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要約

複雑な生体試料から生じるユビキチン化タンパク質を起源とするdiGlyペプチドの精製、検出、同定方法を紹介します。提示された方法は、ユビキチノメ分析の深さのレベルに関して、再現性、堅牢性、および優れたメソッドを上回る。

要約

ユビキチンの小さなタンパク質によるタンパク質の翻訳後修飾は、多くの細胞イベントに関与しています。ユビキチン化タンパク質のトリプティック消化後、リジンのイプシロンアミノ基に結合したデグリシン残骸を有するペプチド('K-ε-diglycine'または単に「diGly」)を使用して、元の改変部位を追跡することができます。質量分析による感度検出と組み合わせたdiGlyペプチドの効率的な免疫精製は、最新のユビキチン化部位の数を大幅に増加させた。濃縮手順の前に、ペプチドのオフライン高pH逆相分画、イオンルーティング多極に、より高度なペプチド断片化設定を含めることなど、このワークフローにいくつかの改良を加えました。また、抗体ビーズを保持するためにフィルタベースのプラグを使用したサンプルのクリーンアップがより効率的に行われるため、diGlyペプチドに対する特異性が高くなります。これらの改善は、ヒト子宮頸癌細胞(HeLa)細胞の細胞リセートから23,000以上のdiGlyペプチドを細胞内のプロテアソーム阻害時に日常的に検出する結果となる。我々は、脳組織などのいくつかの異なる細胞型およびインビボサンプルのユビキチノメプロファイルの詳細な分析のためのこの戦略の有効性を示す。本研究は、深い細胞ユビキチノメを明らかにするためのタンパク質ユビキチン化分析のためのツールボックスにオリジナルの追加を提示します。

概要

ユビキチンからタンパク質への結合は、プロテアソームによる分解を示すものであり、プロテオスタシスにおいて重要なプロセスです。ユビキチンのC末端カルボキシル基は、標的タンパク質11,22のリジンε-アミノ基とイソペプチド結合を形成する。また、ユビキチンは他のユビキチンモジュールに付着することができ、その結果、均質(すなわち、K48またはK11)または分岐(すなわち、不均質または混合)のポリウビキチン構造11、33の形成をもたらす。ユビキチンの最もよく知られた機能は、プロテアソーム分解におけるその役割であり、K48結合ポリウビキチンによって媒介される。しかし、モノ-とポリユビキチン化の両方が、プロテアソームによる分解とは無関係な多くのプロセスにおいて役割を果たしていることも明らかになっている。例えば、K63連結鎖は、細胞内密売、リソソーム分解、キナーゼシグナル伝達、およびDNA損傷応答44,55において非分解的役割を有する。他の6つのリンケージタイプはあまり豊富ではなく、その役割は依然としてほとんど謎めいているが、細胞内のそれらの機能に関する最初の徴候は、主にリンケージ特異的検出66、77を可能にする新しいツールの開発のために出現している。

質量分析はプロテオーム解析に欠かせないツールとなっており、現在では、事実上あらゆる生物学的源から数千種類の異なるタンパク質を1回の実験で同定することができます。複雑さの追加の層は、タンパク質活性を調節することができるタンパク質の翻訳後修飾(PTM)のタンパク質(例えば、リン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化)によって提示される。PTMを含むタンパク質の大規模同定は、質量分析分野の発展によっても可能となっています。PTMを持つペプチドの比較的低い化学測定は、その非修飾の対応物と比較して技術的な課題を提示し、一般的に質量分析の前に生化学的濃縮ステップが必要です。過去20年間、PTMの分析のためにいくつかの異なる特異的な濃縮方法が開発されました。

細胞内のタンパク質ユビキチン化の多面的役割のため、タンパク質8上のユビキチン化部位の検出のための分析方法の開発に大きな需要がある。,質量分析法の適用は、フルーツフライ、マウス、ヒト、および酵母タンパク質,,9、10、11、12、13、1410,中の9同定されたユビキチン化部位の数の爆発に至った。111213主要なステップは、K-ε-GGレムナントモチーフ('diglycine'または「diGly」とも呼ばれる)に対する抗体を用いたペプチドレベルでの免疫沈降ベースの濃縮戦略の開発によって提示された。これらのdiGlyペプチドは、プロテアーゼ15、16,16としてトリプシンを使用してユビキチン化タンパク質の消化時に産生される。

ここでは、眼窩質量分析法による免疫精製とその後の検出を用いて、diGlyペプチドを濃縮するための最適化されたワークフローを提示する。既存のワークフローのいくつかの変更の組み合わせを使用して、特にサンプル調製および質量分析段階で、プロテアソームで処理されたHeLa細胞の単一サンプルから23,000以上のdiGlyペプチドを日常的に同定できるようになりました。阻害剤および、治療されていないHeLa細胞から〜10,000。このプロトコルは、細胞培養中のアミノ酸による標識のない安定同位体(SILAC)のHeLa細胞と脳組織などの内因性サンプルの両方に、このプロトコルを適用しました。

このワークフローは、深いユビキチノメを明らかにするために、ユビキチン化部位の分析のためのツールのレパートリーに貴重な追加を提示します。次のプロトコルは、ワークフローのすべての手順を詳細に説明します。

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、エラスムスMCの制度的動物のケアと使用委員会(EDC)によって承認されています。

1. サンプル準備

  1. 培養細胞
    1. 目的の細胞株(例えば、HeLaまたは骨肉腫[U2OS]細胞)を選択し、10%の熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)および100単位/mLペニシリン/ストレプトマイシンを補ったDulbeccoのミニマルイーグルミディアム(DMEM)の細胞を成長させます。
    2. 定量的プロテオミクス実験の場合、アルギニンおよびリジンを欠いたDMEMの培養細胞。培地は、10%透析ウシ胎児血清(FBS)、100単位/mLペニシリン/ストレプトマイシン、およびアラニン-グルタミンを添加する必要があります。従来のリジンとアルギニン('ライト'ミディアム)またはリジン-8(13C6)のいずれかを加えて、2種類のメディアを作ります。15N2) とアルギニン-10 (13C6;15N4)('ヘビー'ミディアム)、それぞれ。
    3. 軽い媒体(すなわち、標識されていない)および重媒体(すなわち、標識されていない、SILAC)の細胞の培養バッチは、重媒体培養中のすべてのタンパク質が重い安定同位体を含む重い安定同位体で標識されていることを確認するために、拡張および処理前に少なくとも6倍の倍増を行うアミノ酸。
    4. プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブの10μMまたはDMSOの同等の体積を模擬処理として8時間の細胞を処理します。PBSで細胞を洗浄し、1%トリプシン/EDTAを使用して細胞を解約し、細胞をペレット化します。
    5. 2 mLの氷冷50 mM Tris-HCl(pH = 8.2)で0.5%デオキシコール酸ナトリウム(DOC)で試験した条件ごとに1つの150 cm2培養プレートから細胞ペレットをlyseします。95°Cで5分間にライセートを沸騰させ、10分間超音波処理(材料表に記載されている超音波処理器の場合は「H」を設定)4°Cで沸騰させます。N-エチルマレイミド(NEM)などのデビキチナーゼ阻害剤の使用は、ペプチド同定を複雑にする望ましくないタンパク質修飾を導入する可能性があるため、お勧めしません。
  2. インビボマウス脳組織
    1. 生体組織で使用する場合、100 mM Tris-HCl(pH=8.5)、12 mMナトリウムDOC、および12 mMナトリウムN-ラウロイサルコシン酸ナトリウム17を含む氷冷緩衝液中の組織をライスする。4°Cで10分間のライセート(材料表に記載されている超音波処理器の「H」を設定)を超音波処理し、95°Cで5分間煮沸します。
  3. 着色吸光度BCAタンパク質アッセイキットを用いて、全タンパク質量を定量化します。タンパク質の総量は、正常なdiGlyペプチド免疫沈降(IP)のために少なくとも数ミリグラムでなければなりません。SILAC実験では、軽い標識タンパク質と重い標識タンパク質を、総タンパク質量に基づいて1:1の比率で混合します。
  4. 50°Cで30分間5mM 1,4-ジチオスライトを使用してすべてのタンパク質を還元し、その後、暗闇の中で15分間10 mMヨードアセトアセトアミドでアルキル化します。Lys-C(1:200酵素対基質比)でタンパク質消化を4時間行い、続いてトリプシンによる一晩の消化(1:50酵素対基質比)を30°Cまたは室温(RT)で行います。
  5. 消化したサンプルにトリフルオロ酢酸(TFA)を加えて、最終濃度の0.5%にし、遠心分離機を100分間10分間、すべてのg洗剤を沈殿させ、除去します。その後の分画のためにペプチドを含む上清を集める。

2. オフラインペプチド分画

  1. 高pH逆相(RP)C18クロマトグラフィーをポリマー定常相材料(300Å,50 μM;材料表を参照)を空のカラムカートリッジに装填してトリプティックペプチドを分画します。定常相ベッドサイズは、分画されるタンパク質消化量に調整する必要があります。タンパク質消化の約10 mgのために、0.5 gの定常相材料で満たされた空の6 mLカラムカートリッジ(材料表を参照)を準備します。タンパク質の消化と定常相比は約1:50(w/w)である必要があります。
  2. 準備したカラムにペプチドをロードし、約10カラムの体積0.1%TFAで洗浄し、続いてH2Oの約10カラム量を洗浄します。
  3. ペプチドを10mMアンモニウム・フォーマット溶液(pH=10)の10カラム量(pH=10)をそれぞれ7%、13.5%、50%アセトニトリル(AcN)で3つの分数に溶出します。すべての分画を完全に凍結乾燥させます。
  4. ユビキチン残骸モチーフ(K-ε-GG)抗体をタンパク質Aアガロースビーズに結合させ、diGlyペプチドの免疫強化のために使用してください。ビーズのバッチあたりの抗体の正確な量は、独自の情報であり、メーカーによって開示されていないので、混乱を避けるためにメーカーが行うビーズのバッチに同じ定義を使用することをお勧めします。これらのビーズ2xの1つのバッチをPBSで洗浄し、ビーズスラリーを6等分に分割します。実験計画の詳細については、図 1を参照してください。
  5. ステップ2.3で採取した3個のペプチド画分を、50 mM MOPS、10 mMリン酸ナトリウム、および50 mM NaCl(pH=7.2)からなるバッファーの1.4 mLに溶解し、破片をスピンダウンします。
  6. 分画の上澄み物をdiGly抗体ビーズに加え、回転ユニットの4°Cで2時間インキュベートします。ビーズをスピンダウンし、上清を抗体ビーズの新鮮なバッチに移し、4°Cで2時間再びインキュベートします。
  7. その後のグローバルプロテオーム(GP)解析のために上清を保存します。
  8. すべての端数から200 μLピペットチップに、GF/Fフィルタープラグを装着してビーズを保持します。ピペットチップとビーズを入れて、遠心分離機の先端アダプターを装備した1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに入れます。200 μLの氷冷IAPバッファーでビーズ3を洗い、その後200 μLの氷冷ミリQ H2Oで3倍に洗い、洗浄ステップごとに2分間200 x gでカラムをスピンダウンしますが、カラムを乾燥させないように注意してください。0.15%TFAの50 μLの2サイクルを用いてペプチドを溶出する。
  9. C18段チップ(基本的には2枚のC18ディスクを持つ200μLピペットチップ)を使用してペプチドを脱塩し、真空遠心を使用して完全に乾燥させます。

3. ナノフロー LC-MS/MS

  1. ナノフローLCシステムに結合された感度の高い質量分析計でLC-MS/MS実験を行います。
  2. CSH130樹脂(3.5 μm、130 Å)を詰めた75 μmの内径を備えた社内梱包された50cm逆相カラムを使用し、120分以上の勾配を持つペプチドを120 nL/minで溶出します。たとえば、カラムオーブンを使用して列を50°Cに保ちます(資料表を参照)。
  3. 質量分析解析を実行します。
    1. 質量分析計は、データ依存型取得(DDA)モードで動作する必要があります。MS1質量スペクトルは、4E5の自動ゲイン制御(AGC)ターゲット設定とOrbitrap質量分析計の場合の最大射出時間50msの高分解能(例えば、120,000)で収集する必要があります。
    2. まず「最高強度第一」モードで質量分析を行います。このように、最も強いイオンが断片化のために最初に選択され、次に2番目に高いイオンが選択され、合計サイクル時間が3秒の最高速度法を使用します。続いて、「最低強度第一」モードでDDA MS解析の第2ラウンドを実行し、最も強いイオンが最初に選択され、次に2番目の最低イオンが選択されるようにします。この戦略は非常に低いバンドバンタンシーペプチドの最適な検出を保障する。
    3. 前駆体イオンを充電状態(2~7電荷)とモノアイソトピックピーク割り当てに従ってフィルターします。前に尋問された前駆体を動的に除外し、4重極質量フィルタを1.6Thの幅に設定したペプチド前駆体を分離する。
    4. 最大射出時間50 ms、HCD衝突エネルギー30%の7E3のイオントラップでMS2スペクトルを収集します。

4. データ分析

  1. アンドロメダ検索エンジン18、19,19に基づいて自由に利用可能なMaxQuantソフトウェアスイートなどの適切な検索エンジンを使用して、質量分析生ファイルを分析します。MaxQuant で、以下に示すいくつかの適応を使用してデフォルト設定を選択します。トリプシンに酵素特異性を設定し、切断の最大数を3に上げる。リジンをdiGly残骸(+114.04 Da)、メチオニンおよびN末端アセチル化の酸化を可変的な修飾として設定し、システインのカルバミドメチル化を固定修飾として設定する。
  2. たとえば、Uniprot リポジトリ (https://www.uniprot.org/downloads) からダウンロードしたタンパク質配列を含む FASTA ファイルに対して、MaxQuant によって自動的に提供されるおとりと標準的な一般的な汚染物質データベースと組み合わせてデータベース検索を実行します。偽発見率(FDR)を1%に設定し、変更された(diGly)ペプチドの最小スコアを40(デフォルト値)に設定します。さらなる分析からC末端ジグライジン残基で同定されたペプチドを除外する。
  3. SILAC実験ファイルの定量分析では、多重度を「2」に設定し、ステップ4.2を繰り返します。
  4. MaxQuantソフトウェアスイートのペルセウスモジュール20で、すべての下流分析(統計、遺伝子オントロジー分析など)を実行します。

結果

ユビキチン化されたタンパク質は、タンパク質がトリプシンで消化されると、標的リジン残基に114.04ダジグリシン残骸を残します。このモチーフによって引き起こされる質量差は、質量分析実験においてユビキチン化の部位を明確に認識するために用いられた。ここで説明する戦略は、ナノフローLC-MS/MSによるdiGlyペプチドの濃縮とその後の同定のための最先端の方法...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、培養細胞および生体組織などの様々な生物学的源からのサンプルに適用された。すべてのケースで、我々は、総タンパク質入力量が少なくとも1mgであることを提供し、数千のdiGlyペプチドを同定した。ユビキチン化タンパク質またはジグリーペプチドの濃縮手順が適用されていない場合、細胞全体のライセートから同定されたのは、100-150個の非常に低いジグリ?...

開示事項

著者らは利益相反を宣言しない。

謝辞

この作品は、オランダ科学研究機構(NWO)が国家ロードマップの大規模研究施設(プロジェクト番号184.032.201)の一環として資金を提供するオランダ・プロテオミクス・センターのプログラム「プロテインズ・アット・ワーク」の一環です。).

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DithioerythritolSigma-AldrichD8255
3M Empore C18 Octadecyl disksSupelco66883-Uproduct discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Ammonium formateSigma-Aldrich70221
BortezomibUBPbio
CSH130 resin, 3.5 μm, 130 ÅWaters
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich34869
DMEMThermoFisher
EASY-nanoLC 1200ThermoFisher
FBSGibco
GF/F filter plugWhatman1825-021
IodoacetamideSigma-AldrichI6125
Lysine, ArginineSigma-Aldrich
Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC)Wako Pure Chemicals129-02541
NanoLC ovenMPI design, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodium saltSigma-AldrichL-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometerThermoFisher
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher / Pierce23225
PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particlesAgilent TechnologiesPL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) KitCell Signaling Technologies5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac CartridgeWatersWAT036790Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970
Tris-baseSigma-AldrichT6066
Tris-HClSigma-AldrichT5941
Trypsin, TPCK TreatedThermoFisher20233

参考文献

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