JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

غالباً ما يكون من الضروري تقييم السمية الخلوية المحتملة لمجموعة من المركبات على الخلايا المستزرعة. هنا، ونحن نصف استراتيجية لفحص موثوق للمركبات السامة في شكل 96 جيدا.

Abstract

السمية الخلوية هي معلمة حرجة تحتاج إلى تحديد كمية عند دراسة الأدوية التي قد تكون لها فوائد علاجية. وبسبب هذا، يستخدم العديد من الاختبارات فحص المخدرات السمية الخلوية باعتبارها واحدة من الخصائص الحرجة التي ينبغي تحديدها للمركبات الفردية. الخلايا في الثقافة هي نموذج مفيد لتقييم السمية الخلوية قبل الشروع في متابعة مركبات الرصاص الواعدة في نماذج حيوانية أكثر تكلفة وكثيفة العمالة. نحن نصف استراتيجية لتحديد المركبات التي تؤثر على نمو الخلايا في tdTomato التعبير عن الخلايا الجذعية العصبية البشرية (NSC) خط. وتستخدم الاستراتيجية اثنين من الاختبارات التكميلية لتقييم رقم الخلية. يعمل اختبار واحد عن طريق تخفيض 3-(4,5-ثنائي ميثيل ثيزول-2-yl)-2,5-ثنائي الفينيل بروميد التترازوليوم (MTT) لتشكلكوكالة كوكيل لرقم الخلية والآخر يعد مباشرة tdTomato التعبير عن NSCs. يمكن إجراء الفحصين في وقت واحد في تجربة واحدة وليست كثيفة العمالة وسريعة وغير مكلفة. وقد اختبرت الاستراتيجية الموصوفة في هذه المظاهرة 57 مركباً في شاشة أولية استكشافية للسمية في شكل لوحة من 96 بئراً. وقد تم وصف ثلاثة من الضربات أكثر في استجابة جرعة من ست نقاط باستخدام نفس الإعداد اختبار الشاشة الأولية. وبالإضافة إلى تقديم دعم ممتاز للسمية، فإن مقارنة النتائج من الاختبارين قد تكون فعالة في تحديد المركبات التي تؤثر على جوانب أخرى من نمو الخلايا.

Introduction

واحدة من أهم الخصائص التي تحتاج إلى تحديد لمجمع كيميائي له إمكانات علاجية هو سميته للخلايا الحيوانية. هذه الخاصية ستحدد ما إذا كان الدواء هو مرشح جيد لدراسة أكثر شمولا. في معظم الحالات، يتم البحث عن مركبات مع الحد الأدنى من السمية ولكن هناك حالات فيها مركب مع القدرة على قتل أنواع محددة من الخلايا هو موضع اهتمام، على سبيل المثال، الأدوية المضادة للورم. على الرغم من أن الحيوانات كلها هي أفضل أنظمة نموذجية لتحديد السمية النظامية، فإن التكلفة والعمالة التي ينطوي عليها الأمر باهظة عندما تحتاج إلى اختبار أكثر من عدد قليل من المركبات. كما أن مثل هذه الثقافة الخلية الثدييات يستخدم عموما كبديل الأكثر كفاءة1،2. وشاشات المخدرات الصغيرة والمتوسطة الإنتاجية هي طريقة هامة يمكن من خلالها تقييم السمية في زراعة الخلايا. يمكن استخدام هذه الشاشات لاستجواب المكتبات المشروحة التي تستهدف مسارات الإشارات الفردية. الشكل العام لمثل هذه الشاشة هو اختبار في البداية جميع المركبات في المكتبة بجرعة واحدة (عموما 10 درجة مئوية) في شاشة سمية أولية استكشافية، ومن ثم إجراء شاشة استجابة جرعة ثانوية متعمقة لتوصيف السمية بشكل كامل ملف تعريف الزيارات من الشاشة الأساسية. وسيجري هنا وصف أساليب تنفيذ هذه الاستراتيجية وتوفير طريقة سريعة وفعالة وغير مكلفة لتحديد المركبات السمية وتوصيفها.

وقد وضعت أساليب متعددة لتقييم السمية الخلوية للمركبات الصغيرة والمواد النانوية في خلايا الثدييات3،4. وتجدر الإشارة إلى أن بعض المواد يمكن أن تتفاعل مع الفحص الذي يوفر نتائج مضللة، وينبغي اختبار هذه التفاعلات عند وصف الضربات من شاشات السمية4. وتشمل اختبار السمية الخلوية تريبان استبعاد الأزرق5، لاكتات dehydrogenase (LDH) اختبار الإصدار6، ألامار الأزرق اختبار7، استر الأسيتوإكسيميثيل (AM)8، وATP اختبار9. كل هذه الاختبارات قياس جوانب مختلفة من استقلاب الخلايا التي يمكن أن تكون بمثابة وكيل لرقم الخلية. في حين أن جميع الفوائد تقدم، والاختبارات المستندة إلى ملح تيترازوليوم مثل 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium بروميد (MTT)، 2،3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide الملح الداخلي (XTT)-1، و4-(3-4- يودوفينيل]-2-[4-نيتروفينل]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzene disulfonate (WST-1)10,11 توفر دقة جيدة وسهولة الاستخدام بتكلفة منخفضة. يتم تقليل MTT، والتي سيتم استخدامها في هذه المظاهرة، إلى شكل غير قابل للذوبان عن طريق اختزال الميتوكوندريا ويرتبط معدل هذا التحويل بقوة مع رقم الخلية. وقد استخدم هذا الفحص بشكل روتيني على نطاق صغير وللمكتبات التي تعرض ما يصل إلى 000 2 مركب12. يوفر العد المباشر للخلايا بواسطة علامة مسماة طريقة أخرى لتقييم رقم الخلايا الخلوية، وعلى عكس فحص MTT يمكن أن يوفر معلومات إضافية حول ديناميات النمو الخلوي. تتوفر العديد من الخوارزميات المتاحة للجمهور لإجراء تحليلات حساب الخلايا الآلي وهناك أيضا خوارزميات الملكية التي هي جزء من حزم البرمجيات لقراء التصوير13،14. في هذا الوصف الأسلوب، فإن خط الخلايا الجذعية العصبية البشرية (NSC) التي تم تحريرها وراثيا للتعبير عن المكونة tdTomato15 بمثابة خط اختبار لمقارنة نتائج الصلاحية الخلوية بين اختبار MTT وحساب الخلايا الآلي الفحص في شاشة تقييم سمية 57 مركبات الاختبار. على الرغم من أن الهدف الرئيسي لهذه الاستراتيجية كان تحديد وتوصيف المركبات السامة، إلا أن لها فائدة إضافية تتمثل في احتمال تحديد مركبات النمو المثبطة وتعزيز النمو، وبالتالي توفر طريقة فعالة لتحديد الأدوية التي يمكن أن تعدل النمو الخلوي.

Protocol

1- ثقافة مجلس الأمن القومي

ملاحظة: سيتم وصف معالجة خط NSC الإنسان أدناه ولكن يمكن استخدام أي خط خلية لهذا البروتوكول. يتم تنفيذ جميع أعمال زراعة الخلايا في خزانة السلامة البيولوجية.

  1. معطف لوحة 96 جيدا مع غشاء الطابق السفلي / مصفوفة خارج الخلية (ECM).
    1. ذوبان aliquot من ECM(جدول المواد)،والتي من شأنها أن تسهل مرفق NSC، على الجليد. تخفيف ECM إلى التركيز المناسب (عموما 1:100) في 10 مل قاعدة متوسطة(جدول المواد)وإضافة 50 درجة مئوية لكل بئر من 60 الآبار الداخلية من لوحة 96 جيدا(الشكل 1). استخدام فقط الداخلية 60 الآبار لتجنب القطع الأثرية التي قد تنتج عن تأثير الحافة16.
    2. دع اللوحة تقع في درجة حرارة الغرفة أو في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية، 5٪ CO2)لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  2. تفكك الخلايا الجذعية العصبية ولوحة.
    ملاحظة: يجب أن تنمو الخلايا للاستخدام في هذا الأسلوب إلى التقاء 80% على الأقل في قارورة T75.
    1. خلايا الثقافة في قارورة T75 في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في وسط NSC التي تتكون من المتوسطة الأساسية، B27، الأحماض الأمينية غير الأساسية، 2 مل الجلوتامين، و 10 نانوغرام / مل عامل نمو الليفياللي الأساسية (FGFb أو FGF2).
    2. إزالة الخلايا من الحاضنة بمجرد أن تصل إلى 80٪ التقاء واستنشاق قبالة الأمن القومي المتوسطة. إضافة كمية مناسبة من كاشف انفصال الخلية (3 مل لقارورة T75؛ جدول المواد) وحضانة لمدة 5 دقائق في الحاضنة.
    3. بعد الحضانة، أضف 7 مل من وسط NSC في قارورة T75 والماصة بقوة لضمان انفصال جميع الخلايا. نقل حل الخلية المنفصلة إلى أنبوب 15 مل والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
    4. بعد الطرد المركزي، إزالة supernatant من الأنبوب وإعادة تعليق الخلايا في 10 مل من الخلايا المتوسطة وحساب NSC.
    5. إعادة ضبط تركيز الخلايا إلى 200،000 خلية / مل مع وسط NSC. تأكد من إعادة تعليق الخلايا بالكامل للطلاء المتجانس في الآبار.
    6. لوحة 100 درجة مئوية من خليط الخلية (20،000 خلية) في 60 الآبار الداخلية من ثلاثة لوحات 96 جيدا التي تم المغلفة كما هو موضح في القسم 1.1. استخدم ستة من الفتحات الثمانية لـ pipettor متعدد القنوات 8 قنوات إلى خلايا اللوحة عمودًا بعمود.
    7. إضافة 100 درجة مئوية من المتوسطة الأساسية أو NSC المتوسطة إلى جميع الآبار دون خلايا لتقليل التبخر المحتمل من الآبار الخارجية.
    8. تحت مجهر ثقافة الخلية، فحص بصريا ما لا يقل عن 10 آبار على كل من لوحات 96 جيدا الثلاثة للتأكد من أن الخلايا هي البذر في الكثافة المتوقعة. لا تمضي قدما في فحص إذا كانت الخلايا مطلية بكثافة متفرقة جدا أو كثيفة.

2. علاج الخلايا مع المركبات

ملاحظة: المكتبة المصنوعة في المنزل التي تم اختبارها في هذه المظاهرة تحتوي على المركبات التي تعدل بدون جناح / متكاملة (Wnt)، حمض الريتينويك، وتحويل عامل النمو بيتا (TGF-β)، ومسارات الإشارات القنفذ سونيك، فضلا عن مجموعة متنوعة من كيناز التيروزين.

  1. شاشة أولية استكشافية للسمية/رقم الخلية
    1. Aliquot 50-100 مل من ما يصل إلى 57 مركب اختبار(الجدول التكميلي 1)بتركيز 10 ملي متر في 100٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في الآبار الداخلية 60 من لوحة U-bottomed، V-bottomed أو جولة القاع 96-جيدا مع ثلاثة آبار DMSO كتحكم (انظر الشكل 1 لخريطة لوحة). وهذا سيكون بمثابة لوحة مركب الرئيسي مع 25 درجة مئوية من المركب التي يمكن تجميدها وذابها عدة مرات.
      ملاحظة: لا ينبغي استخدام لوحات مسطحة القاع كما أنه سيكون من الصعب أكثر لاستنشاق كميات صغيرة من المركبات منها مع أعلى pipettor مقاعد البدلاء.
    2. إزالة لوحات ثقافة الخلية من حاضنة 16-24 ح بعد تقسيم كما هو موضح في القسم 1 واستنشاق قبالة NSC المتوسطة عمود اب بعمود مع 8 قناة متعددة الآبار pipettor باستخدام ستة فقط من فتحات متعددة الآبار الثمانية. إضافة 95 درجة مئوية من المتوسطة NSC الطازجة إلى الخلايا في كل من لوحات تكرار الثلاثة ووضع لوحات مرة أخرى في حاضنة حتى يتم الانتهاء من الخطوة 2.1.4 أدناه.
    3. إضافة 49 درجة مئوية من خط الأمن القومي المتوسطة إلى كل من الآبار الداخلية 60 من فارغة U-القاع، V-القاع أو جولة القاع 96 جيدا لوحة مع 8 قناة متعددة الآبار pipettor. فك لوحة مركب الرئيسي واستخدام أعلى pipettor مقاعد البدلاء أو ما يعادلها أداة لماصة 1 € L من مركب من لوحة رئيسية في 49 درجة مئوية من وسط NSC في كل من الآبار الداخلية 60.
    4. خلط مركب المخفف 3X مع أعلى pipettor مقاعد البدلاء.
    5. إزالة لوحات 96 جيدا من NSCs من الحاضنة، ماصة 15 درجة مئوية من كل مركب مخفف مع أعلى pipettor مقاعد البدلاء والاستغناء عن aliquot 5 ميكرول من المركب في كل من لوحات الثلاثة.
      ملاحظة: هذا التخفيف 1:20 من المركب في الخلايا في تركيبة مع تخفيف الأولي 1:50 في الخطوة 2.1.3 ينتج تخفيف 1:1000 بحيث يكون التركيز النهائي للمركبات على NSCs 10 μM مع تركيز DMSO من 0.1٪ والنهائي سيكون تركيز عناصر تحكم DMSO 0.1%.
    6. حضانة الخلايا مع مركب لمدة 72 ساعة والمضي قدما مع الاختبارات السمية الخلوية. ويمكن استخدام فترات أقصر ولكن فترة حضانة مدتها 72 ساعة ينبغي أن تزيد إلى أقصى حد من الآثار المحتملة للسمية الخلوية للمركبات المختبرة.
  2. فحص استجابة الجرعة
    ملاحظة: يتم عرض الإعداد لـ 96-well المستخدمة للاستجابة للجرعة في الشكل 2.
    1. استخدام العمود 2 لستة DMSO التحكم يكرر واختبار ثلاثة مركبات مختلفة في تخفيف تسلسلي مرتين في ست جرعات بدءا من جرعة عالية من 10 μM.
    2. تخفيف 4 ميكرولتر من DMSO أو مركب اختبار في DMSO إلى 196 ميكرولتر من وسط NSC في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل. إضافة 25 ميكرولتر من DMSO إلى عمود الآبار من B2-G2 و 50 ميكرولتر من مركبات الاختبار إلى الصف من B3-B11 مع المركبات الثلاثة المختبرة في ثلاثة أضعافم 10 m في الصفوف B3-B5 و B6-B8 و B9-B11.
    3. ماصة 25 درجة مئوية من NSC المتوسطة إلى الأعمدة الفارغة المتبقية في الجزء الداخلي من لوحة 96 جيدا. إزالة 25 ميكرولتر من المركب من الآبار B3-B11 مع pipettor متعددة القنوات، إضافة إلى الآبار C3-C11، ومزيج خمس مرات على الأقل. كرر عملية الصفوف المتبقية لتوليد ثلاثة توائم في تخفيف مزدوجة لما مجموعه ست جرعات لكل من المركبات.
    4. توليد NSCs للاستجابة للجرعة تماما كما هو موضح للشاشة الأولية في القسم 2.1. وتضاف مركبات استجابة الجرعة إلى الخلايا وتحتضنها تماماً كما هو موضح في الخطوتين 2-1-5 و2-1-6.
      ملاحظة: يتم إجراء ثلاثة نسخ بيولوجية من اختبار استجابة الجرعة عن طريق تكرار الاختبار على NSCs في مقاطع مختلفة في أيام منفصلة.

3. خلايا التصوير على قارئ لوحة

  1. بعد أن تم احتضان الخلايا مع المركبات للوقت المخصص، خلايا الصورة على قارئ لوحة لتحديد رقم الخلية قبل المعالجة لكل بئر.
    ملاحظة: إرشادات خلايا التصوير خاصة بالقارئ ولكن هاهي بشكل عام اتباع استراتيجية مشابهة. تنطبق الإرشادات أدناه على القارئ المستخدم في هذه المظاهرة(جدول المواد).
  2. إزالة لوحة من الحاضنة ووضعها داخل قارئ لوحة. افتح برنامج الصور لإعداد ملفات البروتوكول والتجارب للدراسة. انتقل إلى الوضع اليدوي للصور على إدارة المهام وانقر فوق التقاط الآن... .
  3. اختيار لوحة 96 جيدا كنوع السفينة، حدد 10X للتكبير، والبروتين الفلورسنت الأحمر (RFP) 531 و 593 لتصوير tdTomato. اختر بئرًا، ثم انقر على التركيز التلقائي لتركيز الصورة، والمعرض التلقائي لوقت التعرض المناسب. ضبط التركيز والتعرض يدويًا إذا لزم الأمر.
  4. بمجرد الحصول على التركيز والتعرض المناسبين، انقر فوق رمز الكاميرا لالتقاط الصورة. ثم انقر فوق عملية/ANALZYE فوق الصورة لمتابعة إنشاء البروتوكول وحدد علامة التبويب تحليل.
  5. انقر فوق تحليل شبكة الجوّال في إضافة خطوة تحليل إلى يمين الصورة ثم انقر فوق ابدأ. ستظهر الصورة الخلايا المميزة للإشارة إلى كل خلية فردية. قد يتم النقر فوق تحديد الخيارات لتغيير المعلمات لتحديد الخلايا بشكل أفضل استناداً إلى عتبة الفلورة أو حجم الخلية. إذا كان الصور يقوم بحساب الخلايا بشكل صحيح، ثم انقر فوق إضافة خطوة في أسفل الشاشة.
  6. انقر فوق الرمز الموجود أعلى الشاشة لإنشاء تجربة من مجموعة الصور، والتي ستفتح نافذة مع التجربة. بمجرد فتحه، انقر فوق الإجراء ضمن علامة التبويب بروتوكول وفي الإطار الجديد الذي يفتح حدد قراءة، ثم في الإطار الجديد انقر فوق لوحة كاملة لتحديد الآبار 60 فقط التي تحتوي على الخلايا (B2... G11). انقر فوق موافق لحفظ التغييرات ثم انقر فوق موافق في الإطار إجراء.
  7. يمكن الآن تصوير اللوحة بواسطة هذا البروتوكول ويمكن حفظ الملف التجريبي. انقر فوق رمز التشغيل لتشغيل اللوحة. بمجرد أن يتم تصوير اللوحة الأولى، صورة لوحات اثنين آخرين. عند الانتهاء من التصوير، قم بتنزيل بيانات عدد الخلايا إلى جدول بيانات للتحليل. التقاط جميع الصور في التكبير 10X.

4. محطة MTT السمية الخلوية

ملاحظة: ابدأ اختبار MTT في غضون ساعتين من إكمال التصوير tdTomato.

  1. جعل 5 ملغ / مل MTT الأوراق المالية الحل عن طريق وزنها من 25 ملغ من MTT وإعادة تعليقه في 5 مل من متوسط NSC. دوامة الحل حتى لا يكون هناك رواسب مرئية من MTT، والتي يمكن أن يستغرق عدة دقائق.
  2. إزالة لوحات ثقافة الخلية من الحاضنة واستنشاق قبالة خلية الثقافة المتوسطة. تخفيف MTT 1:10 في خلية الثقافة المتوسطة وإضافة 100 درجة مئوية من MTT إلى كل بئر من الخلايا.
  3. حضانة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. وينبغي أن يكون الترسيب الأرجواني مرئيا تقريبا بما يتناسب مع عدد الخلايا في البئر. إما يستنشق حل MTT من لوحات أو عكس لوحة بسرعة لنفض الغبار الحل من لوحة.
  4. إضافة 50 درجة مئوية من DMSO 100٪ إلى كل بئر ويهز لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في 400 دورة في الدقيقة. قراءة امتصاص كل بئر في 595 نانومتر في قارئ لوحة وتصدير البيانات إلى جدول بيانات للتحليل.

5 - تحليل البيانات

  1. إجراء تحليل لعد خلايا tdTomato وامتصاصها مع البرامج المناسبة (جدول البيانات التجاري، R). حساب المتوسطات لامتصاص أو عدد الخلايا من DMSO الثلاثة يكرر على كل لوحة لأغراض التطبيع، ثم تقسيم القيمة لتعداد الخلايا أو الامتصاص لكل بئر على لوحة من قبل هذا المتوسط وتحويلها إلى نسبة مئوية. وهذا ينتج عن عدد الخلايا الطبيعية أو الامتصاص بالنسبة إلى التحكم DMSO لكل لوحة.
  2. حساب متوسط العد العادي أو الامتصاص والانحراف المعياري لتكرار الآبار على لوحات الثلاث.
    ملاحظة: عند هذه النقطة يجب أن يكون هناك أربع مجموعات مختلفة من القيم التي تمت تسويتها: واحدة لكل من لوحات ومتوسط واحد للوحات النسخ المتماثل الثلاثة.
  3. أن تكون محافظة واستخدام قيمة طبيعية في أو أقل من 25٪ للمتوسط عبر لوحات تكرار ثلاثة لتصنيف مركب على أنها سامة. أيضا، لأنه يتم تنفيذ علاج واحد فقط لكل مركب على كل لوحة، فقط المركبات التسمية التي تقع تحت هذه العتبة على جميع لوحات تكرار الثلاثة كما سامة. فحص الصور الفلورية لجميع المركبات التي مرشحات هذا التحليل كما سامة لتأكيد السمية بصريا.
    ملاحظة: تحديد المركبات مع تأثير النمو المثبطة أو تعزيز النمو هو أكثر صعوبة لتقييم في اختبار استكشافي من هذا النوع بسبب عدم وجود تكرار على كل لوحة. ومع ذلك, ما يلي هو وسيلة سريعة لتحديد المركبات التي قد تبطئ أو تعزيز النمو الخلوي.
  4. حساب الانحراف المعياري لعناصر تحكم DMSO الثلاثة المتماثلة على كل لوحة ثم قم بتصفية أي مركبات لها قيم متوسطة على الأقل اثنين من الانحرافات المعيارية فوق أو أقل من عنصر تحكم DMSO. المركبات التي تسقط من هذا المرشح على كل من لوحات الثلاث قد تبرر المزيد من التحقيق.
  5. استخدام نفس استراتيجية التحليل لاستجابة الجرعة كشاشة السمية الأولية. حساب المتوسطات لعناصر تحكم DMSO لكل تكرار بيولوجي واستخدام هذه القيم لتطبيع النسبة المئوية للخلايا الحية أو النسبة المئوية للامتصاص لكل مركب/جرعة تركيبة. حساب الوسائل والخطأ القياسي للوسائل لجميع تركيبات المركبة/الجرعة للتكرارات البيولوجية الثلاثة.
  6. تحويل التركيز إلى قيمة السجل، وتوليد منحنى استجابة الجرعة لسجل التركيز مقابل الجدوى الطبيعية، وتناسب المنحنى مع تحليل الانحدار غير الخطي (يمكن إجراء التحليل في R أو مختلف الإحصائية التجارية حزم). حساب الجرعة المميتة 50 (أو تقنيا في هذه الحالة الجرعة القابلة للحياة 50) أو تركيز المركب الذي يؤدي إلى سمية 50٪ من معادلة هذا المنحنى. العديد من حزم البرامج سيتم حساب هذا الرقم تلقائيا.

النتائج

وحددت بيانات عدد الخلايا الآلية أحد عشر مركباً ذات قدرة قابلة للبقاء تقل عن 25 في المائة عند تطبيعها إلى عنصر التحكم في نظام إدارة الوجهات السياحية، في حين حددت بيانات MTT هذه المركبات نفسها بالإضافة إلى مركبين إضافيين(الجدول 1 والجدول 2،أحمر مظلل). وكان المركبان اللذين تبي...

Discussion

كان الهدف الرئيسي من هذه المقالة هو وصف استراتيجية يمكن أن تحدد بكفاءة وبتكلفة غير مكلفة المركبات التي تؤثر على نمو الخلايا في فحص الإنتاجية المنخفضة إلى المتوسطة. واستُخدمت تقنيتان متعامدة لتقييم رقم الخلية لزيادة الثقة في الاستنتاجات وتقديم رؤى إضافية لن تكون متاحة إذا ما استُخدم سوى ?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل برنامج NINDS للبحوث داخل الجدارية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
B-27 (50X)ThermoFisher Scientific17504001Neural stem cell medium component.  
BenchTop pipettorSorenson Bioscience73990Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.
BioLite 96 well multidishThermo Scientific130188Any 96 well cell culture plate will work.  We use these in our work.
Cell culture microscopeNikonEclipse TS100Visual inspection of cells to ensure proper density.
Cytation 5/ Imaging readerBioTekCYT3MFVUsed for cell imaging and absorbance readings.
DMSOFisher Scientific610420010Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.
FGF-basicPeprotech100-18BNeural stem cell medium component.  
GelTrexThermoFisher ScientificA1413202Neural stem cell basement membrane matrix.  Allows cells to attach to cell culture plates.
Gen5 3.04BioTekAnalysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.
GlutamineThermoFisher Scientific25030081Neural stem cell medium component.  
Microtest U-BottomBecton Dickinson3077Storage of compound libraries.
MTTThermoFisher ScientificM6494Active assay reagent to determine cellular viability.
Multichannel pippetteRaininE8-1200Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.
Neurobasal mediumThermoFisher Scientific21103049Neural stem cell base medium.
RFP filter cubeBioTek1225103Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.
TrypLEThermoFisher Scientific12605036Cell dissociation reagent.

References

  1. National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).
  2. Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
  3. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  4. Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
  5. Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
  6. Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
  7. Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
  8. Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
  9. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
  10. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  11. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  12. Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
  13. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  14. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
  15. Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
  16. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  17. Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
  18. Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
  19. Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
  20. Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
  21. Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
  22. Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151 3 4 5 2 yl 25 MTT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved