识别影响培养哺乳动物细胞在低到中度通量下细胞生长和生存的化合物的策略

摘要

通常有必要评估培养细胞中一组化合物的潜在细胞毒性。在这里，我们描述了一种以 96 井格式可靠地筛选有毒化合物的策略。

摘要

细胞毒性是一个关键参数，在研究可能具有治疗效果的药物时需要量化。因此，许多药物筛选分析利用细胞毒性作为单个化合物的关键特征之一。培养中的细胞是评估细胞毒性的有用模型，然后再在更昂贵和劳动密集型的动物模型中对有前途的铅化合物进行跟踪。我们描述了一种策略，用于识别表达人类神经干细胞（NSC）线的tdTomato中影响细胞生长的化合物。该策略使用两个互补检测来评估细胞数量。一种检测通过减少3-（4，5-二甲基硫硫-2-yl）-2，5-二苯基溴化二甲苯（MTT）作为细胞数的代理，另一个直接计数表达NSC的tdTomato。两种检测可以在单个实验中同时进行，并且不耗费大量人力、快速且价格低廉。本演示中描述的策略以 96 孔板格式在探索性初级屏幕中测试了 57 种化合物的毒性。三个命中在六点剂量响应中进一步特征，使用与主屏幕相同的测定设置。除了提供极好的毒性佐证外，两种测定结果的比较可能有效识别影响细胞生长其他方面的化合物。

引言

对于具有治疗潜力的化合物，需要确定的最重要特征之一是其对动物细胞的毒性。这一特点将决定药物是否是更广泛的研究的好候选者。在大多数情况下，寻求毒性最小的化合物，但在某些情况下，具有杀死特定细胞类型的化合物是值得关注的，例如抗肿瘤药物。虽然整个动物是确定系统毒性的最佳模型系统，但当需要测试多个化合物时，所涉及的成本和人工是令人望而却步的。因此哺乳动物细胞培养一般用作最有效的^{替代1，2。}小中度药物筛是评估细胞培养中毒性的重要方式。这些屏幕可用于查询针对单个信号通路的带过号库。这种屏幕的一般格式是首先在探索性原发毒性筛查中以单剂量（一般为10μM）测试库中的所有化合物，然后执行深度二次剂量反应屏幕以完全表征毒性主屏幕的点击配置文件。此处将介绍实施此战略的方法，并提供一种快速、高效和廉价的方式来识别和描述有毒化合物。

已经开发出多种方法来评估哺乳动物细胞中小化合物和纳米物质的细胞^{毒性3，4。}需要注意的是，某些材料可以与提供误导性结果的检测结果相互作用，在描述毒性^屏幕4的命中时，应测试这种相互作用。细胞毒性测定包括锥形蓝^排除5、乳酸脱氢酶（LDH）释放^测定6、阿拉马尔蓝^测定7、钙化乙氧甲基酯（AM）8、ATP^测定9。所有这些测定测量细胞代谢的各个方面，可以作为细胞数的代理。虽然所有提供的好处， 四氧化二氮盐基的测定，如 3-（4，5-二甲基硫硫-2-yl）-2，5-二苯四甲二甲二苯溴化 （MTT）， 2，3-bis （2-甲基-4-硝基-5-磺胺）-2H-四氧化二氮-5-卡博基尼酰胺内盐 （XTT）-1Iodophenyl®-2-[4-硝基]-2H-5-四聚二代）-1，3-苯二苯二醇（WST-1）10，11以低成本提供良好的精度和易用性。MTT，将被用于这个演示，通过线粒体还原酶减少到不溶性对马赞，这种转换率与细胞数密切相关。这种测定在小规模和筛选库与多达2000个^化合物12常规使用。通过标记标记直接计数细胞提供了另一种评估细胞数的方法，与 MTT 测定不同，它可以提供有关细胞生长动态的其他信息。几个公开可用的算法可用于执行自动细胞计数分析，还有专有算法，是成像读取^器13，14的软件包的一部分。在此方法描述中，经过基因编辑的人类神经干细胞 （NSC）^行将用作测试线，用于比较 MTT 测定和自动细胞计数之间的细胞存活结果在屏幕中评估57种试验化合物的毒性。虽然这项战略的主要目标是识别和鉴定有毒化合物，但它具有潜在识别生长抑制和生长增强化合物的额外益处，从而为识别药物提供了一种有效的方法可以调节细胞生长。

研究方案

1. NSC 文化

注: 操作人类 NSC 线将在下面描述，但任何细胞系可用于此协议。所有细胞培养工作都在生物安全柜中进行。

1. 用基底膜/细胞外基质 （ECM） 涂覆 96 孔板。
   1. 解冻ECM（材料表），方便在冰上连接NSC。将 ECM 稀释到 10 mL 基介质（材料表）中的适当浓度（一般为 1:100），并在 96 孔板的 60 口内部井中每口加 50 μL（图 1）。仅使用内部 60 口井，以避免边缘效果¹⁶可能导致的伪影。
   2. 让板在室温下或细胞培养箱（37°C，5%CO_2）至少30分钟。
2. 分离和板神经干细胞。
   注:用于此方法的细胞应在 T75 烧瓶中生长到至少 80% 汇合。
   1. 在NSC培养基中，T75烧瓶中的培养细胞在37°C和5%CO2中培养细胞，由基培养基培养基、B27、非必需氨基酸、2 mM谷氨酰胺和10纳克/mL基本纤维细胞生长因子（FGFb或FGF2）组成。
   2. 一旦细胞达到80%的汇合，从培养箱中取出细胞，并吸出NSC培养基。加入适量的细胞分离试剂（T75烧瓶为3 mL）;材料表）并在孵化器中孵育5分钟。
   3. 孵育后，在T75烧瓶中加入7mL的NSC培养基，并大力移液器，以确保所有细胞分离。分离细胞溶液转移到15 mL管和离心机在200 x g5分钟。
   4. 离心后，从管中取出上清液，在10 mL的NSC培养基和计数细胞中重新悬浮细胞。
   5. 使用NSC培养基将细胞浓度调整至200，000个细胞/mL。确保电池完全重新悬浮，以便均匀电镀到井中。
   6. 在三个 96 孔板的 60 个内部孔中，将细胞混合物（20，000 个细胞）的板 100 μL 板，如第 1.1 节所述。使用 8 通道多通道移液器的 8 个插槽中的 6 个逐列板单元。
   7. 在无细胞的情况下，在所有井中加入100 μL的基础介质或NSC介质，以尽量减少最外层油井的潜在蒸发。
   8. 在细胞培养显微镜下，目视检查三个96孔板上每个至少10口孔，以确认细胞是在预期密度下播种的。如果细胞的镀层密度过于稀疏或密集，请勿继续测定。

2. 用化合物治疗细胞

注:本演示中测试的自制库包含调节无翼/集成（Wnt）、视黄酸、转化生长因子-β（TGF-+）和声波刺猪信号通路以及各种酪氨酸激酶的化合物。

1. 毒性/细胞数的探索性初级屏幕
   1. 在浓度为 100% 二甲基亚硫酸盐 （DMSO）的浓度为 10 mM 的 50–100 mL 中，将 50~100 mL 的 50-100 mL 与三个 DMSO 孔作为对照的 U 型、V 型底或圆底 96 孔板的内 60 孔中（参见图1用于板图）。这将作为主复合板与25 μL的化合物，可以冻结和解冻几次。
      注:不应使用平底板，因为使用台面移液器从它们中吸收少量化合物会更加困难。
   2. 按照第 1 节所述，在分解后从培养箱 16-24 h 中取出细胞培养板，并使用 8 个多孔槽中的 6 个，用 8 个多孔槽中的 6 个逐列从 NSC 中柱上吸出。在三个复制板中向细胞中加入 95 μL 的新鲜 NSC 培养基，并将板放回培养箱中，直到完成下面的步骤 2.1.4。
   3. 将 49 μL 的 NSC 介质添加到每个内部 60 孔中，该孔为空 U 型底、V 底或圆底 96 孔板，带 8 通道多孔移液器。解封主复合板，并使用台面移液器或等效仪器将主板中的 1 μL 化合物移液器移液到内部 60 个孔中 NSC 介质的 49 μL 中。
   4. 将稀释的化合物 3x 与台面移液器混合。
   5. 从培养箱中取出三个 96 孔 NSC 板，用台面移液器将每个稀释化合物的移液器 15 μL，并将 5 μL 等分的化合物分到三个板中。
      注:将化合物稀释到细胞中的1:20与步骤2.1.3中最初的1:50稀释相结合，产生1:1000稀释，使NSC上化合物的最终浓度为10μM，DMSO浓度为0.1%，最终浓度为0.1%DMSO 控制装置的浓度将为 0.1%。
   6. 用化合物孵育细胞72小时，进行细胞毒性测定。可以使用较短的间隔，但 72 小时的潜伏期应最大程度地扩大被测试化合物的潜在细胞毒性效应。
2. 剂量反应测定
   注:用于剂量反应的96井的设置如图2所示。
   1. 使用列 2 进行六次 DMSO 对照复制，并测试最多三种不同化合物的三重，以六种剂量以六种剂量进行，从高剂量为 10 μM。
   2. 在1.5 mL微离心管中将DMSO的4μL或DMSO中的测试化合物稀释到196 μL的NSC介质中。将 25 μL 的 DMSO 添加到 B2-G2 的井柱和 50 μL 的测试化合物到 B3-B11 的行中，在 B3-B5、B6-B8 和 B9-B11 行中的三种测试化合物在 10 mM 三元中。
   3. 将 NSC 介质的移液器 25 μL 移至 96 孔板内部部分的剩余空柱。使用多通道移液器从井 B3-B11 中取出 25 μL 的化合物，加入油井 C3-C11，并混合至少 5 次。重复其余行的过程，以两倍稀释产生三重剂，每个化合物共六剂。
   4. 生成剂量响应的 NSC，与第 2.1 节中的主屏幕描述完全一样。剂量反应的化合物被添加到细胞中并孵育，与步骤2.1.5和2.1.6中所述完全一样。
      注:剂量反应测定的三个生物复制是通过在不同日期在不同通道上重复NSCs的测定。

3. 板读取器上的成像单元

1. 在分配时间内用化合物孵育细胞后，在板读取器上图像细胞以确定每孔的预处理细胞数。
   注:成像单元的说明是特定于读取器的，但通常遵循类似的策略。以下说明适用于本演示中使用的读者（材料表）。
2. 从培养箱中取出板并将其放入板式读卡器内。打开成像器软件，为研究设置协议和实验文件。转到任务管理器上的成像器手动模式，然后单击"立即捕获..."。
3. 选择 96 孔板作为容器类型，选择 10 倍放大，红色荧光蛋白 （RFP） 531 和 593 用于成像 tdTomato。选择井，然后单击"自动对焦"以对焦图像，然后单击"自动曝光"以获得适当的曝光时间。如果需要，请手动调整对焦和曝光。
4. 获得正确对焦和曝光后，单击相机图标以捕获图片。然后单击图像上方的"处理/ANALZYE"以继续构建协议并选择"分析"选项卡。
5. 单击图像右侧的 ADD 分析步骤中的细胞分析，然后单击"开始"。图像将显示突出显示的单元格，以指示每个单独的单元格。可以单击"选项"选项以更改参数，以便根据荧光阈值或细胞大小更好地选择细胞。如果成像器正确计数单元格，请单击屏幕底部的"添加步骤"。
6. 单击屏幕顶部的图标，从图像集创建实验，这将打开一个包含实验的窗口。打开后，单击"协议"选项卡下的过程，并在打开"读取"的新窗口中单击"读取"，然后在新窗口中单击完整板以仅选择包含单元格的 60 口井（B2 ...G11）。单击"确定"以保存更改，然后在"过程"窗口中单击"确定"。
7. 现在，该板可以按此协议进行成像，并可以保存实验文件。单击播放图标以运行板。第一个板成像后，对另外两个板进行成像。完成成像后，将细胞计数数据下载到电子表格进行分析。以 10 倍放大倍率拍摄所有图像。

4. 端子 MTT 细胞毒性测定

注:在完成tdTomato成像后两小时内开始MTT测定。

1. 通过称出 25 mg MTT 并将其重新悬浮在 5 mL 的 NSC 介质中，制作出 5 mg/mL MTT 库存溶液。涡旋溶液，直到MTT没有明显的沉淀，这可能需要几分钟。
2. 从培养箱中取出细胞培养板，从细胞培养基体中吸出。在细胞培养基中稀释MTT1:10，并在每个细胞孔中加入100μL的MTT。
3. 在37°C孵育细胞2小时。紫紫沉淀物应大致与井中的细胞数量成比例可见。将 MTT 溶液从板上吸出，或快速反转板以轻拂板溶液。
4. 在每个孔中加入 50 μL 的 100% DMSO，并在室温下在 400 rpm 下摇动板 10 分钟。在板式读取器中读取每个孔在 595 nm 处的吸光度，并将数据导出到电子表格进行分析。

5. 数据分析

1. 使用适当的软件（商业电子表格，R）对tdTomato细胞计数和吸收率进行分析。为了规范化目的，计算每个板上三个 DMSO 复制的吸收率或单元计数的平均值，然后将板上每个孔的单元计数或吸光值的值除以此平均值，并转换为百分比。这产生每个板相对于 DMSO 控制的归化单元计数或吸收率。
2. 计算三个板上复制孔的平均标准化计数或吸光度和标准偏差。
   注: 此时应该有四组不同的规范化值:每个板一个，三个复制板一个均值。
3. 保守，对三个复制板的平均值使用在25%或以下的标准化值，将化合物分类为有毒化合物。此外，由于每个板仅对每种化合物进行一次处理，因此在所有三个复制板上，只有低于此阈值的化合物才会被标记为有毒。检查此分析过滤为毒性以直观地确认毒性的所有化合物的荧光图像。
   注:由于每个板材上缺乏复制物，因此在此类探索性测定中更难评估具有生长抑制或生长增强作用的化合物的鉴定。然而，以下是识别可能减缓或增强细胞生长的化合物的快速方法。
4. 计算每个板上三个复制 DMSO 控件的标准偏差，然后筛选平均值至少两个高于或低于 DMSO 控件的化合物。三个板中每个板上都从该过滤器中脱落的化合物可能需要进一步调查。
5. 对剂量反应使用与主要毒性筛查相同的分析策略。计算每个生物复制的 DMSO 控件的平均值，并使用这些值来标准化每个化合物/剂量组合的活细胞百分比或吸收百分比。计算三种生物复制的所有化合物/剂量组合的均值和标准误差。
6. 将浓度转换为其对数值，为浓度与标准化可行性的日志生成剂量响应曲线，并将曲线与非线性回归分析拟合（分析可在 R 或各种商业统计中执行）包）。计算致命剂量50（或技术上在本例中为可行剂量50）或化合物浓度，从该曲线的方程中产生50%的毒性。许多软件包将自动计算此数字。

结果

当归一化为DMSO对照时，自动细胞计数数据识别了11种存活率低于25%的化合物，而MTT数据识别了这些相同的化合物，另外两种化合物（表1和表2，红色）。仅在MTT测定（油井F3和G10）中发现有毒的两种化合物分别有31%和39%，作为对照和按等级顺序排列的tdTomato阳性细胞的数量是本库中仅次于那些被认为有毒的后两种毒性最大的化合物。这两个孔的标准偏差值并不表示在三个板...

讨论

本文的主要目标是描述一种策略，该策略可以高效、廉价地识别在低通量到中度筛选中影响细胞生长的化合物。使用两种正交技术来评估细胞数量，以提高对结论的信心，并提供如果只使用一次测定就无法提供的其他见解。其中一种检测使用荧光细胞成像器直接计数tdTomato阳性细胞，第二种检测依赖于线粒体将MTT切向非马扎人，从而作为^细胞10的代理。在这次演示中，共评估了57?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27 (50X)	ThermoFisher Scientific	17504001	Neural stem cell medium component.
BenchTop pipettor	Sorenson Bioscience	73990	Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.
BioLite 96 well multidish	Thermo Scientific	130188	Any 96 well cell culture plate will work.  We use these in our work.
Cell culture microscope	Nikon	Eclipse TS100	Visual inspection of cells to ensure proper density.
Cytation 5/ Imaging reader	BioTek	CYT3MFV	Used for cell imaging and absorbance readings.
DMSO	Fisher Scientific	610420010	Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.
FGF-basic	Peprotech	100-18B	Neural stem cell medium component.
GelTrex	ThermoFisher Scientific	A1413202	Neural stem cell basement membrane matrix.  Allows cells to attach to cell culture plates.
Gen5 3.04	BioTek		Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.
Glutamine	ThermoFisher Scientific	25030081	Neural stem cell medium component.
Microtest U-Bottom	Becton Dickinson	3077	Storage of compound libraries.
MTT	ThermoFisher Scientific	M6494	Active assay reagent to determine cellular viability.
Multichannel pippette	Rainin	E8-1200	Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.
Neurobasal medium	ThermoFisher Scientific	21103049	Neural stem cell base medium.
RFP filter cube	BioTek	1225103	Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.
TrypLE	ThermoFisher Scientific	12605036	Cell dissociation reagent.