Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.

Zusammenfassung

Die posttranslationale Modifikation von Proteinen durch das kleine Protein Ubiquitin ist an vielen zellulären Ereignissen beteiligt. Nach der tryptischen Verdauung von ubiquitinierten Proteinen können Peptide mit einem Diglycin-Rest, die zur Epsilon-Aminogruppe von Lysin ('K-'-Diglycin' oder einfach 'diGly') konjugiert sind, verwendet werden, um die ursprüngliche Modifikationsstelle zurückzuverfolgen. Effiziente Immunreinigung von diGly-Peptiden in Kombination mit sensiblem Nachweis durch Massenspektrometrie hat zu einem enormen Anstieg der Anzahl der bis heute identifizierten Ubiquitinationsstellen geführt. Wir haben einige Verbesserungen an diesem Workflow vorgenommen, einschließlich der Offline-Hoch-pH-Reverse-Phase-Fraktionierung von Peptiden vor dem Anreicherungsverfahren und der Einbeziehung erweiterter Peptidfragmentierungseinstellungen in den Ionen-Routing-Multipol. Außerdem führt eine effizientere Bereinigung der Probe mit einem filterbasierten Stecker, um die Antikörperperlen zu erhalten, zu einer größeren Spezifität für diGly-Peptide. Diese Verbesserungen führen zum routinemäßigen Nachweis von mehr als 23.000 diGly Peptiden aus menschlichen Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa) Zelllysate bei Proteasomenhemmung in der Zelle. Wir zeigen die Wirksamkeit dieser Strategie für die eingehende Analyse der Ubiquitinom-Profile verschiedener Zelltypen und von In-vivo-Proben, wie z. B. Hirngewebe. Diese Studie präsentiert eine originelle Ergänzung der Toolbox für die Protein-Ubiquitinationsanalyse, um das tiefe zelluläre Ubiquitinom aufzudecken.

Einleitung

Die Konjugation von Ubiquitin zu Proteinen kennzeichnet sie für den Abbau durch das Proteasom und ist ein entscheidender Prozess bei der Proteostase. Die C-Terminal-Carboxylgruppe von Ubiquitin bildet eine Isopeptidbindung mit der Lysin-Amino-Gruppe des Zielproteins^1,2. Darüber hinaus kann Ubiquitin an andere Ubiquitin-Module angeschlossen werden, was zur Bildung homogener (d.h. K48 oder K11) oder verzweigter (d.h. heterogener oder gemischter) Polyubiquitinstrukturen^1,3führt. Die bekannteste Funktion von Ubiquitin ist seine Rolle bei der proteasomalen Degradation, vermittelt durch K48-verknüpftes Polyubiquitin. Es ist jedoch klar geworden, dass sowohl Mono- als auch Polyubiquitination in vielen Prozessen eine Rolle spielen, die unabhängig von der Degradierung durch das Proteasom sind. Zum Beispiel haben K63-verknüpfte Ketten nicht abbauende Rollen im intrazellulären Handel, lysosomale Degradation, Kinase-Signalisierung und die Reaktion auf DNA-Schäden^4,5. Die anderen sechs Verknüpfungstypen sind weniger häufig und ihre Rollen sind immer noch weitgehend rätselhaft, obwohl erste Hinweise auf ihre Funktionen in der Zelle entstehen, vor allem aufgrund der Entwicklung neuer Werkzeuge, um eine linkagespezifische Erkennung zu ermöglichen^6,7.

Die Massenspektrometrie ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug für Proteomanalysen geworden und heutzutage können Tausende verschiedener Proteine aus praktisch jeder biologischen Quelle in einem einzigen Experiment identifiziert werden. Eine zusätzliche Komplexitätsschicht wird durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Proteinen (z. B. Phosphorylierung, Methylierung, Acetylierung und Ubiquitination) dargestellt, die die Proteinaktivität modulieren können. Die großflächige Identifizierung von PTM-haltigen Proteinen wurde auch durch Entwicklungen im Bereich der Massenspektrometrie ermöglicht. Die im Vergleich zu ihren unveränderten Gegenstücken relativ geringe Stoichiometrie von Peptiden mit PTMs stellt eine technische Herausforderung dar, und biochemische Anreicherungsschritte sind im Allgemeinen vor der Massenspektrometrieanalyse notwendig. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden verschiedene spezifische Anreicherungsmethoden für die Analyse von PTM entwickelt.

Aufgrund der vielfältigen Rolle der Protein-Ubiquitination in der Zelle besteht eine große Nachfrage nach der Entwicklung von Analysemethoden für den Nachweis von Ubiquitinationsstellen auf Proteinen⁸. Die Anwendung von massenspektrometrischen Methoden hat zu einer Explosion der Anzahl der identifizierten Ubiquitinationsstellen in Fruchtfliegen-, Maus-, Human- und Hefeproteinen^{9,10,11,12,13,14}geführt. Ein wichtiger Schritt wurde durch die Entwicklung von immunititizipationsbasierten Anreicherungsstrategien auf Peptidebene unter Verwendung von Antikörpern gegen das Restmotiv K-A-GG (auch als "Diglycin" oder "diGly" bezeichnet) dargestellt. Diese diGly Peptide werden bei der Verdauung von ubiquitinierten Proteinen mit Trypsin als Protease^15,16produziert.

Hier präsentieren wir einen optimierten Workflow zur Anreicherung von diGly-Peptiden mittels Immunreinigung und anschließender Detektion durch Orbitrap-Massenspektrometrie. Mit einer Kombination mehrerer Modifikationen bestehender Arbeitsabläufe, insbesondere in den Phasen der Probenvorbereitung und Massenspektrometrie, können wir nun routinemäßig mehr als 23.000 diGly-Peptide aus einer einzigen Probe von HeLa-Zellen identifizieren, die mit einem Proteasom behandelt wurden. Inhibitor und 10.000 US-Us-Us-Euro aus unbehandelten HeLa-Zellen. Wir haben dieses Protokoll auf Lysate sowohl aus unbeschrifteten als auch aus stabilen Isotopenkennzeichnungen mit Aminosäuren in der Zellkultur (SILAC) mit HeLa-Kennzeichnung sowie auf endogene Proben wie Hirngewebe angewendet.

Dieser Workflow stellt eine wertvolle Ergänzung zum Repertoire an Werkzeugen für die Analyse von Ubiquitinationsseiten dar, um das tiefe Ubiquitinom aufzudecken. Das folgende Protokoll beschreibt alle Schritte des Workflows im Detail.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (EDC) von Erasmus MC genehmigt.

1. Probenvorbereitung

1. Kultivierte Zellen
   1. Wählen Sie eine Zelllinie von Interesse (z. B. HeLa oder Osteosarkom [U2OS] Zellen) und wachsen die Zellen in Dulbeccos Minimal Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10% Hitze inaktivierten fetalen Rinderserum (FBS) und 100 Einheiten/ml Penicillin/Streptomycin.
   2. Für quantitative Proteomik-Experimente, Kulturzellen in DMEM fehlt Arginin und Lysin. Das Medium muss mit 10% dialysiertem fetalem Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin/Streptomycin und Alanin-Glutamin ergänzt werden. Herstellung von zwei Arten von Medien, indem Sie entweder konventionelles Lysin und Arginin ('Light' Medium) oder Lysin-8 (¹³C₆; ¹⁵N₂) und Arginin-10 (¹³C₆; ¹⁵N₄) (im"Schweren Mittel".
   3. Kulturchargen von Zellen in Light Medium (d.h. unbeschriftet) und Heavy Medium (d. h. mit der Bezeichnung SILAC) für mindestens sechs Verdoppelungen vor der Expansion und Behandlung, um sicherzustellen, dass alle Proteine in der Heavy Medium-Kultur mit schwerem, stabilem Isotop gekennzeichnet sind, das Aminosäuren.
   4. Behandeln Sie die Zellen für 8 h mit 10 'M des Proteasomeninhibitors Bortezomib oder einem entsprechenden Volumen von DMSO als Scheinbehandlung. Waschen Sie die Zellen mit PBS, dissoziieren Sie sie mit 1% Trypsin/EDTA und pellet die Zellen.
   5. Lyse das Zellpellet von einer 150 cm² Kulturplatte pro Zustand getestet in 2 ml eiskalte mM Tris-HCl (pH = 8,2) mit 0,5% Natriumdesoxycholat (DOC). Das Lysat bei 95 °C für 5 min kochen und 10 min beschallen (Einstellung "H" für den in der Materialtabelleaufgeführten Beschallungsgerät) bei 4 °C. Wir empfehlen nicht die Verwendung von Deubiquitinase-Inhibitoren wie N-Ethylmaleimid (NEM), da dies unerwünschte Proteinmodifikationen mit sich bringen kann, die die Peptididentifikation erschweren können.
2. In vivo Maus Hirngewebe
   1. Bei Verwendung von In-vivo-Gewebe das Gewebe in einem eiskalten Puffer mit 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 12 mM Natrium-DOC und 12 mM Natrium N-Lauroylsarcosinat¹⁷. Beschallen Sie das Lysat für 10 min (Einstellung "H" für den in der Materialtabelleaufgeführten Beschallungsmittel) bei 4 °C und kochen Sie das Lysat 5 min bei 95 °C.
3. Quantitieren Sie die gesamte Proteinmenge mit einem farbmetrischen Absorbanz BCA Protein Assay Kit. Die Gesamtmenge des Proteins sollte mindestens mehrere Milligramm für eine erfolgreiche diGly Peptid-Immunpräzipitation (IP) betragen. Für SILAC-Experimente mischen Sie die leichten und schwer beschrifteten Proteine in einem Verhältnis von 1:1, basierend auf der Gesamtproteinmenge.
4. Reduzieren Sie alle Proteine mit 5 mM 1,4-Dithiothreitol 30 min bei 50 °C und alkylieren Sie sie anschließend mit 10 mM Iodoacetamid 15 min im Dunkeln. Durchführung der Proteinverdauung mit Lys-C (1:200 Enzym-Substrat-Verhältnis) für 4 h, gefolgt von einer nächtlichen Verdauung mit Trypsin (1:50 Enzym-Substrat-Verhältnis) bei 30 °C oder bei Raumtemperatur (RT).
5. Trifluoressigsäure (TFA) der verdauten Probe auf eine Endkonzentration von 0,5 % und Zentrifugieren Sie die Probe 10 min bei 10.000 x g, um alle Reinigungsmittel auszufällen und zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand, der die Peptide für die nachfolgende Fraktionierung enthält.

2. Offline-Peptidfraktionierung

1. Verwenden Sie die Hoch-pH-Reverse-Phase (RP) C18-Chromatographie mit polymerem stationärem Phasenmaterial (300 , 50 M; siehe Materialtabelle),die in eine leere Säulenpatrone geladen werden, um die tryptischen Peptide zu fraktionieren. Die stationäre Phasenbettgröße muss an die Menge des zu fraktionierenden Proteinverdaus angepasst werden. Bereiten Sie eine leere 6 ml-Säulenpatrone (siehe Materialtabelle) vor, die mit 0,5 g stationärem Phasenmaterial für 10 mg Protein-Digest gefüllt ist. Das Protein-Digest-zu-stationärePhase-Verhältnis sollte ca. 1:50 (w/w) betragen.
2. Laden Sie die Peptide auf die vorbereitete Säule und waschen Sie die Säule mit ca. 10 Spaltenvolumen von 0,1% TFA, gefolgt von ca. 10 Spaltenvolumen von H₂O.
3. Elute die Peptide in drei Fraktionen mit 10 Spaltenvolumen von 10 mM Ammoniumformatlösung (pH = 10) mit 7%, 13,5% bzw. 50% Acetonitril (AcN). Lyophilisieren Sie alle Fraktionen bis zur Vollständigkeit.
4. Verwenden Sie Ubiquitin-Restmotiv (K---GG) Antikörper, die mit Protein A Agarose-Perlen konjugiert sind, um diGly Peptide immunanreichert zu werden. Da die genaue Menge an Antikörpern pro Charge von Perlen proprietäre Informationen ist und nicht vom Hersteller offengelegt wird, wird empfohlen, die gleiche Definition für eine Charge von Perlen wie der Hersteller zu verwenden, um Verwechslungen zu vermeiden. Waschen Sie eine Charge dieser Perlen 2x mit PBS und teilen Sie die Perlenschlämme in sechs gleiche Fraktionen. Siehe Abbildung 1 für ein detailliertes Versuchsschema.
5. Lösen Sie die drei Peptidfraktionen, die in Schritt 2,3 in 1,4 ml eines Puffers aus 50 mM MOPS, 10 mM Natriumphosphat und 50 mM NaCl (pH = 7,2) gesammelt wurden, auf und drehen Sie die Trümmer herunter.
6. Die Überräube der Fraktionen zu den diGly-Antikörperperlen geben und 2 h bei 4 °C auf einer Rotatoreinheit brüten. Die Perlen abdrehen und den Überstand auf eine frische Charge von Antikörperperlen übertragen und bei 4 °C wieder für 2 h brüten.
7. Speichern Sie die Überstande für die nachfolgende globale Proteom-Analyse (GP).
8. Übertragen Sie die Perlen aus jeder Fraktion in eine 200-L-Pipettespitze, die mit einem GF/F-Filterstecker ausgestattet ist, um die Perlen zu halten. Legen Sie die Pipettenspitze mit den Perlen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit zentrifugenspitzen Adapter. Waschen Sie die Perlen 3x mit 200 l eiskalten IAP-Puffer und anschließend 3x mit 200 l eiskaltem MilliQ H₂O. Drehen Sie die Säule vor jedem Waschschritt 2 min bei 200 x g nach unten, aber achten Sie darauf, die Säule nicht trocken laufen zu lassen. Elute die Peptide mit 2 Zyklen von 50 l von 0,15% TFA.
9. Die Peptide mit einer C18-Stufenspitze (im Wesentlichen eine 200-L-Pipettespitze mit zwei C18-Scheiben) zu trocknen und mit Vakuumzentrifugation auf Vollständigkeit zu trocknen.

3. Nanoflow LC-MS/MS

1. Führen Sie LC-MS/MS-Experimente an einem empfindlichen Massenspektrometer durch, das an ein Nanoflow-LC-System gekoppelt ist.
2. Verwenden Sie eine hauseigene, verpackte 50 cm-Umkehrphasensäule mit einem 75 m Innendurchmesser, verpackt mit CSH130-Harz (3,5 m, 130 , ) und verwenden Sie die Peptide mit einem Gradienten von 2 bis 28 % (AcN, 0,1% FA) über 120 min bei 300 nL/min. Alternativ können Sie handelsübliche LC-Säulen mit ähnlichen Eigenschaften verwenden. Halten Sie die Säule z. B. mit einem Säulenofen bei 50 °C (siehe Materialtabelle).
3. Führen Sie die Massenspektrometrieanalyse durch.
   1. Das Massenspektrometer muss im datenabhängigen Erfassungsmodus (DDA) betrieben werden. MS1-Massenspektren sollten mit hoher Auflösung (z. B. 120.000) mit einer automatisierten Gain Control (AGC) Zieleinstellung von 4E5 und einer maximalen Injektionszeit von 50 ms bei einem Orbitrap-Massenspektrometer gesammelt werden.
   2. Führen Sie zuerst die Massenspektrometrieanalyse im Modus "Höchste Intensität zuerst" durch. Auf diese Weise wird das intensivste Ion zuerst für die Fragmentierung ausgewählt, dann das zweithöchste usw., mit der Höchstgeschwindigkeitsmethode mit einer Gesamtzykluszeit von 3 s. Führen Sie anschließend eine zweite Runde der DDA MS-Analyse im Modus "Niedrigste Intensität zuerst" durch, sodass zuerst das am wenigsten intensive Ionen ausgewählt wird, dann die zweitniedrigste usw. Diese Strategie gewährleistet eine optimale Erkennung von Peptiden mit sehr geringem Abstrich.
   3. Filtern Sie die Vorläuferionen nach ihren Ladungszuständen (2-7 Ladungen) und monoisotopischer Spitzenzuweisung. Ausschließen sie zuvor verhörte Vorläufer dynamisch für 60 s. Isolieren Sie Peptid-Vorläufer mit einem Quadrupol-Massenfilter, der auf eine Breite von 1,6 Th eingestellt ist.
   4. Sammeln Sie MS2-Spektren in der Ionenfalle bei einem AGC von 7E3 mit einer maximalen Einspritzzeit von 50 ms und einer HCD-Kollisionsenergie von 30 %.

4. Datenanalyse

1. Analysieren Sie die Massenspektrometrie-Rohdateien mit einer geeigneten Suchmaschine wie der frei verfügbaren MaxQuant Software-Suite basierend auf der Andromeda Suchmaschine^18,19. Wählen Sie in MaxQuant die Standardeinstellungen mit einigen Anpassungen aus, die unten angezeigt werden. Stellen Sie die Enzymspezifität auf Trypsin fest, wobei die maximale Anzahl der verpassten Spaltungen auf drei erhöht wird. Lysin mit einem diGly-Überrest (+114.04 Da), Oxidation von Methionin und N-terminaler Acetylierung als variable Modifikationen einstellen und Carbamidomethylierung von Cystein als feste Modifikation einstellen.
2. Führen Sie Datenbanksuchen anhand einer FASTA-Datei durch, die Proteinsequenzen enthält, die beispielsweise aus dem Uniprot-Repository (https://www.uniprot.org/downloads)in Kombination mit einem Lockvogel und einer gemeinsamen Standarddatenbank für Verunreinigungen heruntergeladen wurden, die automatisch von MaxQuant bereitgestellt wird. Legen Sie die false discovery rate (FDR) auf 1% und die Mindestpunktzahl für modifizierte (diGly) Peptide auf 40 (Standardwert) fest. Peptide, die mit einem C-Terminal diGly modifizierten Lysinrückstand identifiziert wurden, von der weiteren Analyse ausausschließen.
3. Für die quantitative Analyse von SILAC-Experimentdateien legen Sie die Multiplizität auf "2" und Schritt 4.2 zu wiederholen.
4. Führen Sie alle nachgelagerten Analysen (z.B. Statistiken, Genontologieanalysen) mit dem Perseus Modul²⁰ der MaxQuant Software-Suite durch.

Ergebnisse

Ubiquitinierte Proteine hinterlassen einen 114,04 Da-Diglycin-Rest auf dem Ziellysin-Rückstand, wenn die Proteine mit Trypsin verdaut werden. Der durch dieses Motiv verursachte Massenunterschied wurde verwendet, um den Ort der Ubiquitination in einem Massenspektrometrieexperiment eindeutig zu erkennen. Die Strategie, die wir hier beschreiben, ist eine hochmoderne Methode zur Anreicherung und anschließenden Identifizierung von diGly Peptiden durch Nanoflow LC-MS/MS (...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll wurde auf Proben aus verschiedenen biologischen Quellen angewendet, wie z. B. kultivierte Zellen und In-vivo-Gewebe. In allen Fällen identifizierten wir Tausende von DIGly-Peptiden, vorausgesetzt, dass die Gesamteinmenge des Proteineinsatzes mindestens 1 mg betrug. Die Anreicherung mit spezifischen Antikörpern ist hocheffizient, da höchstens 100-150 sehr geringe diGly-Peptide aus ganzen Zelllysaten identifiziert wurden, wenn keine Anreicherungsverfahren für ubiquitinierte Proteine oder...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithioerythritol	Sigma-Aldrich	D8255
3M Empore C18 Octadecyl disks	Supelco	66883-U	product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Ammonium formate	Sigma-Aldrich	70221
Bortezomib	UBPbio
CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å	Waters
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	34869
DMEM	ThermoFisher
EASY-nanoLC 1200	ThermoFisher
FBS	Gibco
GF/F filter plug	Whatman	1825-021
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125
Lysine, Arginine	Sigma-Aldrich
Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)	Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC)	Wako Pure Chemicals	129-02541
NanoLC oven	MPI design, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodium salt	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	ThermoFisher
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher / Pierce	23225
PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles	Agilent Technologies	PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit	Cell Signaling Technologies	5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge	Waters	WAT036790	Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	30970
Tris-base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Trypsin, TPCK Treated	ThermoFisher	20233