通过肽浓缩和质谱检测蛋白质泛化位点检测

摘要

我们提出了一种从复杂生物样本中泛化的蛋白质中产生的二Gly肽的纯化、检测和鉴定方法。在泛源分析的深度级别方面，该方法具有可重复性、健壮性，优于已发布的方法。

摘要

小蛋白泛蛋白对蛋白质的翻译后修饰涉及许多细胞事件。在尝试消化泛化蛋白后，肽与裂解性菌体残留物结合到裂解酶的epsilon氨基酸组（"K-+-diglyin"或简称"diGly"）可用于追踪原始修饰部位。二甘肽的有效免疫纯化与质谱的敏感检测相结合，导致迄今发现的泛化位点数量大幅增加。我们对此工作流进行了多项改进，包括在浓缩过程之前对肽进行离线高 pH 反向相分馏，以及将更高级的肽碎片设置包含在电子路由多极中。此外，使用基于过滤器的插头更有效地清理样品，以保留抗体珠子，从而对二Gly肽产生更大的特异性。这些改进导致在细胞中的蛋白酶体抑制下，从人类子宫颈癌细胞（HeLa）细胞裂化物中常规检测23，000多二格脂肽。我们展示了此策略对几种不同细胞类型和体内样本（如脑组织）的泛素谱的深入分析的功效。本研究为蛋白质泛化分析的工具箱提供了原始添加内容，以揭示深层细胞泛化。

引言

泛蛋白与蛋白质的结合标志着蛋白酶体降解，是蛋白酶病的关键过程。泛素的C端卡博基组与目标蛋白^11、22的裂氨酸-氨基组形成等肽键。此外，泛素可以附着在其他泛素模块上，导致形成均匀（即K48或K11）或分支（即异质或混合）聚氨基金结构^11、3。3泛蛋白的最广为人知的功能是它在蛋白酶体降解中的作用，由K48链接的多聚丙酮介导。然而，很明显，单一和多聚二化在许多独立于蛋白酶体降解的过程中也扮演着角色。例如，K63相关链在细胞内贩运、肌营养不良退化、激酶信号和DNA损伤反应^44、55等具有非降解作用。其他六种链接类型较少，它们的作用仍然在很大程度上是神秘的，尽管关于它们在细胞中功能的最初迹象正在出现，这主要是因为开发了新工具，使链接特定的检测^66，7。7

质谱法已成为蛋白质组分析不可或缺的工具，如今，几乎任何生物来源的数千种不同的蛋白质都可以在单个实验中被识别。蛋白质（例如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛化）的翻译后修饰（如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛化）又提出了一层复杂性，这些蛋白质可以调节蛋白质活性。大规模识别PTM轴承蛋白也通过质谱学领域的发展成为可能。与未修改的肽相比，携带PTM的肽的渗透量相对较低，这带来了技术挑战，在质谱分析之前，一般需要生化浓缩步骤。在过去二十年中，为分析PTM开发了几种不同的具体浓缩方法。

由于蛋白质泛化在细胞中的多方面作用，因此对开发分析方法以检测蛋白质⁸的泛化位点有很大的需求。质谱方法的应用，导致果蝇、小鼠、^,人类和酵母蛋白^{9、10、11、12、13、1410,11}中已识别的⁹泛化位点数量激增。^12,13,14在肽水平上开发基于免疫沉淀的浓缩策略，利用针对K-+-GG残余图案的抗体（也称为"diglycine"或"diGly"）提出了一个重大步骤。这些二甘肽是在消化泛化蛋白时产生的，使用胰蛋白酶作为蛋白酶^{15，16。15,}

在这里，我们提出了一个优化的工作流程，以丰富使用免疫纯化和Orbitrap质谱检测的二Gly肽。结合现有工作流程的多项修改，特别是在样品制备和质谱阶段，我们现在可以从用蛋白酶体处理的HeLa细胞单个样本中常规识别超过 23，000 个二Gly 肽未经治疗的HeLa细胞的抑制剂和±10，000。我们应用了该协议，从未标记和稳定的同位素标签与氨基酸在细胞培养（SILAC）标记HeLa细胞，以及内源性样本，如脑组织。

此工作流为分析无所不在位点以揭示深层泛化值的工具系列提供了宝贵的补充。以下协议详细介绍了工作流的所有步骤。

研究方案

此处描述的所有方法均已获得伊拉斯谟 MC 机构动物护理和使用委员会 （EDC） 的批准。

1. 样品制备

1. 培养细胞
   1. 选择感兴趣的细胞系（例如，HeLa或骨肉瘤[U2OS]细胞），并在Dulbecco的最小鹰中（DMEM）中生长细胞，并辅以10%热灭活胎儿牛血清（FBS）和100单位/mL青霉素/链霉素。
   2. 对于定量蛋白质组学实验，DMEM中的培养细胞缺乏精氨酸和莱氨酸。该介质必须补充10%分解胎儿牛血清（FBS）、100单位/mL青霉素/链霉素和丙氨酸谷氨酰胺。通过添加传统的莱氨酸和精氨酸（"光"介质）或莱氨酸^-8（13C_6;¹⁵N₂） 和精氨酸-10 （¹³C₆;¹⁵N₄） （"重"中等），分别。
   3. 在膨胀和处理之前，在轻介质（即未标记）和重介质（即标记，SILAC）中培养细胞分批至少增加六倍，以确保重介质培养中的所有蛋白质都标有含有重稳定同位素的标记氨基酸。
   4. 用10μM的蛋白酶体抑制剂bortezomib或同等体积的DMSO将细胞治疗8小时，作为模拟治疗。用PBS清洗细胞，用1%的胰蛋白酶/EDTA分离细胞，并颗粒细胞。
   5. 根据在2 mL冰冷50 mM Tris-HCl（pH = 8.2）中测试的150 cm²培养板中的细胞颗粒，以及0.5%脱氧酸钠（DOC）。在95°C下将水化水化，5分钟，在4°C下为材料表中列出的声波器设置"H"10分钟。我们不建议使用二乙酰胺酶抑制剂，如N-乙酰胺（NEM），因为这可能会引入不需要的蛋白质修饰，使肽的识别复杂化。
2. 体内小鼠脑组织
   1. 在体内组织中使用时，在含有100 mM Tris-HCl的冰冷缓冲液中lys组织（pH = 8.5）、12 mM DOC钠和12 mM钠N-劳罗伊尔沙氨酸^17。在4°C下将水化酶声波10分钟（为材料表中列出的声波器设置"H"），并在95°C下将水化物煮5分钟。
3. 使用色度吸收 BCA 蛋白质测定试剂盒对总蛋白质量进行定量。蛋白质的总量应至少为几毫克，以成功进行二甘肽免疫沉淀（IP）。对于SILAC实验，根据总蛋白质量，将轻和重标记的蛋白质以1:1的比例混合。
4. 在50°C下，使用5 mM 1，4-二硫硫醇醇减少所有蛋白质30分钟，然后在黑暗中用10mM碘酰胺烷状物15分钟。使用 Lys-C（1:200 酶基底比）进行蛋白质消化 4 小时，然后在 30°C 或室温 （RT） 下用胰蛋白素（1:50 酶基底比）进行隔夜消化。
5. 将三氟乙酸 （TFA） 添加到消化的样品中，最终浓度为 0.5%，并将样品在 10，000 x g下离心 10 分钟，以便沉淀并去除所有洗涤剂。收集含有肽的上清剂，以便随后进行分馏。

2. 离线肽分馏

1. 使用高pH反向相 （RP） C18 色谱与聚合物固定相材料 （300°， 50 μM; 参见材料表） 加载到空柱盒中，以分馏锥形肽。固定相床大小必须调整到要分馏的蛋白质消化量。准备一个空的6 mL柱盒（见材料表），填充0.5克固定相材料，用于10毫克蛋白质消化。蛋白质消化到固定相比应约为1:50（w/w）。
2. 将肽加载到准备好的柱上，用大约 10 列卷 0.1% TFA 清洗列，然后将大约 10 列卷 H₂O 清洗。
3. 将肽分成三个分数，10列体积为10mM铵酯溶液（pH = 10），分别具有7%、13.5%和50%的醋酸（AcN）。将所有分数都归为完整。
4. 使用泛素残留图案（K-+-GG）抗体与蛋白质A琼玫瑰珠结合，以免疫富集二甘肽。由于每批珠子的抗体的确切量是专有信息，制造商不会披露，因此建议对一批珠子使用与制造商相同的定义，以避免混淆。用PBS洗涤一批这些珠子2倍，并将珠浆分成六个相等的分数。有关详细的实验方案，请参阅图 1。
5. 溶解在步骤 2.3 中收集的三个肽分数，该缓冲液由 50 mM MOPS、10 mM 磷酸钠和 50 mM NaCl（pH = 7.2）组成，在 1.4 mL 中收集，然后旋转碎屑。
6. 将分数的超钠添加到二Gly抗体珠子中，并在旋转器单元上以4°C孵育2小时。向下旋转珠子，将上清液转移到一批新鲜抗体珠，并在4°C下再次孵育2小时。
7. 存储超子体，以便进行后续全局蛋白体 （GP） 分析。
8. 将珠子从每一个馏分转移到200μL移液器尖端，并配有GF/F过滤器插头以保留珠子。将带珠子的移液器尖端放入配备离心尖端适配器的 1.5 mL 微离心管中。用 200 μL 的冷 IAP 缓冲液清洗珠 3x，然后用 200 μL 的冷毫Q H₂O 进行 3g倍的冲下柱，每次洗涤步骤前旋转 2 分钟，但请注意不要让柱运行干燥。使用 2 个周期 50 μL 0.15% TFA 来刺激肽。
9. 使用 C18 级尖端（本质上是带有两个 C18 盘的 200 μL 移液器尖端）对肽进行脱盐，并用真空离心将其干燥成完全。

3. 纳米流 LC-MS/MS

1. 在与纳米流LC系统耦合的敏感质谱仪上执行LC-MS/MS实验。
2. 使用内部包装的50厘米反向相柱，内径为75μm，包装有CSH130树脂（3.5μm，130°），在300 nL/min下，将梯度为2~28%（AcN，0.1%FA）的肽在120分钟以上。例如，使用柱烤箱将列保持在 50°C 处（参见材料表）。
3. 执行质谱分析。
   1. 质谱仪必须在数据依赖采集 （DDA） 模式下运行。MS1 质谱应以高分辨率（例如 120，000）收集，自动增益控制 （AGC） 目标设置为 4E5，在 Orbitrap 质谱仪的情况下，最大喷射时间为 50 毫秒。
   2. 首先在"最高强度第一"模式下执行质谱分析。这样，最强烈的ion首先选择碎片，然后第二高，等等，使用总循环时间为3秒的最高时速方法。随后，在"最低强度优先"模式下执行第二轮 DDA MS 分析，以便首先选择强度最小的 ion，然后选择第二个最低度，依此类推。此策略可确保对极低的捆绑肽进行最佳检测。
   3. 根据前体离子的电荷状态（2-7 电荷）和单同位素峰值分配进行过滤。将先前询问的前体动态排除为60 s. 分离肽前体与四极波质量过滤器设置为宽度为1.6Th。
   4. 在 7E3 AGC 的电子陷阱中收集 MS2 光谱，最大喷射时间为 50 ms，HCD 碰撞能量为 30%。

4. 数据分析

1. 使用适当的搜索引擎分析质谱原始文件，例如基于仙女座搜索引擎^18，19,19的免费可用的MaxQuant软件套件。在 MaxQuant 中，选择具有下面指示的一些自适应的默认设置。将酶特异性设置为胰蛋白酶，将缺失的裂解的最大数量提高到三个。将二甘菊残留物（+114.04 Da）的莱氨酸、蛋氨酸氧化和N端乙酰化作为可变修饰，并将半胱氨酸的卡酰胺甲基化作为固定修饰。
2. 对从 Uniprot 存储库（https://www.uniprot.org/downloads）下载的蛋白质序列的 FASTA 文件执行数据库搜索，并结合 MaxQuant 自动提供的诱饵和标准常见污染物数据库。将错误发现率 （FDR） 设置为 1%，并将已修改（二格里）肽的最小分数设置为 40（默认值）。从进一步分析中排除与C端二Gly改性裂二蛋白残留物一起识别的肽。
3. 对于SILAC实验文件的定量分析，将多重性设置为"2"，重复步骤4.2。
4. 使用 MaxQuant 软件套件的 Perseus 模块²⁰执行所有下游分析（例如统计、基因本体分析）。

结果

当蛋白质用胰蛋白酶消化时，泛化蛋白在目标莱氨酸残留物上留下114.04 Da diglycine残留物。这个图案引起的质量差异用于在质谱实验中明确识别泛化位点。我们在这里描述的策略是一种最先进的方法，用于通过纳米流LC-MS/MS浓缩和随后识别二甘肽（图1A）。在这项研究中，培养细胞和体内物质都被用作蛋白质的生物来源，但该协议与任何蛋...

讨论

此处描述的协议适用于各种生物来源的样本，如培养细胞和体内组织。在所有情况下，我们确定了数千个二甘肽，前提是蛋白质总输入量至少为1毫克。使用特定抗体的富集效率很高，因为如果不应用泛化蛋白或二甘肽的浓缩程序，则从全细胞裂解物中最多只能发现100-150个非常低的多脂二甘肽。显然，敏感的质谱是获得大量二Gly鉴定的先决条件。尽管我们已经成功地使用了几种不同的质谱仪，但?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithioerythritol	Sigma-Aldrich	D8255
3M Empore C18 Octadecyl disks	Supelco	66883-U	product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Ammonium formate	Sigma-Aldrich	70221
Bortezomib	UBPbio
CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å	Waters
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	34869
DMEM	ThermoFisher
EASY-nanoLC 1200	ThermoFisher
FBS	Gibco
GF/F filter plug	Whatman	1825-021
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125
Lysine, Arginine	Sigma-Aldrich
Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)	Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC)	Wako Pure Chemicals	129-02541
NanoLC oven	MPI design, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodium salt	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	ThermoFisher
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher / Pierce	23225
PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles	Agilent Technologies	PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit	Cell Signaling Technologies	5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge	Waters	WAT036790	Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	30970
Tris-base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Trypsin, TPCK Treated	ThermoFisher	20233