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要約

多くの場合、培養細胞上の化合物のセットの潜在的な細胞毒性を評価する必要があります。ここでは、96ウェル形式で有毒化合物を確実にスクリーニングする戦略について説明する。

要約

細胞毒性は、治療上の利点を有する可能性のある薬物を研究する際に定量化する必要がある重要なパラメータです。このため、多くの薬物スクリーニングアッセイは、個々の化合物に対してプロファイリングされる重要な特性の1つとして細胞毒性を利用する。培養中の細胞は、より高価で労働集約的な動物モデルで有望な鉛化合物のフォローアップを進める前に細胞毒性を評価するのに有用なモデルです。ヒト神経幹細胞(NSC)ラインを発現するtdTomatoの細胞増殖に影響を与える化合物を同定する戦略について述べた。この戦略では、2 つの相補的なアッセイを使用して細胞数を評価します。1つのアッセイは、3-(4,5-ジメチルチゾル-2-yl)-2,5-ジフェニルテルゾルム臭化物(MTT)の還元を介して働き、細胞数のプロキシとして形成し、もう一方はNSCを発現するtdTomatoを直接カウントする。2つのアッセイは単一の実験で同時に行うことができ、労働集約的で、急速で、安価ではない。このデモンストレーションで説明した戦略は、96ウェルプレート形式で毒性のための探索的一次スクリーンで57の化合物をテストしました。3つのヒットは、プライマリ画面と同じアッセイ設定を用いた6点線量応答でさらに特徴付けられた。毒性に対して優れた腐食を提供することに加えて、2つのアッセイからの結果の比較は、細胞増殖の他の側面に影響を与える化合物を同定するのに有効である可能性がある。

概要

治療の可能性を有する化学化合物のために決定する必要がある最も重要な特性の一つは、動物細胞への毒性です。この特性は、薬物がより広範な研究のための良い候補であるかどうかを決定します.ほとんどの場合、毒性を最小限に抑えた化合物が求められますが、特定の細胞型を殺す能力を持つ化合物が、例えば抗腫瘍性薬物が関心を持つ状況があります。全動物は全身毒性を決定するための最良のモデルシステムですが、少数の化合物をテストする必要がある場合、関連するコストと労力は非常に高くなります。このような哺乳動物細胞培養は、一般に最も効率的な代替1、2として使用される。小~中スループットの薬物スクリーンは、細胞培養中に毒性を評価できる重要なモダリティである。これらの画面は、個々のシグナリング経路を対象とする注がれたライブラリを調知るために使用できます。このような画面の一般的な形式は、最初に探索的一次毒性スクリーンで単回用量(一般に10μM)でライブラリ内のすべての化合物をテストし、その後、毒性を完全に特徴付けるために詳細な二次用量応答スクリーンを実行することですプライマリ画面からのヒットのプロファイル。この戦略を実装する方法をここで説明し、有毒化合物を識別し、特徴付ける迅速で効率的かつ安価な方法を提供します。

哺乳動物細胞3,4における小さな化合物およびナノ材料の細胞毒性を評価するために、複数の方法が開発されている。特定の材料が誤解を招く結果を提供するアッセイと相互作用することができ、そのような相互作用は毒性スクリーン4からのヒットを特徴付けるときテストされるべきであることに留意すべきです。細胞毒性アッセイは、トリパンブルー排除5、乳酸脱水素酵素(LDH)放出アッセイ6、アラマーブルーアッセイ7、カルシエンアセトキシメチルエステル(AM)8、およびATPアッセイ9を含む。これらのアッセイはすべて、細胞数のプロキシとして機能することができる細胞代謝の様々な側面を測定します。いずれも3-(4,5-ジメチルチゾール-2-yl)-2,5-ジフェニルテルゾリウム臭化物(MTT)、2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニ)-2H-テトラゾリウム(塩-5-カルボニウム)などの塩系アッセイを提供しています。 4-(3-4-ヨウドフェニル]-2-[4-ニトロフェニル]-2H-5-テトラゾリオ)-1,3−ベンゼンジスルホン酸(WST-1)10、11は、低コストで良好な精度と使いやすさを提供します。このデモンストレーションで使用されるMTTは、ミトコンドリア還元酵素によって不溶性のフォルマザンに減少し、この変換の速度は細胞数と強く相関する。このアッセイは、小規模で、最大2,000化合物12のスクリーニングライブラリのために日常的に利用されています。標識マーカーによる細胞の直接カウントは、細胞数を評価する別の方法を提供し、MTTアッセイとは異なり、細胞増殖のダイナミクスに関する追加情報を提供することができます。いくつかの一般に利用可能なアルゴリズムは、自動セル数分析を実行するために利用可能であり、イメージングリーダー13、14のためのソフトウェアパッケージの一部である独自のアルゴリズムもあります。この方法の説明では、tdTomato15を構成的に発現するように遺伝的に編集されたヒト神経幹細胞(NSC)ラインは、MTTアッセイと自動細胞計数との間の細胞生存率の結果を比較するためのテストラインとして機能する。57のテスト化合物の毒性を評価するスクリーンでのアッセイ。この戦略の主な目的は、有毒化合物を同定し、特徴付けさせることでしたが、成長抑制および増殖増強化合物を潜在的に同定する追加の利点があり、したがって、薬物を同定するための効果的な方法を提供します細胞の成長を調節することができます。

プロトコル

1. NSC文化

注:ヒトNSCラインの操作は以下に説明しますが、このプロトコルには任意のセルラインを使用できます。すべての細胞培養作業は、生物学的安全キャビネットで行われる。

  1. 96ウェルプレートに地下膜/細胞外マトリックス(ECM)を塗ります。
    1. 氷上にNSCの取り付けを容易にするECM(材料の表)のアリコートを解凍します。ECMを10mL塩基媒体(材料表)で適切な濃度(一般に1:100)に希釈し、96ウェルプレートの60の内部ウェルのそれぞれにウェルあたり50 μLを加えます(図1)。エッジエフェクト16に起因するアーティファクトを避けるために、内部60ウェルのみを使用してください。
    2. プレートを室温または細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)で少なくとも30分間座らせます。
  2. 神経幹細胞を解離し、プレートします。
    注:この方法で使用するセルは、T75フラスコ内の少なくとも80%の合流点に成長する必要があります。
    1. ベース培地、B27、非必須アミノ酸、2mMグルタミン、および10ng/mL基本線維芽細胞増殖因子(FGFbまたはFGF2)からなるNSC培地における細胞培養インキュベーター中のT75フラスコ中の培養細胞。
    2. 80%の合流点に達したらインキュベーターから細胞を取り出し、NSC培地を吸引します。適切な量の細胞解離試薬(T75フラスコの場合は3mL;材料の表)インキュベーターで5分間インキュベートします。
    3. インキュベーション後、T75フラスコとピペットに7mLのNSC培地を加え、すべての細胞が剥離されるようにします。解離した細胞溶液を15mLチューブに移し、遠心分離機を200 x gで5分間移します。
    4. 遠心分離後、チューブから上清を取り出し、NSC培地の10mLで細胞を再中断し、細胞を数えます。
    5. 細胞の濃度をNSC培地で200,000細胞/mLにリバジャストします。均質なめっきのために細胞が完全に再懸濁されていることを確認してください。
    6. セクション1.1に記載されているように被覆された3つの96ウェルプレートの60内部ウェルにおける細胞混合物(20,000細胞)のプレート100μL。8 チャンネルマルチチャンネルピペットの 8 つのスロットのうち 6 つのスロットを使用して、セルを列ずつプレートします。
    7. 細胞のないすべてのウェルに100 μLの塩基培地またはNSC培地を追加し、最も外側のウェルからの潜在的な蒸発を最小限に抑えます。
    8. 細胞培養顕微鏡では、3つの96ウェルプレートのそれぞれに少なくとも10個のウェルを目視で検査し、細胞が期待される密度で播種されていることを確認します。細胞があまりにもまばらまたは密度の高い密度でめっきされている場合は、アッセイを続行しないでください。

2. 化合物による細胞の治療

注:このデモンストレーションでテストされた自家製ライブラリには、翼レス/統合(Wnt)、レチノイン酸、成長因子β(TGF-β)、およびソニックヘッジホッグシグナル伝達経路、および様々なチロシンキナーゼを調節する化合物が含まれています。

  1. 毒性/細胞番号のための探索的なプライマリ画面
    1. アリコート50−100 mL最大57の試験化合物(補足表1)を100%ジメチルスルホキシド(DMSO)の濃度で、Uボトム、Vボトムまたは丸底96ウェルプレートの内部60ウェルに3つのDMSOとコントロールを有する(コントロールを参照)プレートマップの図 1)。これは、凍結および解凍することができる化合物の25 μLを持つマスター化合物プレートとして機能します。
      注:平らな底板は、ベンチトップピペットでそれらから化合物の少量を吸引することがより困難になりますので、使用しないでください。
    2. セクション1で説明するように分割した後、インキュベーター16-24 hから細胞培養プレートを取り出し、8チャンネルのマルチウェルピペットでNSC中列を吸引し、8つのマルチウェルスロットのうち6つだけを使用します。3つの反復プレートのそれぞれに95 μLの新鮮なNSC培地を加え、下のステップ2.1.4が完了するまでプレートをインキュベーターに戻します。
    3. 空のUボトム、Vボトムまたは丸底96ウェルプレートの内部60ウェルの各内部に49 μLのNSC培地を8チャンネルマルチウェルピフェッタで追加します。マスターコンパウンドプレートのシールを外し、ベンチトップピペッタまたは同等の器具を使用して、マスタープレートから内部60ウェルの各々のNSC培地の49 μLに化合物のピペット1 μLを使用します。
    4. 希釈した化合物をベンチトップピペッタと混ぜます。
    5. インキュベーターからNSCの3つの96ウェルプレートを取り出し、ベンチトップピペットで各希釈化合物のピペット15μLを取り出し、3つのプレートのそれぞれに化合物の5 μLアリコットを分配します。
      注:ステップ2.1.3の最初の1:50希釈と組み合わせて細胞への化合物のこの1:20希釈は、NSC上の化合物の最終的な濃度が0.1%のDMSO濃度と最終の10 μMとなるように1:1000の希釈を生み出します。DMSO制御の濃度は0.1%になります。
    6. 72時間の化合物で細胞をインキュベートし、細胞毒性アッセイを進めます。より短い間隔を使用することができますが、72時間のインキュベーション期間は、テストされた化合物の潜在的な細胞傷害性の効果を最大化する必要があります。
  2. 用量応答アッセイ
    注: 線量応答に使用される 96 ウェルのセットアップを図 2 に示します。
    1. 10 μMの高用量から始まる6回の用量で、2倍のシリアル希釈で最大3つの異なる化合物の3つのDMSO制御反復および試験三重化に列2を使用します。
    2. DMSOまたは試験化合物の4μLを1.5 mLマイクロ遠心管中のNSC培地の196 μLに希釈します。B2-G2 からウェルのカラムに 25 μL の DMSO を追加し、B3-B11 から B3-B11 の行に対して 50 μL の試験化合物を、B3-B5、B6-B8、および B9-B11 の 3 つの mM 三元に並べて行に追加します。
    3. 96ウェルプレートの内部部分の残りの空柱にNSC培地のピペット25μL。マルチチャンネルピペットでウェルB3-B11から化合物の25 μLを取り出し、ウェルC3-C11に加え、少なくとも5回混合する。残りの行のプロセスを繰り返して、各化合物に対して合計 6 回の用量の 2 倍の希釈で三重化を生成します。
    4. セクション 2.1 のプライマリ画面で説明したとおりに、線量応答の NSC を生成します。用量応答のための化合物は、ステップ2.1.5および2.1.6で説明されているとおりに細胞上に添加およびインキュベートされる。
      注:用量応答アッセイの3つの生物学的複製は、別々の日に異なる通路でNSC上のアッセイを繰り返すことによって行われる。

3. プレートリーダー上のイメージングセル

  1. 細胞を割り当てられた時間の化合物でインキュベートした後、プレートリーダー上の画像細胞は、ウェル当たりの前処理細胞数を決定する。
    注: イメージング セルの手順は読者固有ですが、一般的には同様の方法に従います。以下の指示は、このデモで使用するリーダー (材料の表)に適用されます。
  2. インキュベーターからプレートを取り出し、プレートリーダーの中に入れます。イメージャーソフトウェアを開いて、スタディ用のプロトコルと実験ファイルを設定します。タスク マネージャのイメージャーマニュアルモードに移動し、[今すぐキャプチャ]をクリックします。
  3. 容器タイプとして96ウェルプレートを選択し、倍率に対して10倍を選択し、赤色蛍光タンパク質(RFP)531および593をtdTomatoをイメージングします。ウェルを選択し、[オートフォーカス]をクリックして画像にフォーカスを合わせ、適切な露出時間を設定します。必要に応じて、フォーカスと露出を手動で調整します。
  4. 適切なフォーカスと露出が得られたら、カメラアイコンをクリックして画像をキャプチャします。次に、上の画像の [プロセス/ANALZYE] をクリックしてプロトコルの構築を続行し、[分析] タブを選択します。
  5. 画像の右側にある[解析の追加ステップ]で[細胞解析]をクリックし、[開始]をクリックします。画像には、個々のセルを示す強調表示されたセルが表示されます。オプションの選択をクリックすると、蛍光閾値または細胞サイズに基づいて細胞をより良く選択するためにパラメータを変更できます。イメージャーがセルを正しくカウントしている場合は、画面下部の [ステップを追加] をクリックします。
  6. 画面上部のアイコンをクリックして、実験でウィンドウを開く画像セットから実験を作成します。開いたら、[プロトコル] タブの下にある[手順]をクリックし、[読み取り]を開いた新しいウィンドウで [読み取り] をクリックし、新しいウィンドウでフル プレートをクリックして、セルを含む 60 のウェルのみを選択します (B2...G11)。[OK]をクリックして変更を保存し、[プロシージャ] ウィンドウで[OK]をクリックします。
  7. プレートはこのプロトコルでイメージ化でき、実験ファイルを保存できるようになりました。再生アイコンをクリックしてプレートを実行します。最初のプレートをイメージしたら、他の 2 つのプレートをイメージします。イメージングが完了すると、セルカウント データをスプレッドシートにダウンロードして分析します。すべての画像を10倍の倍率で撮影します。

4. 末端MTT細胞毒性アッセイ

注:tdTomatoイメージングを完了してから2時間以内にMTTアッセイを開始します。

  1. MTTの25 mgを計量し、NSC培地の5 mLで再中断することにより、5 mg/mL MTTストック溶液を作ります。MTTの目に見える沈殿物が見られないまで溶液を渦にし、数分かかることがあります。
  2. インキュベーターから細胞培養プレートを取り出し、細胞培養培地を吸引します。細胞培養培地でMTT1:10を希釈し、細胞の各ウェルに100μLのMTTを添加する。
  3. 細胞を37°Cで2時間インキュベートする。紫色の沈殿物は、井戸内の細胞数に比例して大まかに見える必要があります。MTT溶液をプレートから取り外すか、プレートを素早く反転してプレートから溶液をフリックします。
  4. 各ウェルに100%DMSOの50 μLを追加し、400 rpmで10分間室温でプレートを振ります。プレートリーダーの595 nmで各井戸の吸光度を読み取り、分析のためにスプレッドシートにデータをエクスポートします。

5. データ分析

  1. tdTomato細胞数と吸光度の分析を適切なソフトウェア(商用スプレッドシート、R)で行います。正規化の目的で各プレート上の 3 つの DMSO 反復の吸光度またはセル数の平均を計算し、プレート上の各ウェルのセル数または吸光度の値をこの平均で除算し、パーセンテージに変換します。これにより、各プレートの DMSO 制御に対する正規化されたセル数または吸光度が得られます。
  2. 3つのプレート上のレプリケートウェルの平均正規化数または吸光度と標準偏差を計算します。
    注: この時点で、4 つの異なる正規化された値のセットが必要です。
  3. 控えめにし、3つの反復プレート全体の平均に対して25%以下の正規化値を使用して、化合物を有毒として分類します。また、各プレートに対して化合物1回の処理のみが行われるため、3つのレプリケートプレートすべてに対してこの閾値を下回る標識化合物のみが有毒であると考える。この分析が毒性としてフィルタリングするすべての化合物の蛍光画像を調べ、毒性を視覚的に確認します。
    注:成長抑制または成長増強効果を持つ化合物の同定は、各プレート上の反復の欠如のために、このタイプの探索的アッセイで評価することがより困難です。しかし, 以下は、細胞の成長を遅くまたは高めることができる化合物を識別するための迅速な方法.
  4. 各プレート上の 3 つの反復 DMSO コントロールの標準偏差を計算し、DMSO コントロールの上または下に平均値が少なくとも 2 つある化合物をフィルタリングします。3つのプレートのそれぞれにこのフィルタから抜け落ちる化合物は、さらなる調査を必要とする場合があります。
  5. 一次毒性スクリーンと同じ分析戦略を使用して用量応答を使用します。各生物学的反復のDMSOコントロールの平均を計算し、これらの値を使用して、各化合物/用量の組み合わせに対する生細胞の割合またはパーセント吸光度を正規化します。3つの生物学的反復に対するすべての化合物/用量の組み合わせに対する平均値と標準誤差を計算します。
  6. 濃度をその対数値に変換し、濃度対正規化された生存率の対数に対する線量応答曲線を生成し、非線形回帰分析で曲線を適合させる(分析はRまたは様々な商業統計で行うことができる)パッケージ)。この曲線の方程式から50%の毒性をもたらす化合物の致死用量50(または技術的にはこの場合は生存可能な用量50)または濃度を計算する。多くのソフトウェア パッケージは、この数値を自動的に計算します。

結果

自動化された細胞数データは、DMSO制御に正規化された場合、25%未満の生存率を有する11の化合物を同定し、MTTデータはこれらの同じ化合物に加えて2つの追加化合物を同定した(表1および表2、赤色のシェーディング)。MTTアッセイ(ウェルF3およびG10)でのみ有毒であることが判明した2つの化合物は、それぞれ31%および39%であり、対照およびランク順としてのtdTomato陽性細...

ディスカッション

この記事の主な目的は、低スループットスクリーニングで細胞増殖に影響を与える化合物を効率的かつ安価に同定できる戦略を説明することでした。2つの直交技術を用いて、細胞数を評価して結論に対する信頼度を高め、1つのアッセイしか使用できない追加の洞察を提供しました。アッセイの1つは、tdTomato陽性細胞を直接カウントするために蛍光細胞イメージャーを使用し、2つ目は、MTTを?...

開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

この研究は、NINDS内部壁画研究プログラムによって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
B-27 (50X)ThermoFisher Scientific17504001Neural stem cell medium component.  
BenchTop pipettorSorenson Bioscience73990Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.
BioLite 96 well multidishThermo Scientific130188Any 96 well cell culture plate will work.  We use these in our work.
Cell culture microscopeNikonEclipse TS100Visual inspection of cells to ensure proper density.
Cytation 5/ Imaging readerBioTekCYT3MFVUsed for cell imaging and absorbance readings.
DMSOFisher Scientific610420010Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.
FGF-basicPeprotech100-18BNeural stem cell medium component.  
GelTrexThermoFisher ScientificA1413202Neural stem cell basement membrane matrix.  Allows cells to attach to cell culture plates.
Gen5 3.04BioTekAnalysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.
GlutamineThermoFisher Scientific25030081Neural stem cell medium component.  
Microtest U-BottomBecton Dickinson3077Storage of compound libraries.
MTTThermoFisher ScientificM6494Active assay reagent to determine cellular viability.
Multichannel pippetteRaininE8-1200Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.
Neurobasal mediumThermoFisher Scientific21103049Neural stem cell base medium.
RFP filter cubeBioTek1225103Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.
TrypLEThermoFisher Scientific12605036Cell dissociation reagent.

参考文献

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