Détection des sites d’ubiquitination des protéines par l’enrichissement du peptide et la spectrométrie de masse

Résumé

Nous présentons une méthode pour la purification, la détection et l’identification des peptides diGly qui proviennent de protéines ubiquitinées à partir d’échantillons biologiques complexes. La méthode présentée est reproductible, robuste et surpasse les méthodes publiées par rapport au niveau de profondeur de l’analyse ubiquitinome.

Résumé

La modification posttranslationnelle des protéines par la petite ubiquitine protéique est impliquée dans de nombreux événements cellulaires. Après la digestion tryptique des protéines ubiquitinées, les peptides avec un reste de diglycine conjugués au groupe aminé d’epsilon de lysine ('K-'diglycine' ou simplement 'diGly') peuvent être utilisés pour suivre le site original de modification. L’immunopurification efficace des peptides diGly combinés à la détection sensible par spectrométrie de masse a entraîné une augmentation considérable du nombre de sites d’ubiquitination identifiés à jour. Nous avons apporté plusieurs améliorations à ce flux de travail, y compris la fractionnation hors ligne de la phase inverse de pH des peptides avant la procédure d’enrichissement, et l’inclusion de paramètres plus avancés de fragmentation de peptide dans le multipole de routage d’ion. En outre, un nettoyage plus efficace de l’échantillon à l’aide d’un bouchon filtré afin de conserver les perles d’anticorps entraîne une plus grande spécificité pour les peptides diGly. Ces améliorations ont comme conséquence la détection courante de plus de 23.000 peptides diGly des cellules cancéreuses humaines de cervical (HeLa) cellules lysates sur l’inhibition protéasome dans la cellule. Nous montrons l’efficacité de cette stratégie pour une analyse approfondie des profils ubiquitinome de plusieurs types de cellules et d’échantillons in vivo, tels que les tissus cérébraux. Cette étude présente un ajout original à la boîte à outils pour l’analyse d’ubiquitination des protéines pour découvrir l’ubiquitinome cellulaire profond.

Introduction

La conjugaison de l’ubiquitine aux protéines les marque pour la dégradation par le protéasome et est un processus crucial dans la protéostasie. Le groupe carboxyl C-terminal d’ubiquitine forme un lien isopeptide avec le groupe lysine 'amino de la protéine cible^1,2. En outre, l’ubiquitine peut être attachée à d’autres modules d’ubiquitine, résultant en la formation de structures homogènes (c.-à-d., K48 ou K11) ou ramifiées (c.-à-d. hétérogènes ou mixtes) structures de polyubiquitine^1,3. La fonction la plus connue de l’ubiquitine est son rôle dans la dégradation protéasomique, médiée par la polyubiquitine liée à K48. Cependant, il est devenu clair que la mono- ainsi que la polyubiquitination jouent également des rôles dans de nombreux processus qui sont indépendants de la dégradation par le protéasome. Par exemple, les chaînes liées au K63 ont des rôles non dégradants dans le trafic intracellulaire, la dégradation lysosomale, la signalisation de la kinase et la réponse des dommages d’ADN^4,5. Les six autres types de liaison sont moins abondants et leurs rôles sont encore largement énigmatiques, bien que les premières indications sur leurs fonctions dans la cellule émergent, en grande partie en raison du développement de nouveaux outils pour permettre la détection spécifique à la liaison^6,7.

La spectrométrie de masse est devenue un outil indispensable pour les analyses de protéome et de nos jours des milliers de protéines différentes de pratiquement n’importe quelle source biologique peuvent être identifiées dans une seule expérience. Une couche supplémentaire de complexité est présentée par des modifications posttranslationnelles (PTM) de protéines (p. ex., phosphorylation, méthylation, acétylation et ubiquitination) qui peuvent moduler l’activité protéique. L’identification à grande échelle des protéines porteuses de PTM a également été rendue possible par les développements dans le champ de spectrométrie de masse. La stoichiométrie relativement faible des peptides portant des SMPT par rapport à leurs homologues non modifiés présente un défi technique et des étapes d’enrichissement biochimique sont généralement nécessaires avant l’analyse de spectrométrie de masse. Au cours des deux dernières décennies, plusieurs méthodes d’enrichissement spécifiques ont été développées pour l’analyse des MPT.

En raison des rôles multiformes de l’ubiquitination des protéines dans la cellule, il ya une grande demande pour le développement de méthodes analytiques pour la détection des sites d’ubiquitination sur les protéines⁸. L’application de méthodes spectrométriques de masse a conduit à une explosion du nombre de sites d’ubiquitination identifiés dans les protéines de mouche des fruits, souris, humains et levures^{9,10,11,12,13,14}. Une étape majeure a été présentée par le développement de stratégies d’enrichissement basées sur l’immunoprécipitation au niveau du peptide à l’aide d’anticorps dirigés contre le motif de reste K-GG (également appelé «diglycine» ou «diGly»). Ces peptides diGly sont produits sur la digestion des protéines ubiquitinées utilisant la trypsine comme la protéase^15,16.

Ici, nous présentons un flux de travail optimisé pour enrichir les peptides diGly à l’aide de l’immunopurification et de la détection ultérieure par spectrométrie de masse Orbitrap. À l’aide d’une combinaison de plusieurs modifications des flux de travail existants, en particulier dans les étapes de préparation de l’échantillon et de spectrométrie de masse, nous pouvons maintenant identifier systématiquement plus de 23 000 peptides diGly provenant d’un seul échantillon de cellules HeLa traitées avec un protéasome inhibiteur et 10 000 euros provenant de cellules HeLa non traitées. Nous avons appliqué ce protocole aux lysates de l’étiquetage isotopique non étiqueté et stable avec des acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) étiquetés cellules HeLa ainsi que pour des échantillons endogènes tels que le tissu cérébral.

Ce flux de travail présente un ajout précieux au répertoire d’outils pour l’analyse des sites d’ubiquitination afin de découvrir l’ubiquitinome profond. Le protocole suivant décrit en détail toutes les étapes du flux de travail.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (EDC) d’Erasmus MC.

1. Préparation de l’échantillon

1. Cellules cultivées
   1. Sélectionnez une ligne d’intérêt cellulaire (p. ex. cellules HeLa ou ostéosarcome [U2OS]) et faites pousser les cellules du minimal Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco complétées par un sérum bovin foetal inactivé de 10 % et 100 unités/mL pénicilline/streptomycine.
   2. Pour les expériences quantitatives de protéomique, les cellules de culture dans le DMEM manquant d’arginine et de lysine. Le milieu doit être complété par le sérum bovin foetal (FBS) dialysé à 10 %, à 100 unités/mL pénicilline/streptomycine et à l’alanine-glutamine. Faire deux types de supports en ajoutant soit de la lysine conventionnelle et de l’arginine («Light' Medium) ou lysine-8⁽¹³C₆; ¹⁵N₂) et arginine-10 (¹³C₆; ¹⁵N₄) ('Heavy' Medium), respectivement.
   3. Les lots de cellules de culture dans Light Medium (c.-à-d. non étiqueté) et Heavy Medium (c.-à-d. étiquetés, SILAC) pour au moins six doubles avant l’expansion et le traitement pour s’assurer que toutes les protéines de la culture Heavy Medium sont étiquetées avec des isotopes lourds contenant acides aminés.
   4. Traiter les cellules pendant 8 h avec 10 m de bortezomib inhibiteur protéasome ou un volume équivalent de DMSO comme un traitement fictif. Laver les cellules avec PBS, les dissocier à l’aide de 1% trypsin/EDTA, et pelleter les cellules.
   5. Lyse la pastille de cellules d’une plaque de culture de 150 cm² par condition testée dans 2 ml de tris-HCl de 50 mM glacé (pH à 8,2) avec 0,5 % de désoxycholate de sodium (DOC). Faire bouillir le lysate à 95 oC pendant 5 min et sonicate pendant 10 min (réglage "H" pour le sonicateur inscrit dans la Table des Matériaux) à 4 oC. Nous ne recommandons pas l’utilisation d’inhibiteurs de la désubiquitinase tels que N-ethylmaleimide (NEM), parce que cela peut introduire des modifications protéiques indésirables qui peuvent compliquer l’identification peptide.
2. Tissu cérébral de souris in vivo
   1. Lors de l’utilisation du tissu in vivo, lyse le tissu dans un tampon glacé contenant 100 mM Tris-HCl (pH - 8,5), 12 mM de sodium DOC, et 12 mM sodium N-lauroylsarcosinate¹⁷. Sonicate le lysate pendant 10 min (réglage "H" pour le sonicateur inscrit dans la Table des Matériaux) à 4 oC et faire bouillir le lysate pendant 5 min à 95 oC.
3. Quantifier la quantité totale de protéines à l’aide d’un kit d’analyse de protéines BCA d’absorption colorimétrique. La quantité totale de protéines devrait être d’au moins plusieurs milligrammes pour une immunoprécipitation de peptide diGly réussie (IP). Pour les expériences SILAC mélanger les protéines étiquetées légères et lourdes dans un rapport de 1:1 basé sur la quantité totale de protéines.
4. Réduire toutes les protéines à l’aide de 5 mM 1,4-dithiothreitol pendant 30 min à 50 oC et ensuite les alkyler avec 10 mM d’iodoacetamide pendant 15 min dans l’obscurité. Effectuez la digestion des protéines avec Lys-C (rapport enzyme-substrat) pendant 4 h suivi d’une digestion de nuit avec trypsine (rapport enzyme-substrat) à 30 oC ou à température ambiante (RT).
5. Ajouter l’acide trifluorocéacique (TFA) à l’échantillon digéré à une concentration finale de 0,5 % et le centrifugeuse à 10 000 x g pendant 10 min afin de précipiter et d’enlever tout détergent. Recueillir le supernatant contenant les peptides pour fractionnement ultérieur.

2. Fractionnement hors ligne de peptide

1. Utilisez une chromatographie C18 à pH à haute teneur en pH (RP) avec un matériau de phase stationnaire polymérique (300 ' , 50 m; voir Tableau des matériaux) chargé dans une cartouche de colonne vide pour fractionner les peptides tryptiques. La taille du lit de phase stationnaire doit être ajustée à la quantité de protéine digeste pour être fractionnée. Préparer une cartouche vide de colonne de 6 ml (voir Tableau des matériaux)remplie de 0,5 g de matériaux de phase stationnaire pour 10 mg de digestion des protéines. Le rapport de phase de digestion des protéines à la phase stationnaire devrait être d’environ 1:50 (w/w).
2. Chargez les peptides sur la colonne préparée et lavez la colonne avec environ 10 volumes de colonnes de 0,1 % DTT, suivis d’environ 10 volumes de colonnes de H₂O.
3. Elute les peptides en trois fractions avec 10 volumes de colonnes de 10 mm ammonium formate solution (pH - 10) avec 7%, 13,5%, et 50% d’acétonitrile (AcN), respectivement. Lyophiliser toutes les fractions à l’exhaustivité.
4. Utilisez des anticorps de motif résiduif d’ubiquitine (K-GG) conjugués à la protéine A perles d’agarose pour l’immunoenrichment des peptides diGly. Étant donné que la quantité exacte d’anticorps par lot de perles est une information exclusive et non divulguée par le fabricant, il est recommandé d’utiliser la même définition pour un lot de perles que le fabricant afin d’éviter toute confusion. Laver un lot de ces perles 2x avec PBS et diviser la boue de perle en six fractions égales. Voir la figure 1 pour un schéma expérimental détaillé.
5. Dissoudre les trois fractions de peptide recueillies à l’étape 2,3 en 1,4 ml d’un tampon composé de 50 mM MOPS, 10 m de phosphate de sodium et 50 m NaCl (pH - 7,2), et faire tourner les débris.
6. Ajouter les supernatants des fractions aux perles d’anticorps diGly et incuber pendant 2 h à 4 oC sur une unité de rotateur. Baisser les perles et transférer le supernatant dans un nouveau lot de perles d’anticorps et incuber à nouveau pendant 2 h à 4 oC.
7. Stockez les supernatants pour l’analyse ultérieure du protéome mondial (GP).
8. Transférer les perles de chaque fraction dans une pointe de pipette de 200 L équipée d’un bouchon de filtre GF/F pour conserver les perles. Placez la pointe de la pipette avec les perles dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL équipé d’un adaptateur de pointe de centrifugeuse. Laver les perles 3x avec 200 L de tampon IAP glacé et par la suite 3x avec 200 'L de glace-froid milliQ H₂O. Tourner vers le bas de la colonne à 200 x g pendant 2 minutes avant chaque étape de lavage, mais veillez à ne pas laisser la colonne s’épuiser. Elute les peptides en utilisant 2 cycles de 50 L de 0,15% TFA.
9. Desalt les peptides à l’aide d’une pointe d’étape C18 (essentiellement une pointe de pipette de 200 L avec deux disques C18) et les sécher à l’exhaustivité à l’aide de centrifugation sous vide.

3. Nanoflow LC-MS/MS

1. Effectuez des expériences LC-MS/MS sur un spectromètre de masse sensible couplé à un système de nanoflow LC.
2. Utilisez une colonne en phase inversée de 50 cm emballée à l’interne avec un diamètre intérieur de 75 m rempli de résine CSH130 (3,5 m, 130 euros) et elute les peptides avec un gradient de 2 à 28% (AcN, 0,1% FA) sur 120 min à 300 nL/min. Alternativement, utilisez des colonnes LC disponibles dans le commerce avec des propriétés similaires. Gardez la colonne à 50 oC à l’aide d’un four à colonnes, par exemple (voir Tableau des matériaux).
3. Effectuez l’analyse de spectrométrie de masse.
   1. Le spectromètre de masse doit être actionné en mode d’acquisition (DDA) dépendant des données. Les spectres de masse MS1 doivent être collectés à haute résolution (p. ex., 120 000), avec un objectif automatisé de contrôle du gain (AGC) de 4E5 et un délai d’injection maximal de 50 ms en cas de spectromètre de masse Orbitrap.
   2. Effectuez d’abord l’analyse de spectrométrie de masse en mode « Intensité la plus élevée d’abord ». De cette façon, l’ion le plus intense est sélectionné d’abord pour la fragmentation, puis le deuxième plus élevé, et ainsi de suite, en utilisant la méthode de vitesse de pointe avec un temps de cycle total de 3 s. Par la suite, effectuez une deuxième série d’analyse de la SP DDA en mode « Intensité la plus basse d’abord », de sorte que l’ion le moins intense soit sélectionnée d’abord, puis la deuxième plus basse, et ainsi de suite. Cette stratégie assure une détection optimale des peptides d’abundance très faible.
   3. Filtrer les ions précurseurs en fonction de leurs états de charge (2-7 charges) et l’affectation de pointe monoisotopic. Exclure dynamiquement les précurseurs interrogés précédemment pour les précurseurs de peptide de 60 s. Isoler avec un filtre de masse quadrupole réglé sur une largeur de 1,6 Th.
   4. Recueillir des spectres MS2 dans le piège à ions à un AGC de 7E3 avec un temps d’injection maximum de 50 ms et HCD énergie de collision de 30%.

4. Analyse des données

1. Analyser les fichiers bruts spectrométrie de masse à l’aide d’un moteur de recherche approprié tel que la suite logicielle MaxQuant librement disponible basée sur le moteur de recherche Andromède^18,19. Dans MaxQuant, sélectionnez les paramètres par défaut avec quelques adaptations qui sont indiquées ci-dessous. Réglez la spécificité de l’enzyme à la trypsine, avec le nombre maximum de clivages manqués portés à trois. Placez la lysine avec un reste diGly (114,04 Da), oxydation de la méthionine et de l’acétylation N-terminale comme modifications variables, et définissez la carbamidomethylation de la cystéine comme modification fixe.
2. Effectuez des recherches dans les bases de données contre un fichier FASTA contenant des séquences de protéines téléchargées à partir, par exemple, du référentiel Uniprot (https://www.uniprot.org/downloads) combiné à un leurre et à une base de données standard commune sur les contaminants qui est automatiquement fournie par MaxQuant. Définissez le taux de découverte de faux (FDR) à 1 % et fixez le score minimum pour les peptides modifiés (diGly) à 40 (valeur par défaut). Exclure les peptides identifiés avec un résidu de lysine modifié par le C-terminal de façon diGly de l’analyse.
3. Pour l’analyse quantitative des fichiers d’expérience SILAC, définissez la multiplicité à « 2 » et répétez l’étape 4.2.
4. Effectuez toutes les analyses en aval (p. ex., statistiques, analyses d’ontologie des gènes) avec le module^{Persée 20} de la suite logicielle MaxQuant.

Résultats

Les protéines ubiquitinées laissent un reste de diglycine de 114,04 Da sur les résidus de lysine cible lorsque les protéines sont digérées avec de la trypsine. La différence de masse causée par ce motif a été utilisée pour reconnaître sans ambiguïté le site de l’ubiquitination dans une expérience de spectrométrie de masse. La stratégie que nous décrivons ici est une méthode de pointe pour l’enrichissement et l’identification subséquente des peptides diGly par nan...

Discussion

Le protocole décrit ici a été appliqué à des échantillons provenant de diverses sources biologiques, telles que les cellules cultivées et le tissu in vivo. Dans tous les cas, nous avons identifié des milliers de peptides diGly, à condition que la quantité totale d’entrée de protéine était au moins 1 mg. L’enrichissement à l’aide d’anticorps spécifiques est très efficace, étant donné que seulement au plus 100-150 peptides diGly abondants très bas ont été identifiés à partir de lysates cellul...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithioerythritol	Sigma-Aldrich	D8255
3M Empore C18 Octadecyl disks	Supelco	66883-U	product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Ammonium formate	Sigma-Aldrich	70221
Bortezomib	UBPbio
CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å	Waters
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	34869
DMEM	ThermoFisher
EASY-nanoLC 1200	ThermoFisher
FBS	Gibco
GF/F filter plug	Whatman	1825-021
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125
Lysine, Arginine	Sigma-Aldrich
Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)	Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC)	Wako Pure Chemicals	129-02541
NanoLC oven	MPI design, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodium salt	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	ThermoFisher
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher / Pierce	23225
PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles	Agilent Technologies	PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit	Cell Signaling Technologies	5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge	Waters	WAT036790	Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	30970
Tris-base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Trypsin, TPCK Treated	ThermoFisher	20233