Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

Resumen

Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.

Resumen

La modificación posttranslacional de las proteínas por la pequeña proteína ubiquitina está involucrada en muchos eventos celulares. Después de la digestión tripptica de proteínas ubiquitinadas, se pueden utilizar péptidos con un remanente diglycine conjugado con el grupo de aminoácidos de épsilon ('K-o-diglycine' o simplemente 'diGly') para rastrear el sitio de modificación original. La inmunopurificación eficiente de péptidos diGly combinados con la detección sensible por espectrometría de masas ha dado lugar a un enorme aumento en el número de sitios de ubiquitinación identificados hasta la fecha. Hemos realizado varias mejoras en este flujo de trabajo, incluyendo el fraccionamiento de fase inversa de pH alto fuera de línea de péptidos antes del procedimiento de enriquecimiento, y la inclusión de ajustes de fragmentación de péptidos más avanzados en el multipolo de enrutamiento iónico. Además, una limpieza más eficiente de la muestra utilizando un tapón basado en filtros para retener las perlas de anticuerpos da como resultado una mayor especificidad para los péptidos diglily. Estas mejoras resultan en la detección rutinaria de más de 23.000 péptidos diGly de células de cáncer de cuello uterino humano (HeLa) las células se lisia al inhibir el proteasoma en la célula. Mostramos la eficacia de esta estrategia para el análisis en profundidad de los perfiles ubiquitinome de varios tipos celulares diferentes y de muestras in vivo, como el tejido cerebral. Este estudio presenta una adición original a la caja de herramientas para el análisis de ubiquitinación de proteínas para descubrir el ubiquitinomo celular profundo.

Introducción

La conjugación de ubiquitina a las proteínas las marca para la degradación por el proteosoma y es un proceso crucial en la proteostasis. El grupo carboxilo C-terminal de ubiquitina forma un enlace isopéptido con el grupo de lisina-amino de la proteína objetivo^1,2. Además, la ubiquitina se puede unir a otros módulos de ubiquitina, lo que resulta en la formación de estructuras homogéneas (es decir, K48 o K11) o ramificadas (es decir, heterogéneas o mixtas) de poliubiquitina^1,3. La función más conocida de la ubiquitina es su papel en la degradación proteasomal, mediada por poliubiquitina vinculada a K48. Sin embargo, ha quedado claro que tanto la mono- como la poliubiquitinación también juegan papel en muchos procesos que son independientes de la degradación por el proteosoma. Por ejemplo, las cadenas vinculadas a K63 tienen funciones no demoledor en el tráfico intracelular, la degradación issosomal, la señalización de quinasa y la respuesta de daño al ADN^4,5. Los otros seis tipos de enlaces son menos abundantes y sus funciones siguen siendo en gran medida enigmáticas, aunque están surgiendo las primeras indicaciones sobre sus funciones en la célula, en gran parte debido al desarrollo de nuevas herramientas para permitir la detección específica de la vinculación^6,7.

La espectrometría de masas se ha convertido en una herramienta indispensable para los análisis de proteome y hoy en día miles de proteínas diferentes de prácticamente cualquier fuente biológica se pueden identificar en un solo experimento. Una capa adicional de complejidad se presenta mediante modificaciones posttranslacionales (PTM) de proteínas (por ejemplo, fosforilación, metilación, acetilación y ubiquitinación) que pueden modular la actividad proteica. La identificación a gran escala de proteínas portadoras de PTM también ha sido posible gracias a los desarrollos en el campo de la espectrometría de masas. La estequiometría relativamente baja de péptidos que llevan PTM en comparación con sus contrapartes no modificadas presenta un desafío técnico y las etapas de enriquecimiento bioquímico son generalmente necesarias antes del análisis de espectrometría de masas. En las últimas dos décadas, se han desarrollado varios métodos de enriquecimiento específicos diferentes para el análisis de los MPT.

Debido a los roles multifacéticos de la ubiquitinación de proteínas en la célula, existe una gran demanda para el desarrollo de métodos analíticos para la detección de sitios de ubiquitinación en proteínas^8. La aplicación de métodos espectrométricos de masas ha dado lugar a una explosión del número de sitios de ubiquitinación identificados en la mosca de la fruta, ratón, humano y proteínas de levadura^{9,10,11,12,13,14}. Un paso importante fue presentado por el desarrollo de estrategias de enriquecimiento basadas en inmunoprecipitación a nivel de péptidos utilizando anticuerpos dirigidos contra el motivo remanente de K-o-GG (también conocido como 'diglycine' o 'diGly'). Estos péptidos digly se producen tras la digestión de proteínas ubiquitinadas utilizando la trippsina como la proteasa^15,,16.

Aquí, presentamos un flujo de trabajo optimizado para enriquecer los péptidos diglily utilizando inmunopurificación y posterior detección por espectrometría de masas Orbitrap. Usando una combinación de varias modificaciones de los flujos de trabajo existentes, especialmente en las etapas de preparación de muestras y espectrometría de masas, ahora podemos identificar rutinariamente más de 23.000 péptidos diGly de una sola muestra de células HeLa tratadas con un proteosoma inhibidor y 10.000 euros de células HeLa no tratadas. Hemos aplicado este protocolo a los lisados tanto del etiquetado de isótopos no etiquetados como estables con aminoácidos en el cultivo celular (SILAC) etiquetados células HeLa, así como a muestras endógenas como el tejido cerebral.

Este flujo de trabajo presenta una valiosa adición al repertorio de herramientas para el análisis de sitios de ubiquitinación con el fin de descubrir el ubiquitinome profundo. El protocolo siguiente describe todos los pasos del flujo de trabajo en detalle.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (EDC) de Erasmus MC.

1. Preparación de la muestra

1. Células cultivadas
   1. Seleccione una línea de interés celular (por ejemplo, células HeLa u osteosarcoma [U2OS]) y haga crecer las células en el medio mínimo de águila (DMEM) de Dulbecco complementado con 10% de calor en suero bovino fetal activado (FBS) y 100 unidades/ml de penicilina/estreptomicina.
   2. Para experimentos proteómicos cuantitativos, células de cultivo en DMEM carecen de arginina y lisina. El medio debe complementarse con suero bovino fetal (FBS) 10% dializado, 100 unidades/ml de penicilina/estreptomicina y alanina glutamina. Hacer dos tipos de medios añadiendo lisina convencional y arginina ('Light' Medium) o lisina-8 (¹³C₆; ¹⁵N₂) y arginina-10 (¹³C₆; ¹⁵N₄) («Medio pesado»), respectivamente.
   3. Lotes de cultivo de células en Medio Ligero (es decir, sin etiquetar) y Medio Pesado (es decir, etiquetado, SILAC) durante al menos seis duplicaciones antes de la expansión y el tratamiento para asegurarse de que todas las proteínas en el cultivo De Heavy Medium estén etiquetadas con isótopos pesados y estables que contengan isótopos pesados y estables que Aminoácidos.
   4. Tratar las células durante 8 h con 10 m del inhibidor del proteosoma bortezomib o un volumen equivalente de DMSO como tratamiento simulado. Lavar las células con PBS, disociarlas usando 1% de trippsina/EDTA, y peletizar las células.
   5. Lijar el pellet celular de una placa de cultivo de 150 cm² por condición probada en 2 ml de hielo-frío 50 mM Tris-HCl (pH a 8,2) con 0,5% de desoxicolato de sodio (DOC). Hervir el lisado a 95 oC durante 5 min y sonicar durante 10 min (ajuste "H" para el sonicador listado en la Tabla de Materiales)a 4oC. No recomendamos el uso de inhibidores de la deubiquitinasa como N-etilmaleimida (NEM), ya que esto puede introducir modificaciones proteicas no deseadas que pueden complicar la identificación de péptidos.
2. Tejido cerebral de ratón in vivo
   1. Cuando se utilice tejido in vivo, lisar el tejido en un tampón helado que contenga 100 mM Tris-HCl (pH a 8,5), DOC de sodio de 12 mM y N-lauroylsarcosinato de sodio¹⁷mM. Sonicar el lisado durante 10 min (ajuste "H" para el sonicador listado en la Tabla de Materiales)a 4 oC y hervir el lisado durante 5 min a 95 oC.
3. Cantidad de la cantidad total de proteína utilizando un kit de ensayo de proteína BCA de absorbación colorimétrica. La cantidad total de proteína debe ser de al menos varios miligramos para una inmunoprecipitación de péptido diGly exitosa (IP). Para los experimentos SILAC mezclan las proteínas etiquetadas ligeras y pesadas en una proporción de 1:1 basada en la cantidad total de proteínas.
4. Reducir todas las proteínas usando 5 mM 1,4-ditiothreitol durante 30 min a 50 oC y posteriormente alquilarlas con 10 mM de iodoacetamida durante 15 minutos en la oscuridad. Realizar la digestión proteica con Lys-C (relación enzima-sustrato 1:200) durante 4 h seguida de digestión durante la noche con trippsina (relación enzima-sustrato 1:50) a 30 oC o a temperatura ambiente (RT).
5. Añadir ácido trifluoroacético (TFA) a la muestra digerida a una concentración final del 0,5% y centrifugar la muestra a 10.000 x g durante 10 min para precipitar y eliminar todo el detergente. Recoger el sobrenadante que contiene los péptidos para el fraccionamiento posterior.

2. Fraccionamiento de péptidos sin conexión

1. Utilice la cromatografía C18 de fase inversa de pH alto (RP) con material de fase estacionaria polimérica (300 o, 50 m; ver tabla de materiales)cargado en un cartucho de columna vacío para fraccionar los péptidos trippticos. El tamaño del lecho de fase estacionaria debe ajustarse a la cantidad de proteína digerida que se va a fraccionar. Preparar un cartucho de columna vacío de 6 ml (ver Tabla de materiales)lleno de 0,5 g de material de fase estacionaria para 10 mg de digerido proteico. La relación de digerida proteica a fase estacionaria debe ser aproximadamente 1:50 (p/p).
2. Cargue los péptidos en la columna preparada y lave la columna con aproximadamente 10 volúmenes de columna de 0,1% TFA, seguido de aproximadamente 10 volúmenes de columna de H₂O.
3. Eluir los péptidos en tres fracciones con 10 volúmenes de columna de solución de formación de amonio de 10 mM (pH a 10) con 7%, 13,5% y 50% de acetonitrilo (AcN), respectivamente. Liofilizar todas las fracciones a la integridad.
4. Utilice anticuerpos de motivos remanentes de ubiquitina (K-o-GG) conjugados con cuentas de agarosa de proteína A para el inmunoenriquecimiento de péptidos digly. Debido a que la cantidad exacta de anticuerpos por lote de perlas es información de propiedad y no divulgada por el fabricante, se recomienda utilizar la misma definición para un lote de cuentas que el fabricante para evitar confusiones. Lave un lote de estas cuentas 2x con PBS y divida la suspensión de perlas en seis fracciones iguales. Consulte la Figura 1 para obtener un esquema experimental detallado.
5. Disolver las tres fracciones de péptidorecogidas recogidas en el paso 2.3 en 1,4 ml de un tampón compuesto de 50 mM de MOPS, 10 mM de fosfato sódico y 50 mM de NaCl (pH a 7,2), y espinar los escombros.
6. Añadir los sobrenadores de las fracciones a las cuentas de anticuerpos diGly e incubar durante 2 h a 4 oC en una unidad de rotator. Espinta las cuentas y transfiere el sobrenadante a un nuevo lote de cuentas de anticuerpos e incuba de nuevo durante 2 h a 4oC.
7. Almacene los sobrenadores para el posterior análisis global del proteome (GP).
8. Transfiera las perlas de cada fracción a una punta de pipeta de 200 ml equipada con un tapón de filtro GF/F para retener las perlas. Coloque la punta de la pipeta con las perlas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml equipado con un adaptador de punta centrífuga. Lavar las perlas 3x con 200 sl de tampón IAP helado y posteriormente 3x con 200 éL de miliQ Frío-frío H₂O. Gire hacia abajo la columna a 200 x g durante 2 minutos antes de cada paso de lavado, pero tenga cuidado de no dejar que la columna se seque. Eluir los péptidos usando 2 ciclos de 50 l de 0.15% TFA.
9. Deslízalos con una punta de etapa C18 (esencialmente una punta de pipeta de 200 ml con dos discos C18) y séquelos hasta completarlos mediante centrifugación al vacío.

3. Nanoflujo LC-MS/MS

1. Realice experimentos LC-MS/MS en un espectrómetro de masasensible acoplado a un sistema LC de nanoflujo.
2. Utilice una columna de fase invertida de 50 cm empaquetada internamente con un diámetro interior de 75 m embalado con resina CSH130 (3,5 m, 130 o) y eluda los péptidos con un gradiente de 2 a 28% (AcN, 0,1% FA) sobre 120 min a 300 nL/min. Mantenga la columna a 50 oC utilizando un horno de columna, por ejemplo (consulte Tabla de materiales).
3. Realice el análisis de espectrometría de masas.
   1. El espectrómetro de masas debe funcionar en modo de adquisición dependiente de datos (DDA). Los espectros de masa MS1 deben recogerse a alta resolución (por ejemplo, 120.000), con un ajuste de objetivo de control de ganancia automatizado (AGC) de 4E5 y un tiempo máximo de inyección de 50 ms en caso de un espectrómetro de masas Orbitrap.
   2. Realice primero el análisis de espectrometría de masas en el modo "Mayor intensidad primero". De esta manera, el ion más intenso se selecciona primero para la fragmentación, luego el segundo más alto, y así sucesivamente, utilizando el método de velocidad máxima con un tiempo de ciclo total de 3 s. Posteriormente, realice una segunda ronda de análisis de EM DDA en el modo "La intensidad más baja primero", de modo que primero se seleccione el ion menos intenso, luego el segundo más bajo, y así sucesivamente. Esta estrategia garantiza una detección óptima de péptidos de abundancia muy bajos.
   3. Filtrar los iones precursores según sus estados de carga (2-7 cargas) y asignación de pico monoisotópico. Excluya dinámicamente los precursores interrogados anteriormente para 60 s. Aísle los precursores de péptidos con un filtro de masa cuadrúpolo ajustado a una anchura de 1,6 Th.
   4. Recoger espectros MS2 en la trampa iónnica en un AGC de 7E3 con un tiempo máximo de inyección de 50 ms y una energía de colisión HCD del 30%.

4. Análisis de datos

1. Analice los archivos sin procesar de espectrometría de masas utilizando un motor de búsqueda adecuado, como la suite de software MaxQuant de libre disponibilidad basada en el motor de búsqueda de Andrómeda^18,19. En MaxQuant, seleccione la configuración predeterminada con algunas adaptaciones que se indican a continuación. Establezca la especificidad de la enzima en trippsina, con el número máximo de escotes no cumplidos elevado a tres. Establecer lisina con un remanente diGly (+114.04 Da), oxidación de metionina y Acetilación N-terminal como modificaciones variables, y establecer la carbamidometilación de la cisteína como una modificación fija.
2. Realice búsquedas de base de datos en un archivo FASTA que contenga secuencias de proteínas descargadas desde, por ejemplo, el repositorio Uniprot (https://www.uniprot.org/downloads) combinado con un señuelo y una base de datos de contaminantes comunes estándar que MaxQuant proporciona automáticamente. Establezca la tasa de detección falsa (FDR) en 1% y establezca la puntuación mínima para los péptidos modificados (diGly) en 40 (valor predeterminado). Excluya los péptidos identificados con un residuo de lisina modificado diGly c-lyde de análisis posterior.
3. Para el análisis cuantitativo de los archivos de experimento SILAC, establezca la multiplicidad en "2" y repita el paso 4.2.
4. Realice todos los análisis posteriores (por ejemplo, estadísticas, análisis de ontología genética) con el módulo Perseus²⁰ de la suite de software MaxQuant.

Resultados

Las proteínas ubiquitinadas dejan un remanente de 114.04 Da diglycine en el residuo de lisina diana cuando las proteínas se digieren con trippsina. La diferencia de masa causada por este motivo se utilizó para reconocer inequívocamente el sitio de la ubiquitinación en un experimento de espectrometría de masas. La estrategia que describimos aquí es un método de vanguardia para el enriquecimiento y la posterior identificación de péptidos digly por nanoflujo LC-MS/MS

Discusión

El protocolo descrito aquí se aplicó a muestras de diversas fuentes biológicas, como células cultivadas y tejido in vivo. En todos los casos identificamos miles de péptidos digly, siempre que la cantidad total de entrada de proteína sin al menos 1 mg. El enriquecimiento con anticuerpos específicos es altamente eficiente, dado que sólo a lo sumo se identificaron 100-150 péptidos digly muy bajos y abundantes a partir de lisatos de células enteras si no se aplicaron procedimientos de enriquecimiento para proteína...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithioerythritol	Sigma-Aldrich	D8255
3M Empore C18 Octadecyl disks	Supelco	66883-U	product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Ammonium formate	Sigma-Aldrich	70221
Bortezomib	UBPbio
CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å	Waters
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	34869
DMEM	ThermoFisher
EASY-nanoLC 1200	ThermoFisher
FBS	Gibco
GF/F filter plug	Whatman	1825-021
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125
Lysine, Arginine	Sigma-Aldrich
Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)	Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC)	Wako Pure Chemicals	129-02541
NanoLC oven	MPI design, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodium salt	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	ThermoFisher
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher / Pierce	23225
PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles	Agilent Technologies	PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit	Cell Signaling Technologies	5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge	Waters	WAT036790	Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	30970
Tris-base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Trypsin, TPCK Treated	ThermoFisher	20233