסטרטגיה זו מבטיחה זיהוי אופטימלי של פפטידים מאוד נמוכים.
   3. סנן את היונים הקודנות לפי מצבי הטעינה שלהם (2-7 חיובים) והקצאת שיא מונואיזונושא. אל תכלול סמנים מוקדמים שנחקרו בעבר באופן דינאמי עבור 60 s. בידוד מקדים פפטיד עם מסנן המסה פי ארבעה של מוט מוגדר לרוחב של 1.6 Th.
   4. לאסוף MS2 ספקטרום במלכודת יונים ב-AGC של 7E3 עם זמן הזרקה מקסימלית של 50 ms ואנרגיה התנגשות HCD של 30%.

4. ניתוח נתונים

1. נתח את הקבצים הגולמיים של הספקטרומטר ספקטרומטריה באמצעות מנוע חיפוש מתאים כגון חבילת התוכנה הזמינה באופן חופשי maxquant המבוססת על מנוע החיפוש של אנדרומדה^18,19. ב-MaxQuant, בחר בהגדרות ברירת המחדל עם מספר עיבודים המצוינים להלן. הגדר את האנזים לטריפסין, עם המספר המירבי של ביקנים שהחמצת הגדלים עד שלוש. הגדר ליזין עם שארית digly (+ 114.04 Da), חמצון של מתיונין ו-N-טרמינל מרחלציה כמו שינויים משתנים, ולהגדיר carbamidomלציה של ציסטאין כשינוי קבוע.
2. בצע חיפושים במסד נתונים מול קובץ FASTA המכיל רצפי חלבון שהורדו מ-, לדוגמה, מאגר יוניפרוט (https://www.uniprot.org/downloads) בשילוב עם מדמה ומסד נתונים רגיל של מזהם שמסופק באופן אוטומטי על-ידי MaxQuant. קבע את קצב גילוי השקר (רוזוולט) ל-1% והגדר את הניקוד המינימלי עבור שינוי (diGly) כדי 40 (ערך ברירת מחדל). לא לכלול פפטידים מזוהה עם C-טרמינל diGly שונה ליזין שאריות מניתוח נוסף.
3. לניתוח כמותי של קבצי ניסוי SILAC, הגדר את הריבוי ל-"2" וחזור על שלב 4.2.
4. בצע את כל ניתוחי במורד הזרם (למשל, סטטיסטיקה, ניתוחי האונטולוגיה גנטי) עם מודול פרסאוס²⁰ של חבילת התוכנה MaxQuant.

תוצאות

חלבונים אוביקווילביים להשאיר את שארית 114.04 Da דה דיגליצין על השאריות ליזין היעד כאשר החלבונים מתעכלים טריפסין. ההפרש ההמוני שנגרם על-ידי מוטיב זה שימש לזיהוי משמעי של האתר של אוביקווינציה בניסוי ספקטרומטר המוני. האסטרטגיה שאנו מתארים כאן היא שיטה מתקדמת ליצירת העשרה והזד...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן חל על דגימות ממקורות ביולוגיים שונים, כגון תאים מתורבתים ורקמות vivo. בכל המקרים זיהינו אלפי פפטידים diGly, בתנאי הסכום הכולל של החלבון כמות היה לפחות 1 מ ג. העשרה שימוש בנוגדנים ספציפיים היא יעילה מאוד, בהתחשב בכך שרק ברוב 100-150 מאוד נמוך מאוד הפפטידים diGly זוהו מתוך ליטים תא ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithioerythritol	Sigma-Aldrich	D8255
3M Empore C18 Octadecyl disks	Supelco	66883-U	product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Ammonium formate	Sigma-Aldrich	70221
Bortezomib	UBPbio
CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å	Waters
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	34869
DMEM	ThermoFisher
EASY-nanoLC 1200	ThermoFisher
FBS	Gibco
GF/F filter plug	Whatman	1825-021
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125
Lysine, Arginine	Sigma-Aldrich
Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)	Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC)	Wako Pure Chemicals	129-02541
NanoLC oven	MPI design, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodium salt	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	ThermoFisher
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher / Pierce	23225
PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles	Agilent Technologies	PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit	Cell Signaling Technologies	5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge	Waters	WAT036790	Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	30970
Tris-base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Trypsin, TPCK Treated	ThermoFisher	20233