펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

요약

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

초록

작은 단백질 유비퀴틴에 의한 단백질의 번역 후 변형은 많은 세포 이벤트에서 관여한다. 유비퀴틴화된 단백질의 트리펩티드 소화 후, 리신의 엡실론 아미노 그룹('K-θ-디글리신' 또는 단순히 'diGly')에 컨쥬게이징된 디글리신 잔재를 함유한 펩티드를 원래의 수정 부위를 추적하는데 사용할 수 있다. 질량 분석법에 의한 민감한 검출과 결합된 diGly 펩티드의 효율적인 면역정화는 현재까지 확인된 유비퀴틴화 부위의 수가 크게 증가하였다. 우리는 농축 절차 이전에 펩타이드의 오프라인 높은 pH 역상 분획및 이온 라우팅 멀티폴에 보다 진보된 펩티드 단편화 설정을 포함하는 이 워크플로우를 몇 가지 개선했습니다. 또한, 항체 비드를 보유하기 위해 필터 기반 플러그를 사용하여 시료를 보다 효율적으로 정리하면 diGly 펩티드에 대한 더 큰 특이성을 초래한다. 이러한 개선은 인간 자궁 경부암 세포 (HeLa) 세포에서 23,000 개 이상의 diGly 펩티드의 일상적인 검출을 초래하여 세포에서 프로테아좀 억제에 따라 용해됩니다. 우리는 몇몇 다른 세포 모형및 두뇌 조직과 같은 생체 내 견본의 보편성 프로파일의 심층 분석을 위한 이 전략의 효험을 보여줍니다. 이 연구는 깊은 세포 유비퀴티노메를 밝히기 위해 단백질 유비퀴틴 분석을 위한 도구 상자에 원래 추가된 것을 제시합니다.

서문

단백질에 유비퀴틴의 융합은 프로테아솜에 의한 분해를 표시하고 프로테오스타증에서 중요한 과정입니다. 유비퀴틴의 C 말단 카르복실 그룹은 표적 단백질^1,,2의리신 θ-아미노 기와 이소펩티드 결합을 형성한다. 또한, 유비퀴틴은 다른 유비퀴틴 모듈에 부착될 수 있으며, 이로 인해 균질한(즉, K48 또는 K11) 또는 분기(즉, 이질성 또는 혼합) 폴리유비퀴틴^{구조1,,3의}형성을 초래한다. 유비퀴틴의 가장 잘 알려진 기능은 K48 연결 폴리유비퀴틴에 의해 매개된 프로테소말 분해에서의 역할입니다. 그러나, 모노-뿐만 아니라 polyubiquitination 또한 proteasome에 의한 분해와 무관하게 많은 프로세스에서 역할을 한다는 것이 분명해졌습니다. 예를 들어, K63 연결 체인은 세포 내 인신 매매, 리소좀 분해, 키나아제 신호 및 DNA 손상 반응^4,,5에서비분해적 역할을 합니다. 다른 6개의 연계 유형은 덜 풍부하고 그들의 역할은 여전히 대체로 수수께끼이지만, 세포에서의 기능에 대한 첫 번째 징후가 나타나고 있지만, 주로 링크지 별^검출을가능하게하는 새로운 도구의 개발로 인해 6^,7.

질량 분석법은 프로테오메 분석을 위한 필수 도구가 되었으며, 오늘날 거의 모든 생물학적 공급원으로부터 수천 개의 다른 단백질이 단일 실험에서 확인될 수 있습니다. 복잡성의 추가 층은 단백질 활동을 조절할 수 있는 단백질의 번역 후 수정 (PTM)에 의해 제시됩니다 (예를 들어, 인산화, 메틸화, 아세틸화 및 유비퀴틴화). PTM 베어링 단백질의 대규모 식별은 질량 분석 분야의 개발에 의해 가능하게 되었습니다. PTM을 함유하는 펩티드의 상대적으로 낮은 화학적 분석은 수정되지 않은 펩티드에 비해 기술적 과제를 제시하며, 질량 분석 분석 이전에 는 생화학적 농축 단계가 일반적으로 필요하다. 지난 2년 동안 PTM 분석을 위해 여러 가지 특정 농축 방법이 개발되었습니다.

세포에서 단백질 유비퀴틴화의 다각적인 역할 때문에, 단백질 에 대한 유비퀴틴화 부위의 검출을 위한 분석 방법의 개발에 대한 수요가 매우 크다^8. 질량 분광 방법의 적용은 과일 플라이, 마우스, 인간 및 효모 단백질^{9,,10,,11,,12,,13,,14에서}확인 된 유비퀴틴 화 부위의 수의 폭발로 이어졌다. 주요 단계는 K-θ-GG 잔여 모티프('디글리신' 또는 'diGly'라고도 함)에 대한 항체를 사용하여 펩타이드 수준에서 면역 침전 기반 농축 전략의 개발에 의해 제시되었다. 이들 디글리 펩티드는 프로테아제^{15,,16으로서}트립신을 사용하여 유비퀴틴화 단백질의 소화시 생산된다.

여기서, 우리는 Orbitrap 질량 분광법에 의한 면역 정화 및 후속 검출을 사용하여 diGly 펩티드를 풍부하게 하는 최적화된 워크플로우를 제시합니다. 특히 시료 전처리 및 질량 분석 단계에서 기존 워크플로우의 여러 변형을 조합하여 proteasome로 처리된 HeLa 세포의 단일 샘플에서 23,000개 이상의 diGly 펩타이드를 일상적으로 식별할 수 있습니다. 억제제 및 치료되지 않은 HeLa 세포로부터 ~10,000. 우리는 세포 배양에 있는 아미노산으로 표지되지 않은 안정한 동위원소 표지둘 다에서 용해하기 위하여 이 프로토콜을 적용했습니다 (SILAC) HeLa 세포를 표지하고 두뇌 조직과 같은 내인성 견본에.

이 워크플로우는 깊은 유비퀴티노메를 발견하기 위해 유비퀴틴 사이트를 분석하기 위한 도구의 레퍼토리에 귀중한 추가를 제공합니다. 다음 프로토콜은 워크플로의 모든 단계를 자세히 설명합니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 에라스무스 MC의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(EDC)에 의해 승인되었습니다.

1. 견본 준비

1. 배양 된 세포
   1. 관심 있는 세포주(예: HeLa 또는 골육종 [U2OS] 세포)를 선택하고 10% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS)과 100 단위/mL 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 덜베코의 최소 독수리 배지(DMEM)에서 세포를 성장시다.
   2. 정량적 프로테오믹스 실험의 경우, DMEM의 배양 세포는 아르기닌과 리신이 결여되어 있다. 배지는 10% 투석소 혈청(FBS), 100 단위/mL 페니실린/스트렙토마이신, 알라닌 글루타민으로 보충되어야 합니다. 기존의 리신과 아르기닌('Light' Medium) 또는 리신-8(13C¹³_6)을 ^{추가하여 두 가지 유형의 미디어를 만드십시오. 15}N₂₎및 아르기닌-10⁽¹³C_6; ¹⁵N₄₎('헤비 미디엄') 각각.
   3. 광배지(즉, 표지되지 않은) 및 중형배지(즉, 표지되지 않은 SILAC)에서 세포의 배양 배치를 확장 및 치료 전에 적어도 6배 이상 배배화하여 중형 배양내의 모든 단백질이 무거운 안정동위원소로 표지되도록 한다. 아미노산.
   4. 프로테아좀 억제제 보르테조미브의 10 μM 또는 DMSO의 동등한 부피를 모의 처리로서 8시간 동안 치료한다. PBS로 세포를 세척, 그들을 사용하여 해리 1% 트립신 / EDTA, 세포를 펠릿.
   5. 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트(DOC)를 가진 얼음-차가운 50 mM Tris-HCl(pH=8.2)의 2 mL에서 시험된 조건당 150 cm² 배양판으로부터 세포 펠릿을 분해한다. 용해액을 95°C에서 5분간 끓이고 10분 동안 초음파 처리합니다(재료 표에열거된 초음파 처리기의 경우 "H"를 4°C에서 설정). 우리는 N-에틸 말레미드 (NEM)와 같은 듀비퀴티나제 억제제의 사용을 권장하지 않습니다, 이것은 펩티드 식별을 복잡하게 할 수있는 원치 않는 단백질 수정을 소개 할 수 있기 때문에.
2. 생체 내 마우스 뇌 조직
   1. 생체내 조직을 사용하는 경우, 100 mM Tris-HCl(pH=8.5), 12 mM 나트륨 DOC 및 12 mM 나트륨 N-라우로일사르코시네이트^17을함유하는 얼음-차가운 완충액으로 조직을 용해시낸다. 4 °C에서 10 분 동안 용해 (재료 의 테이블에나열된 초음파 에 대한 "H"설정)에 대한 용해를 4 °C에서 5 분 동안 끓인다.
3. 대색 흡광도 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 총 단백질 량을 정량화합니다. 단백질의 총량은 성공적인 디글리 펩티드 면역 침전(IP)을 위해 적어도 몇 밀리그램이어야 한다. SILAC 실험의 경우 총 단백질 량에 따라 1:1 비율로 가볍고 무거운 표지된 단백질을 혼합합니다.
4. 5 mM1,4-dithiothreitol을 사용하여 50 °C에서 30 분 동안 모든 단백질을 줄이고 그 후 어둠 속에서 15 분 동안 10 mM 요오도 아세타미드로 알킬레이트하십시오. Lys-C(1:200 효소 대 기질 비율)로 단백질 소화를 수행한 다음 30°C 또는 실온(RT)에서 트립신(1:50 효소 대 기질 비율)으로 밤새 소화합니다.
5. 소화된 시료에 트리플루오로아세트산(TFA)을 0.5%의 최종 농도로 추가하고 모든 세제를 침전시키고 제거하기 위해 10,000 x g에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 후속 분획을 위해 펩티드를 함유하는 상상급체를 수집한다.

2. 오프라인 펩타이드 분획

1. 고판기 역상(RP) C18 크로마토그래피를 중합체 고정상 재료(300 Å, 50 μM; 재료 표참조)를 빈 컬럼 카트리지에 적재하여 트립틱 펩타이드를 분별합니다. 고정상 침대 크기는 분별될 단백질 소화량으로 조정되어야 합니다. 0.5 g의 고정상 재료로 채워진 빈 6 mL 컬럼 카트리지(재료 표참조)를 준비하여 ~ 10 mg의 단백질 다이제스트를 준비합니다. 고정상 비율에 단백질 소화는 대략 1:50 (w/w)이어야 합니다.
2. 준비된 컬럼에 펩티드를 로드하고 0.1% TFA의 약 10개의 컬럼 부피로 컬럼을 세척하고, 그 다음에_H2O의 약 10개의 컬럼 부피를 갖는다.
3. 펩티드를 각각 7%, 13.5%, 50% 아세토니트릴(AcN)으로 10 mMM 암모늄 포메이트 용액(pH= 10)의 10개의 컬럼 부피를 가진 3개의 분획으로 용해시. 모든 분수를 완전하게 사용자 지정합니다.
4. 유비퀴틴 잔여 모티프(K-θ-GG) 항체를 사용하여 단백질A아가로즈 비드를 diGly 펩티드의 면역농축에 공액화한다. 구슬의 배치 당 항체의 정확한 양은 독점 정보이며 제조업체에 의해 공개되지 않기 때문에, 혼동을 피하기 위해 제조 업체와 같은 비드 배치에 대해 동일한 정의를 사용하는 것이 좋습니다. 이 비드 의 한 배치를 PBS로 2x로 씻고 비드 슬러리를 6 개의 동일한 분획으로 나눕습니다. 자세한 실험 계획은 그림 1을 참조하십시오.
5. 50 mM MOPS, 10 mM 나트륨 인산염 및 50 mM NaCl (pH = 7.2)으로 구성된 완충액의 2.3 단계에서 수집 된 3 개의 펩티드 분획을 용해시키고 파편을 스핀 다운합니다.
6. 분획물의 상피제를 diGly 항체 비드에 첨가하고 회전기 유닛상에서 4°C에서 2시간 동안 배양한다. 구슬을 스핀 다운하고 상급체를 항체 비드의 신선한 배치로 옮기고 4 °C에서 2 시간 동안 다시 배양합니다.
7. 후속 글로벌 프로테오메(GP) 분석을 위해 상급자를 저장합니다.
8. 구슬을 유지하기 위해 GF/F 필터 플러그가 장착된 200 μL 파이펫 팁으로 모든 분획에서 구슬을 옮김을 전달합니다. 비드와 함께 파이펫 팁을 원심 분리팁 어댑터가 장착된 1.5mL 마이크로원심지 튜브에 넣습니다. 얼음 차가운 IAP 완충액 200 μL로 구슬을 3x 세척하고 그 후 200 μL의 얼음 차가운 밀리Q H₂O. 모든 세척 단계 전에 2 분 동안 200 x g에서 열을 아래로 회전시키지 만 열이 건조하지 않도록주의하십시오. 0.15% TFA의 50 μL의 2 사이클을 사용하여 펩티드를 용해.
9. C18 단계 팁 (본질적으로 2 개의 C18 디스크가있는 200 μL 파이펫 팁)을 사용하여 펩티드를 탈염시키고 진공 원심 분리를 사용하여 완전성을 위해 건조시십시오.

3. 나노 플로우 LC-MS / MS

1. 나노 흐름 LC 시스템에 결합된 민감한 질량 분석기에서 LC-MS/MS 실험을 수행합니다.
2. CSH130 수지(3.5 μm, 130 Å)로 포장된 75 μm 내경을 가진 50cm 반상 열이 있는 사내 포장된 반상 컬럼을 사용하고, 300 nL/min에서 120분 이상 2-28%(AcN, 0.1% FA)의 그라데이션으로 펩티드를 용출할 수 있습니다. 예를 들어 컬럼 오븐을 사용하여 컬럼을 50°C로 유지합니다(재료 표참조).
3. 질량 분석 분석을 수행합니다.
   1. 질량 분석기는 데이터 종속 수집(DDA) 모드에서 작동해야 합니다. MS1 질량 분석기는 Orbitrap 질량 분석기의 경우 자동 게인 제어(AGC) 목표 설정이 4E5이고 최대 주입 시간이 50ms인 고해상도(예: 120,000)로 수집되어야 합니다.
   2. 먼저 "최고 강도 우선" 모드에서 질량 분석 분석을 수행합니다. 이렇게, 가장 강렬한 이온은 조각화를 위해 먼저 선택되고, 그 다음에 두 번째로 높은, 등등, 총 사이클 시간 3초를 가진 최고 속도 방법을 사용한다. 그런 다음 "가장 낮은 강도 첫 번째" 모드에서 두 번째 DDA MS 분석을 수행하여 가장 적은 강도의 이온을 먼저 선택한 다음 두 번째로 낮은 이온을 선택합니다. 이 전략은 매우 낮은 분하 펩티드의 최적의 검출을 보장합니다.
   3. 전하 상태(2-7회 충전) 및 단일 동위원소 피크 할당에 따라 전구체 이온을 필터링합니다. 60s. 4중 대질량 필터로 1.6Th의 폭으로 설정된 펩티드 전구체를 동적으로 심문한 전구체를 제외합니다.
   4. 최대 사출 시간 50ms및 HCD 충돌 에너지 30%로 7E3의 AGC에서 이온 트랩에서 MS2 스펙트럼을 수집합니다.

4. 데이터 분석

1. 안드로메다 검색 엔진^18,,19에기초하여 자유롭게 사용할 수 있는 MaxQuant 소프트웨어 제품군과 같은 적절한 검색 엔진을 사용하여 질량 분석 원시 파일을 분석한다. MaxQuant에서 아래에 표시된 몇 가지 적응이 있는 기본 설정을 선택합니다. 누락 된 절단의 최대 수를 3으로 제기하여 트립신에 효소 특이성을 설정합니다. diGly 잔재 (+114.04 Da), 메티오닌 및 N 말단 아세틸화의 산화를 가변 변형으로 설정하고, 시스테인의 카르바미도메틸화를 고정 된 수정으로 설정합니다.
2. 예를 들어, Uniprot 저장소(https://www.uniprot.org/downloads)와 결합된 Uniprot저장소(https://www.uniprot.org/downloads)에서다운로드한 단백질 서열을 포함하는 FASTA 파일에 대한 데이터베이스 검색을 MaxQuant에서 자동으로 제공하는 표준 공통 오염 데이터베이스와 결합합니다. 거짓 발견 률(FDR)을 1%로 설정하고 수정된(diGly) 펩티드에 대한 최소 점수를 40(기본값)으로 설정합니다. 추가 분석으로부터 C-말단 diGly 변형 된 라이신 잔기로 확인된 펩티드를 배제한다.
3. SILAC 실험 파일의 정량적 분석을 위해 복합성을 "2"로 설정하고 4.2단계를 반복합니다.
4. MaxQuant 소프트웨어 제품군의 Perseus 모듈^20을 사용하여 모든 다운스트림 분석(예: 통계, 유전자 온톨로지 분석)을 수행합니다.

결과

유비퀴틴화 단백질은 단백질이 트립신으로 소화될 때 대상 리신 잔류물 위에 114.04 Da 디글리신 잔재를 남깁니다. 이 모티프에 의한 질량 차이는 질량 분석 실험에서 유비퀴틴화 부위를 명확하게 인식하는 데 사용되었습니다. 여기서 설명하는 전략은 나노흐름 LC-MS/MS에 의한 diGly 펩티드의 농축 및 후속 식별을 위한 최첨단방법(그림 1A)입니다.

토론

여기서 기재된 프로토콜은 배양된 세포 및 생체내 조직과 같은 다양한 생물학적 공급원으로부터의 샘플에 적용되었다. 모든 경우에 우리는 diGly 펩티드의 수천을 확인, 총 단백질 입력 량이 적어도 이었다는 것을 제공 1 mg. 특이적 항체를 이용한 농축은 유비퀴틴화 단백질 또는 diGly 펩티드에 대한 농축 절차가 적용되지 않은 경우 전체 세포 용해물에서 만 100-150 매우 낮은 풍부한 diGly 펩티드만이 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithioerythritol	Sigma-Aldrich	D8255
3M Empore C18 Octadecyl disks	Supelco	66883-U	product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Ammonium formate	Sigma-Aldrich	70221
Bortezomib	UBPbio
CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å	Waters
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	34869
DMEM	ThermoFisher
EASY-nanoLC 1200	ThermoFisher
FBS	Gibco
GF/F filter plug	Whatman	1825-021
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125
Lysine, Arginine	Sigma-Aldrich
Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)	Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC)	Wako Pure Chemicals	129-02541
NanoLC oven	MPI design, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodium salt	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	ThermoFisher
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher / Pierce	23225
PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles	Agilent Technologies	PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit	Cell Signaling Technologies	5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge	Waters	WAT036790	Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	30970
Tris-base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Trypsin, TPCK Treated	ThermoFisher	20233