JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем метод очистки, обнаружения и идентификации диглы пептидов, которые происходят из убиквитинаированных белков из сложных биологических образцов. Представленный метод воспроизводим, надежен и превосходит опубликованные методы по уровню глубины анализа убикитиномы.

Аннотация

Постпереводная модификация белков мелким белком убиквитин участвует во многих клеточных событиях. После триптического переваривания убиквитированных белков, пептиды с остатками диглицина, спряченные с группой аминокислот эпсилона ('K---дигизина или просто 'diGly') могут быть использованы для отслеживания первоначального места модификации. Эффективная иммуноочищенность дигли пептидов в сочетании с чувствительным обнаружением масс-спектрометрией привела к значительному увеличению числа выявленных на сегодняшний день участков убиквитинации. Мы внесли ряд улучшений в этот рабочий процесс, в том числе в автономном режиме высокой рН обратной фазы фракции пептидов до процедуры обогащения, а также включение более продвинутых параметров фрагментации пептида в ионную размыва. Кроме того, более эффективная очистка образца с помощью фильтра на основе штепсельной вилки для того, чтобы сохранить бусы антитела приводит к большей специфичности для диGly пептидов. Эти улучшения приводят к регулярному обнаружению более 23000 диглы пептидов из клеток рака шейки матки человека (HeLa) клеточные лисаты на протеасомы ингибирование в клетке. Мы показываем эффективность этой стратегии для углубленного анализа профилей убикитиномы нескольких различных типов клеток и образцов in vivo, таких как ткани мозга. Это исследование представляет собой оригинальное дополнение к инструментарию для анализа убиквитинации белка, чтобы раскрыть глубокий клеточный убикитино.

Введение

Спряжение убиквитина к белкам знаменует их для деградации протеасомы и является решающим процессом в протеостазе. C-терминал carboxyl группа убиквитина образует изопептид связи с лизином и амино группы целевого белка1,2. Кроме того, убиквитин может быть прикреплен к другим модулям побиквитина, что приводит к образованию однородных (т.е. K48 или K11) или разветвленных (т.е. неоднородных или смешанных) поликубиквитовых структур1,3. Наиболее известной функцией убиквитин является его роль в протеасомальной деградации, при посредничестве K48-связанных полиубиквитин. Тем не менее, стало ясно, что как моно-, так и полиубичицинация также играют роль во многих процессах, которые не зависят от деградации протеасомы. Например, цепи, связанные с K63, играют недеградную роль во внутриклеточной торговле, лисосомальной деградации, сигнализации киназы и ответе повреждения ДНК4,,5. Другие шесть типов связей менее обильные и их роли по-прежнему в значительной степени загадочные, хотя первые указания об их функциях в ячейке появляются, в основном из-за разработки новых инструментов для обеспечения связи конкретных обнаружения6,7.

Масс-спектрометрия стала незаменимым инструментом для анализа протеомов, и в настоящее время тысячи различных белков практически из любого биологического источника могут быть идентифицированы в одном эксперименте. Дополнительный уровень сложности представлен постпереводными модификациями (ПТМ) белков (например, фосфорилированием, метилированием, ацетилированием и убиквитинированием), которые могут модулировать белковую активность. Крупномасштабная идентификация PTM-несущих белков также стала возможной благодаря изменениям в области масс-спектрометрии. Относительно низкая стойчиометрия пептидов, несущих ПТМ по сравнению с их неизмененными аналогами, представляет собой техническую проблему, и шаги биохимического обогащения, как правило, необходимы до анализа масс-спектрометрии. За последние два десятилетия для анализа ПТМ было разработано несколько различных конкретных методов обогащения.

Из-за многогранной роли убиквитина белка в клетке, существует большой спрос на разработку аналитических методов для обнаружения мест убиквитина на белках8. Применение масс-спектрометрических методов привело к взрыву числа выявленных мест убиквитинации в плодовой мухе, мыши, человеческих и дрожжевых белках99,10,,11,,12,,13,14. Важным шагом стала разработка стратегий обогащения на основе иммунопрецидации на уровне пептида с использованием антител, направленных против остатков мотива K-A-GG (также называемого «диглицином» или «дигли»). Эти диглы пептиды производятся при переваривании убиквитинаированных белков с помощью трипсина в качестве протеаза15,16.

Здесь мы представляем оптимизированный рабочий процесс для обогащения диглы пептидов с помощью иммуноочищенности и последующего обнаружения масс-спектрометрией Orbitrap. Используя комбинацию нескольких модификаций существующих рабочих процессов, особенно на этапах подготовки образцов и масс-спектрометрии, мы можем регулярно идентифицировать более 23 000 пептидов диГлли из одного образца клеток HeLa, обработанных протеасомой ингибитор и 10 000 фунтов от необработанных клеток HeLa. Мы применили этот протокол к лисатам как от немаркированной, так и изотопной маркировки аминокислотами в клеточной культуре (SILAC) с маркировкой клеток HeLa, а также к эндогенным образцам, таким как ткани мозга.

Этот рабочий процесс представляет собой ценное дополнение к репертуару инструментов для анализа убиквитинации сайтов для того, чтобы раскрыть глубокий убикитино. Следующий протокол подробно описывает все этапы рабочего процесса.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (EDC) Erasmus MC.

1. Подготовка образца

  1. Культурные клетки
    1. Выберите линию интереса клеток (например, HeLa или остеосаркома (U2OS) и вырастите клетки в мини-орлином среднем Dulbecco (DMEM) дополненном 10% тепловой инактивированной сывороткой крупного рогатого скота (FBS) и 100 единиц/мл пенициллина/стрептомицина.
    2. Для количественных экспериментов протеомики, культурные клетки в DMEM не хватает аргинина и лизин. Среда должна быть дополнена 10% диализированной сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS), 100 единиц/мЛ пенициллина/стрептомицина и аланина-глутамина. Сделать два типа носителей, добавив либо обычный лизин и аргинин ('Light' Medium) или лизин-8 (13C6; 15N2) и аргинин-10 (13C6; 15N4) ('Тяжелый' Средний), соответственно.
    3. Культурные партии клеток в Light Medium (т.е. без маркировки) и Heavy Medium (т.е. помечены, SILAC) в течение по крайней мере шести удвоений до расширения и лечения, чтобы убедиться, что все белки в культуре тяжелой среды помечены тяжелым стабильным изотопов, содержащим Аминокислот.
    4. Лечить клетки в течение 8 ч с 10 мкм протеасомы ингибитор бортезомиб или эквивалентный объем DMSO в качестве макета лечения. Вымойте клетки с PBS, разъединить их с помощью 1% трипсин / EDTA, и гранулы клеток.
    5. Лиза клеточной гранулы из одного 150 см2 культуры пластины на состояние испытания в 2 мл ледяной 50 мм Tris-HCl (pH No 8.2) с 0,5% дезоксихолата натрия (DOC). Отварить лизат при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 мин и сонести в течение 10 минут (установка "H" для звукового, перечисленных в таблице материалов) при 4 градусах По Цельсию. Мы не рекомендуем использовать ингибиторы деубитиназы, такие как N-этилмалеймид (NEM), потому что это может привести к нежелательным изменениям белка, которые могут усложнить идентификацию пептида.
  2. In vivo мышь ткани мозга
    1. При использовании ткани in vivo, лиза ткани в ледяной буфер, содержащий 100 мм Tris-HCl (pH No 8.5), 12 мм натрия DOC, и 12 мМ натрия N-lauroylsarcosine17. Снофите лизат в течение 10 мин (установка "H" для звукового, указанного в таблице материалов) при температуре 4 градусов по Цельсию и вскипятите лизат в течение 5 мин при температуре 95 градусов по Цельсию.
  3. Количественная оценка общего количества белка с помощью колоритного абсорбции BCA белкового набора анализов. Общее количество белка должно быть не менее нескольких миллиграммов для успешного иммунопреципиции пептида диГли (IP). Для экспериментов SILAC смешивают легкие и тяжелые маркированные белки в соотношении 1:1, основанном на общем количестве белка.
  4. Уменьшите все белки, используя 5 мМ 1,4-дитиотрейтол в течение 30 мин при 50 градусах По Цельсия, а затем алкилировать их с 10 мм йодоацетамид в течение 15 минут в темноте. Выполняйте переваривание белка с помощью Lys-C (коэффициент 1:200 фермента к субстрату) в течение 4 ч с последующим ночным перевариванием с трипсином (коэффициент фермента к субстрату) при температуре 30 градусов по Цельсию или при комнатной температуре (RT).
  5. Добавьте трифтороацетическую кислоту (TFA) в переваренный образец до конечной концентрации 0,5% и центрифуги юрисцом в 10 000 х г в течение 10 мин, чтобы выскочить и удалить все моющие средства. Соберите супернатант, содержащий пептиды для последующего фракционирования.

2. офлайн пептидная фракционация

  1. Используйте высокофазную реверсную фазу рН (RP) C18 C18 с полимерическим стационарным фазовым материалом (300, 50 мкм; см. Таблица материалов),загруженного в пустой картридж столбцов для фракции триптических пептидов. Неподвижный размер кровати фазы должен быть скорректирован на количество белкового дайджеста, которое должно быть фракционировано. Подготовьте пустой картридж столбца 6 мл (см. Таблица материалов),наполненный 0,5 г стационарного фазового материала для дайджеста белка на 10 мг белка. Белковый дайджест к стационарной фазе соотношения должен быть примерно 1:50 (w/w).
  2. Загрузите пептиды на подготовленную колонку и промойте колонну примерно 10 объемами столбцов 0,1% TFA, а затем примерно 10 объемами столбцов H2O.
  3. Выделите пептиды на три фракции с 10 объемами столбцов аммония 10 мм дляспаривания раствора (pH и 10) с 7%, 13,5% и 50% ацетонитрилом (AcN), соответственно. Лиофилизируют все фракции до полноты.
  4. Используйте убиквитин остатки мотива (K--Я-GG) антитела сопряжены с белком агарозных бусин для иммунообогащения ди-Gly пептидов. Поскольку точное количество антител на партию бисера является конфиденциальной информацией и не разглашается производителем, рекомендуется использовать то же определение для партии бисера, что и производитель, чтобы избежать путаницы. Вымойте одну партию этих бусин 2x с PBS и разделить шарик овсянности на шесть равных фракций. Подробную экспериментальную схему можно найти на рисунке 1.
  5. Растворите три пептидные фракции, собранные в шаге 2,3 в 1,4 мл буфера, состоящего из 50 мМ MOPS, 10 мМ фосфата натрия и 50 мм NaCl (pH 7.2), и вращаться вниз мусора.
  6. Добавьте супернацианты фракций в бисер антитела diGly и инкубировать в течение 2 ч при 4 кв с на блоке ротатора. Спин вниз бисера и передать супернатант на свежий пакет антител бусы и инкубировать снова на 2 ч при 4 градусах Цельсия.
  7. Храните супернацианты для последующего глобального анализа протеома (GP).
  8. Перенесите шарики с каждой фракции в наконечник пипетки в 200 л, оснащенный вилкой фильтра GF/F для удержания бисера. Положите наконечник пипетки с бисером в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл, оснащенную концептером наконечника центрифуги. Вымойте бусы 3x с 200 qL ледяного буфера IAP, а затем 3x с 200 л ледяной милли H2O. Спин вниз по столбце на 200 х г в течение 2 минут перед каждым шагом мытья, но будьте осторожны, чтобы не дать столбику иссякнут. Выявите пептиды, используя 2 цикла по 50 л 0,15% TFA.
  9. Остоятить пептиды с помощью C18 этап еосечки (по сути 200 л пипетки отзыв с двумя дисками C18) и высушить их до полноты с помощью вакуумной центрифугации.

3. Nanoflow LC-MS/MS

  1. Выполните эксперименты LC-MS/MS на чувствительном масс-спектромете в сочетании с системой нанопотока LC.
  2. Используйте в доме упакованы 50 см обратной фазы колонки с 75 мкм внутреннего диаметра упакованы с смолой CSH130 (3,5 мкм, 130 ю) и elute пептидов с градиентом 2-28% (AcN, 0,1% FA) более 120 мин на 300 нл / мин. Держите столбец при температуре 50 градусов по Цельсию, используя, например, колонку (см. Таблицу Материалов).
  3. Выполните анализ масс-спектрометрии.
    1. Масс-спектрометр должен работать в режиме приобретения данных (DDA). Масс-спектры MS1 должны быть собраны с высоким разрешением (например, 120 000), с автоматизированным параметром управления усилением (AGC) целевого уровня 4E5 и максимальным временем впрыска 50 мс в случае масс-спектрометра Orbitrap.
    2. Сначала выполните анализ масс-спектрометрии в режиме "Высокая интенсивность первой". Таким образом, наиболее интенсивный ион выбирается сначала для фрагментации, затем второй самый высокий, и так далее, используя метод максимальной скорости с общим временем цикла 3 с. Затем выполните второй раунд анализа DDA MS в режиме "Самая низкая интенсивность первого", так что наименее интенсивный ион выбран сначала, затем второй самый низкий, и так далее. Эта стратегия обеспечивает оптимальное обнаружение очень низкой аубарантности пептидов.
    3. Фильтр ионов предшественников в соответствии с их состояниями заряда (2-7 зарядов) и моноизотопным пиковым назначением. Исключите ранее допрошенные прекурсоры динамически на 60 с. Изолят пептидные прекурсоры с четырехполюсным массовым фильтром, установленным на ширину 1,6 тыс.
    4. Соберите спектры MS2 в ионной ловушке на AGC 7E3 с максимальным временем впрыска 50 мс и энергией столкновения HCD 30%.

4. Анализ данных

  1. Проанализируйте масс-спектрометрии сырые файлы с помощью соответствующей поисковой системы, такие как свободно доступный пакет программного обеспечения Max'ant на основе поисковой системы Andromeda18,19. В Max'ant выберите параметры по умолчанию с несколькими адаптациями, указанными ниже. Установите специфичность фермента, чтобы трипсин, с максимальным количеством пропущенных расщеплений увеличено до трех. Установите лизин с остатками дигли (No114.04 Da), окисление метионина и N-терминальной ацетилирования в качестве переменных модификаций, и установить карбамидометилирование цистеина в качестве фиксированной модификации.
  2. Выполните поиск базы данных в отношении файла FASTA, содержащего белковые последовательности, загруженные, например, из репозитория Uniprot(https://www.uniprot.org/downloads)в сочетании с приманкой и стандартной общей базой данных загрязнений, которая автоматически предоставляется Maxquant. Установите частоту ложного обнаружения (FDR) до 1% и установите минимальный балл для модифицированных (diGly) пептидов до 40 (значение по умолчанию). Исключить пептиды, идентифицированные с C-терминалом diGly модифицированный остаток лизина из дальнейшего анализа.
  3. Для количественного анализа файлов эксперимента SILAC установите разносторонность на "2" и повторите шаг 4.2.
  4. Выполняйте все анализы вниз по течению (например, статистика, анализ генонологии) с модулем Perseus20 программного пакета Max'uant.

Результаты

Убиквитинатированные белки оставляют остатки 114.04 Da diglycine на остатке лизина цели когда протеины усваиваются с трипсином. Массовая разница, вызванная этим мотивом, была использована для однозначного распознавания места убиквитина в эксперименте масс-спектрометрии. Ст...

Обсуждение

Описанный здесь протокол был применен к образцам из различных биологических источников, таких как культивированные клетки и ткани in vivo. Во всех случаях мы выявили тысячи диглы пептидов, при условии, что общее количество ввода белка было не менее 1 мг. Обогащение с использованием конкрет...

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Эта работа является частью проекта "Белки на работе", программы Нидерландского центра протеомики, финансируемого Нидерландской организацией научных исследований (НВО) в рамках Национальной дорожной карты крупномасштабных научно-исследовательских учреждений (проект No 184.032.201 ).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DithioerythritolSigma-AldrichD8255
3M Empore C18 Octadecyl disksSupelco66883-Uproduct discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)
Ammonium formateSigma-Aldrich70221
BortezomibUBPbio
CSH130 resin, 3.5 μm, 130 ÅWaters
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich34869
DMEMThermoFisher
EASY-nanoLC 1200ThermoFisher
FBSGibco
GF/F filter plugWhatman1825-021
IodoacetamideSigma-AldrichI6125
Lysine, ArginineSigma-Aldrich
Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)Cambridge Isotope Laboratories
Lysyl Endopeptidase(LysC)Wako Pure Chemicals129-02541
NanoLC ovenMPI design, MS Wil GmbH
N-Lauroylsarcosine sodium saltSigma-AldrichL-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometerThermoFisher
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher / Pierce23225
PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particlesAgilent TechnologiesPL1412-2K01
PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) KitCell Signaling Technologies5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac CartridgeWatersWAT036790Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970
Tris-baseSigma-AldrichT6066
Tris-HClSigma-AldrichT5941
Trypsin, TPCK TreatedThermoFisher20233

Ссылки

  1. Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
  2. Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
  3. Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
  4. Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
  5. Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
  6. Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
  7. Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
  8. Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
  9. Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
  10. Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
  11. Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
  12. Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).
  13. Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
  14. Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
  15. Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
  16. Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
  17. Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
  18. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  19. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  20. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
  21. Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
  22. Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
  23. Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
  24. Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

157PTM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены