Стратегия по выявлению соединений, влияющих на рост клеток и выживаемость в культурных клетках млекопитающих при низкой до умеренной пропускной связи

Резюме

Часто необходимо оценить потенциальную цитотоксичность набора соединений на культивированных клетках. Здесь мы описываем стратегию надежного скрининга токсичных соединений в формате 96 скважин.

Аннотация

Цитотоксичность является критическим параметром, который должен быть количественно при изучении препаратов, которые могут иметь терапевтические преимущества. Из-за этого, многие анализы скрининга наркотиков использовать цитотоксичность в качестве одной из критических характеристик, которые будут профилированы для отдельных соединений. Клетки в культуре являются полезной моделью для оценки цитотоксичности, прежде чем приступить к последующей деятельности по перспективным свинца соединений в более дорогостоящих и трудоемких моделей животных. Мы описываем стратегию по выявлению соединений, которые влияют на рост клеток в tdTomato, выражающей линию стволовых клеток человека (NSC). Стратегия использует два дополнительных анализа для оценки числа клеток. Один асссеработает работает через уменьшение 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-дифениltэттрацололий бромид (МТТ) в formazan в качестве прокси для номера ячейки, а другой непосредственно рассчитывает tdTomato выражая NSCs. Два анализа могут быть выполнены одновременно в одном эксперименте и не являются трудоемкими, быстрыми и недорогими. Стратегия, описанная в этой демонстрации, протестировала 57 соединений на исследовательском первичном экране на токсичность в 96-колодцном формате пластины. Три из хитов были охарактеризованы далее в шести точках доза ответ с использованием той же настройки ассея, как основной экран. В дополнение к обеспечению отличного подтверждения токсичности, сравнение результатов двух анализов может быть эффективным в выявлении соединений, влияющих на другие аспекты роста клеток.

Введение

Одной из наиболее важных характеристик, которая должна быть определена для химического соединения, которое имеет терапевтический потенциал является его токсичность для клеток животных. Эта характеристика будет определять, является ли препарат хорошим кандидатом для более обширного исследования. В большинстве случаев, соединения с минимальной токсичностью ищутся, но Есть ситуации, в которых соединение с возможностью убить конкретных типов клеток представляет интерес, например, противоопухолевые препараты. Хотя целые животные являются лучшими модельными системами для определения системной токсичности, затраты и рабочая сила, связанные с этим, являются непомерно высокими, когда необходимо протестировать более нескольких соединений. Как таковой культуры клеток млекопитающих, как правило, используется в качестве наиболее эффективной альтернативой^1,2. Малые и средние экраны пропускной способностью наркотиков являются важным способом, с помощью которого токсичность может быть оценена в культуре клеток. Эти экраны могут быть использованы для допроса аннотированных библиотек, ориентированных на отдельные сигнальные пути. Общий формат такого экрана заключается в том, чтобы сначала проверить все соединения в библиотеке в одной дозе (как правило, 10 мкм) в исследовательском первичной токсичности экрана, а затем выполнить углубленный вторичный экран реакции дозы, чтобы полностью охарактеризовать токсичность профиль хитов с основного экрана. Методы реализации этой стратегии будут описаны здесь и обеспечивают быстрый, эффективный и недорогой способ выявления и характеристики токсичных соединений.

Несколько методов были разработаны для оценки цитотоксичности малых соединений и наноматериалов в клетках млекопитающих^3,4. Следует отметить, что некоторые материалы могут взаимодействовать с проверкой, обеспечивающей вводящие в заблуждение результаты, и такие взаимодействия должны быть проверены при характеристике хитов от токсичности экранов⁴. Анализы цитотоксичности включают trypan синий исключение^5,лактат дегидрогеназы (LDH) релиз анализ⁶, Аламар синий анализ⁷, кальцийет ацетоксиметил эфир (AM)⁸, и АТФ анализ⁹. Все эти анализы измеряют различные аспекты клеточного метаболизма, которые могут служить прокси для номера ячейки. В то время как все предлагают преимущества, тетразолий соли на основе assays, таких как 3-(4,5-диметилтизол-2-yl)-2,5-дифенилтетрацололий бромид (MTT), 2,3-бис (2-метокси-4-нитро-5-сульфофени)-2H-тетролийт-5-5-car-2 и 4-(3-4- Иодофенил-2-4-нитрофенил-2H-5-тетразолио)-1,3-бензола дисульфоната (WST-1)^10,11 обеспечивают хорошую точность и простоту использования при низкой цене. MTT, который будет использоваться в этой демонстрации, сводится к нерастворимым formazan митохондриальной редуктазы и скорость этого преобразования сильно коррелирует с номером ячейки. Этот анализ регулярно используется как в небольших масштабах, так и для скрининговых библиотек с до 2000 соединений¹². Прямой подсчет клеток по маркированному маркеру предлагает другой метод оценки клеточного числа, и в отличие от mtT-оценки он может предоставить дополнительную информацию о динамике клеточного роста. Несколько общедоступных алгоритмов доступны для выполнения автоматизированного анализа количества клеток и Есть также собственные алгоритмы, которые являются частью пакетов программного обеспечения для изображений читателей^13,14. В этом описании метода, человеческая нейронная стволовая клетка (NSC) линия, которая была генетически отредактирована, чтобы составно выразить tdTomato¹⁵ будет служить в качестве тестовой линии для сравнения результатов клеточной жизнеспособности между MTT анализ и автоматизированный подсчет клеток анализ на экране оценки токсичности 57 испытательных соединений. Хотя основная цель этой стратегии заключалась в выявлении и характеристике токсичных соединений, она имеет дополнительное преимущество потенциального выявления ингибирующих и растущих соединений, усиливающих соединения и тем самым обеспечивающих эффективный метод идентификации лекарств которые могут модулировать клеточный рост.

протокол

1. Культура НСК

ПРИМЕЧАНИЕ: Манипуляция линии NSC человека будет описана ниже, но любая клеточная линия может быть использована для этого протокола. Вся работа клеточной культуры выполняется в кабинете биологической безопасности.

1. Пальто 96-хорошая пластина с мембраной подвала / внеклеточной матрицы (ECM).
   1. Оттепель aliquot ECM(Таблица материалов), которая будет способствовать креплению НСК, на льду. Разбавить ECM до соответствующей концентрации (как правило, 1:100) в 10 мл базовой среды(Таблица материалов)и добавить 50 л на колодец к каждому из 60 внутренних скважин 96-хорошо пластины (Рисунок 1). Используйте только внутренние 60 скважин, чтобы избежать артефактов, которые могут возникнуть в результате эффекта края¹⁶.
   2. Пусть пластина сидеть при комнатной температуре или в инкубаторе культуры клеток (37 кв.к., 5% CO₂) в течение по крайней мере 30 мин.
2. Диссоциатив ные и пластины нервных стволовых клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки для использования в этом методе должны быть выращены, по крайней мере 80% слияния в колбе T75.
   1. Культурные клетки в колбе T75 в инкубаторе клеточной культуры при 37 КС и 5% CO₂ в среде NSC, которая состоит из базовой среды, B27, несущественных аминокислот, 2 ММ глутамина и 10 нг/мЛ базового фактора роста фибробластов (FGFb или FGF2).
   2. Удалить клетки из инкубатора, как только они достигают 80% слияния и аспирировать от NSC среды. Добавьте соответствующее количество реагента диссоциации клеток (3 мл для колбы T75; Таблица материалов) и инкубировать в течение 5 мин в инкубаторе.
   3. После инкубации, добавить 7 мл среды NSC в t75 колбу и пипетки энергично, чтобы обеспечить все клетки становятся отделены. Перенесите диссоциированный клеточный раствор на трубку 15 мл и центрифугу на 200 х г в течение 5 мин.
   4. После центрифугирования, удалить супернатант из трубки и resuspend клеток в 10 мл ЦСК средних и рассчитывать клетки.
   5. Переговочная концентрация клеток до 200 000 клеток/мл со средой НСК. Убедитесь, что клетки полностью переосвязны для однородного покрытия в колодцы.
   6. Плита 100 л клеточной смеси (20 000 клеток) в 60 внутренних колодцах из трех 96-колодцев, которые были покрыты, как описано в разделе 1.1. Используйте шесть из восьми слотов 8-канального многоканального пипетатора для столбца ячеек пластин.
   7. Добавьте 100 л базовой среды или среды NSC ко всем скважинам без клеток, чтобы свести к минимуму потенциальное испарение из внешних скважин.
   8. Под микроскопом клеточной культуры, визуально осмотреть по крайней мере 10 скважин на каждом из трех 96-колодец пластин, чтобы подтвердить, что клетки посеяны при ожидаемой плотности. Не приступайте к проверке, если клетки покрыты при плотности слишком разреженной или плотной.

2. Лечение клеток соединениями

ПРИМЕЧАНИЕ: Самодельная библиотека, протестированная в этой демонстрации, содержит соединения, которые модулируют бескрылые/интегрированные (Wnt), ретиноиновой кислоты, трансформирующие фактор роста-бета (TGF-я), и звуковой еж сигнализации пути, а также различные тирозиновые киназы.

1. Исследовательский первичный экран для токсичности /номер ячейки
   1. Aliquot 50-100 мл до 57 испытательных соединений(Дополнительная таблица 1) при концентрации 10 мМ в 100% диметилсульфод (DMSO) в интерьер 60 скважин U-bottomed, V-bottomed или круглогодичной пластины 96-ну ульс с тремя DMSO скважины, как контроль (см. Рисунок 1 для карты пластин). Это будет служить в качестве основной пластины соединения с 25 зл соединения, которые могут быть заморожены и разморожены несколько раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плоские плиты сдном не должны использоваться, так как будет труднее аспирировать небольшие объемы соединений из них со скамейкой сверху пипетки.
   2. Удалите пластины культуры клеток из инкубатора 16-24 ч после расщепления, как описано в разделе 1, и аспирировать с NSC среднего столбца за колонной с 8-канальный многослойный пипеттор, используя только шесть из восьми многоколодцв слотов. Добавьте 95 qL свежих sSC средних к клеткам в каждой из трех пластин репликации и поместите пластины обратно в инкубатор до шага 2.1.4 ниже не будет завершена.
   3. Добавьте 49 qL среды NSC к каждой из внутренних 60 скважин пустого U-дна, V-дном или круглого дна 96-колодской пластины с 8-канальным многослойным пипеттором. Распечатайте мастерскую смеску пластины и используйте верхний пипетки или эквивалентный инструмент для пипетки 1 злицы соединения из главной пластины в 49-ю часть среды НСК в каждой из 60 скважин.
   4. Смешайте разбавленное соединение 3x со скамейкой верхней пипетатор.
   5. Удалите три 96-колодчатые пластины NSCs из инкубатора, пипетку 15 л каждого разбавленного соединения со скамейкой верхней пипетки и распределить 5 qL аликот соединения в каждой из трех пластин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это 1:20 разбавления соединения в клетки в сочетании с первоначальным 1:50 разбавления в шаге 2.1.3 дает 1:1000 разбавления таким образом, что окончательная концентрация соединений на NSCs будет 10 КМ с концентрацией DMSO 0,1% и окончательное концентрация для контроля DMSO составит 0,1%.
   6. Инкубировать клетки с соединением для 72 h и продолжить с анализами цитотоксичности. Более короткие интервалы могут быть использованы, но 72-часовой инкубационный период должен максимизировать потенциальные цитотоксические эффекты проверенных соединений.
2. Доза ответ асссе
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка для 96-хорошо используется для дозы-ответ отображается на рисунке 2.
   1. Используйте колонку 2 для шести репликаторов управления DMSO и тестовых трипликетов до трех различных соединений при двукратных серийных разбавлениях в шести дозах, начиная с высокой дозы 10 км.
   2. Разбавить 4 Л ДМСО или испытательного соединения в ДМСО в 196 л среды НСК в микроцентрифуговой трубке 1,5 мл. Добавьте 25 кЛ DMSO к столбку скважин из B2-G2 и 50 зл испытательных соединений к ряду от B3-B11 с тремя проверенными соединениями в трипликатах 10 мМ в рядах B3-B5, B6-B8 и B9-B11.
   3. Пипетка 25 л среднего к оставшимся пустым колоннам во внутренней части 96-колодца пластины. Удалить 25 л соединения из скважин B3-B11 с многоканальным пипеттором, добавить в скважины C3-C11, и перемешать по крайней мере пять раз. Повторите процесс для остальных строк для генерации трипликетов при двукратных разбавлениях в общей сложности шесть доз для каждого из соединений.
   4. Создание NSCs для дозы ответ точно так, как описано для первичного экрана в разделе 2.1. Соединения для реакции дозы добавляются и инкубируются на клетках точно так, как описано в шагах 2.1.5 и 2.1.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Три биологические репликации дозы ответ асссы выполняются путем повторения ассеина на NSCs в различных проходах в отдельные дни.

3. Изображения клеток на плите читателя

1. После того, как клетки были инкубированы соединениями в отведенное время, клетки изображения на считывателе пластины, чтобы определить предобработку номер клетки на хорошо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции для визуализации клеток читателей, но в целом следовать аналогичной стратегии. Направления ниже применяются к читателю, используемому в этой демонстрации (Таблица материалов).
2. Снимите пластину с инкубатора и поместите ее в считыватель пластины. Откройте программное обеспечение для создания файлов-протоколов и экспериментов для исследования. Перейти к Imager Ручной режим на менеджер задач и нажмите Захват сейчас ....
3. Выберите 96-хорошую пластину в качестве типа сосуда, выберите 10x для увеличения, и красный флуоресцентный белок (RFP) 531 и 593 для визуализации tdTomato. Выберите хорошо, а затем нажмите Автофокус, чтобы сфокусировать изображение, и авто экспозиция для надлежащего времени экспозиции. При необходимости вручную отрегулируйте фокус и экспозицию.
4. После того, как надлежащее внимание и экспозиция были получены, нажмите значок камеры, чтобы захватить картину. Затем щелкните PROCESS/ANALZyE выше изображения, чтобы продолжить создание протокола и выберите вкладку ANALYSIS.
5. Нажмите Сотовый анализ в ADD ANALYSIS STEP справа от изображения и нажмите НА START. Изображение покажет выделенные ячейки, чтобы указать каждую отдельную ячейку. Выбор опций может быть нажат, чтобы изменить параметры, чтобы лучше выбрать клетки на основе порога флуоресценции или размера ячейки. Если изображение правильно подсчитывает ячейки, нажмите ADD STEP в нижней части экрана.
6. Нажмите значок в верхней части экрана, чтобы создать эксперимент из набора изображений,который откроет окно с экспериментом. После открытия, нажмите Процедура под вкладкой Протокола и в новом окне, которое открывается выберите Читать, затем в новом окне нажмите полную пластину, чтобы выбрать только 60 скважин, которые содержат клетки (B2... G11). Нажмите OK, чтобы сохранить изменения, а затем нажмите OK в окне процедуры.
7. Пластина теперь может быть отображана этим протоколом, и экспериментальный файл может быть сохранен. Нажмите значок воспроизведения, чтобы запустить пластину. После того, как первая пластина была изображена, изображение двух других пластин. После завершения изображения загрузите данные подсчета ячеек в электронную таблицу для анализа. Возьмите все изображения при 10-х увеличениях.

4. Терминал MTT цитотоксичность асссы

ПРИМЕЧАНИЕ: Начните анализ MTT в течение двух часов после завершения tdTomato изображений.

1. Сделать 5 мг /мл МТТ фондовый раствор, взвешивая 25 мг МТТ и resuspending его в 5 мл среды НСК. Vortex решение до тех пор, пока Нет видимых осадков MTT, который может занять несколько минут.
2. Удалите пластины культуры клеток из инкубатора и аспирировать среды клеточной культуры. Разбавить МТТ 1:10 в среде клеточной культуры и добавить 100 л МТТ к каждой скважине клеток.
3. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию на 2 ч. Пурпурный осадок должен быть виден примерно пропорционально количеству клеток в колодце. Либо аспирировать решение MTT от пластин или инвертировать пластины быстро Флик решение из пластины.
4. Добавьте 50 кв.м. 100% ДМСО к каждой скважине и встряхните пластины при комнатной температуре в течение 10 минут при 400 об/мин. Прочитайте абсорбцию каждой скважины на уровне 595 нм в считывателе пластин и экспортите данные в электронную таблицу для анализа.

5. Анализ данных

1. Выполните анализ количества клеток tdTomato и абсорбции с соответствующим программным обеспечением (коммерческая таблица, R). Рассчитайте средние значения для абсорбции или количества клеток трех репликаций DMSO на каждой пластине для целей нормализации, а затем разделите значение для клеточных отсчетов или абсорбции для каждой скважины на пластине этим средним значением и преобразуйте в процент. Это дает нормализованное количество клеток или абсорбции по отношению к контролю DMSO для каждой пластины.
2. Рассчитайте среднее нормализованное количество или абсорбцию и стандартное отклонение для репликации скважин на трех пластинах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент должно быть четыре различных набора нормализованных значений: по одному для каждой из пластин и одно среднее для трех пластин репликации.
3. Будьте консервативны и использовать нормализованное значение на уровне или ниже 25% в среднем через три репликации пластин классифицировать соединение как токсичные. Кроме того, поскольку только одна обработка на соединение выполняется на каждой пластине, только этикетки соединений, которые опадают ниже этого порога на всех трех пластин репликации, как токсичные. Изучите флуоресцентные изображения всех соединений, которые этот анализ фильтрует как токсичные для визуального подтверждения токсичности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификация соединений с ингибирующим эффектом роста или усиливающим рост труднее оценить в исследовательском исследовании этого типа из-за отсутствия репликаций на каждой пластине. Тем не менее, следующий быстрый способ выявления соединений, которые могут либо замедлить или повысить клеточный рост.
4. Рассчитайте стандартное отклонение для трех реплицитных элементов управления DMSO на каждой пластине, а затем отфильтруйте для любых соединений, которые имеют средние значения по крайней мере два стандартных отклонения выше или ниже управления DMSO. Соединения, которые выпадают из этого фильтра на каждой из трех пластин может потребовать дальнейшего исследования.
5. Используйте ту же стратегию анализа для реакции дозы в качестве первичного экрана токсичности. Рассчитайте средние значения для управления DMSO для каждой биологической репликации и используйте эти значения для нормализации процентных живых клеток или процентов абсорбции для каждого соединения/ дозы комбинации. Рассчитайте средства и стандартную ошибку средств для всех комбинаций соединений/доз для трех биологических репликатов.
6. Преобразуйте концентрацию в значение журнала, создайте кривую реакции дозы для журнала концентрации по сравнению с нормализованной жизнеспособностью, и всоответствива кривой с нелинейным регрессионным анализом (анализ может быть выполнен в R или различных коммерческих статистических пакеты). Рассчитайте смертельную дозу 50 (или технически в этом случае жизнеспособную дозу 50) или концентрацию соединения, что приводит к 50% токсичности от уравнения этой кривой. Многие пакеты программного обеспечения будут автоматически вычислять эту цифру.

Результаты

Автоматизированные данные подсчета ячеек определили одиннадцать соединений с менее чем 25% жизнеспособностью при нормализации управления DMSO, в то время как данные MTT определили эти же соединения плюс два дополнительных(таблица 1 и таблица 2, затененный красный). Два со?...

Обсуждение

Основная цель этой статьи состояла в том, чтобы описать стратегию, которая могла бы эффективно и недорого определить соединения, влияющие на рост клеток в низкой и умеренной пропускной связи скрининга. Два ортогоналовых метода были использованы для оценки числа клеток, чтобы повысить ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27 (50X)	ThermoFisher Scientific	17504001	Neural stem cell medium component.
BenchTop pipettor	Sorenson Bioscience	73990	Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.
BioLite 96 well multidish	Thermo Scientific	130188	Any 96 well cell culture plate will work.  We use these in our work.
Cell culture microscope	Nikon	Eclipse TS100	Visual inspection of cells to ensure proper density.
Cytation 5/ Imaging reader	BioTek	CYT3MFV	Used for cell imaging and absorbance readings.
DMSO	Fisher Scientific	610420010	Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.
FGF-basic	Peprotech	100-18B	Neural stem cell medium component.
GelTrex	ThermoFisher Scientific	A1413202	Neural stem cell basement membrane matrix.  Allows cells to attach to cell culture plates.
Gen5 3.04	BioTek		Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.
Glutamine	ThermoFisher Scientific	25030081	Neural stem cell medium component.
Microtest U-Bottom	Becton Dickinson	3077	Storage of compound libraries.
MTT	ThermoFisher Scientific	M6494	Active assay reagent to determine cellular viability.
Multichannel pippette	Rainin	E8-1200	Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.
Neurobasal medium	ThermoFisher Scientific	21103049	Neural stem cell base medium.
RFP filter cube	BioTek	1225103	Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.
TrypLE	ThermoFisher Scientific	12605036	Cell dissociation reagent.