Une stratégie visant à identifier les composés qui affectent la croissance et la survie des cellules mammifères cultivées à un débit faible à modéré

Résumé

Il est souvent nécessaire d'évaluer la cytotoxicité potentielle d'un ensemble de composés sur les cellules cultivées. Ici, nous décrivons une stratégie pour dépister de façon fiable les composés toxiques dans un format de 96 puits.

Résumé

La cytotoxicité est un paramètre critique qui doit être quantifié lors de l'étude des médicaments qui peuvent avoir des avantages thérapeutiques. Pour cette raison, de nombreux tests de dépistage de médicaments utilisent la cytotoxicité comme l'une des caractéristiques critiques à profiler pour les composés individuels. Les cellules en culture sont un modèle utile pour évaluer la cytotoxicité avant de procéder à un suivi des composés de plomb prometteurs dans des modèles animaux plus coûteux et à forte intensité de main-d'œuvre. Nous décrivons une stratégie pour identifier les composés qui affectent la croissance cellulaire dans une ligne de cellules souches neurales humaines (NSC) de tdTomato exprimant. La stratégie utilise deux essais complémentaires pour évaluer le nombre de cellules. Un exemple fonctionne par la réduction de 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromure (MTT) à formazan comme un proxy pour le nombre de cellules et l'autre compte directement le tdTomato exprimant NSCs. Les deux essais peuvent être effectués simultanément dans une seule expérience et ne sont pas laborieux, rapide et peu coûteux. La stratégie décrite dans cette démonstration a testé 57 composés dans un écran primaire exploratoire pour la toxicité dans un format de plaque de 96 puits. Trois des coups ont été caractérisés plus loin dans une réponse de dose de six points utilisant la même configuration de bout-de-vente que l'écran primaire. En plus de fournir une excellente corroboration pour la toxicité, la comparaison des résultats des deux essais peut être efficace pour identifier les composés affectant d'autres aspects de la croissance cellulaire.

Introduction

Une des caractéristiques les plus importantes qui doit être déterminée pour un composé chimique qui a un potentiel thérapeutique est sa toxicité pour les cellules animales. Cette caractéristique déterminera si un médicament est un bon candidat pour une étude plus approfondie. Dans la plupart des cas, des composés avec une toxicité minimale sont recherchés, mais il ya des situations dans lesquelles un composé avec la capacité de tuer des types de cellules spécifiques est d'intérêt, par exemple, les médicaments anti-tumorigènes. Bien que les animaux entiers soient les meilleurs systèmes modèles pour déterminer la toxicité systémique, le coût et la main-d'œuvre impliqués sont prohibitifs lorsque plus de quelques composés doivent être testés. En tant que telle culture de cellules de mammifères est généralement utilisé comme l'alternative la plus efficace^1,2. Les écrans de drogue de petit à moyen débit sont une modalité importante par laquelle la toxicité peut être évaluée dans la culture cellulaire. Ces écrans peuvent être utilisés pour interroger les bibliothèques annotées ciblant les voies de signalisation individuelles. Le format général d'un tel écran est d'abord de tester tous les composés de la bibliothèque à une seule dose (généralement 10 M) dans un écran de toxicité primaire exploratoire, puis d'effectuer un écran de réponse de dose secondaire en profondeur pour caractériser pleinement la toxicité profil des hits de l'écran principal. Les méthodes de mise en œuvre de cette stratégie seront décrites ici et fourniront un moyen rapide, efficace et peu coûteux d'identifier et de caractériser les composés toxiques.

Plusieurs méthodes ont été développées pour évaluer la cytotoxicité des petits composés et des nanomatériaux dans les cellules de mammifères^3,4. Il convient de noter que certains matériaux peuvent interagir avec le test fournissant des résultats trompeurs, et de telles interactions doivent être testées lors de la caractérisation des coups des écrans de toxicité⁴. Cytotoxicity essais comprennent trypan exclusion bleue⁵, lactate dehydrogenase (LDH) test de libération⁶, Alamar bleu essai⁷, calcien acétooxymethyl ester (AM)⁸, et l'essai ATP⁹. Tous ces essais mesurent divers aspects du métabolisme cellulaire qui peuvent servir de proxy pour le nombre de cellules. Bien que tous offrent des avantages, tetrazolium sel à base d'essais tels que 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromure (MTT), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide sel intérieur (XTT)-1, et 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzene disulfonate (WST-1)^10,11 fournissent une bonne précision et une bonne facilité d'utilisation à faible coût. MTT, qui sera utilisé dans cette démonstration, est réduit à un formazan insoluble par une réductase mitochondriale et le taux de cette conversion est fortement corrélé avec le nombre de cellules. Cet exemple a été couramment utilisé à petite échelle et pour le dépistage des bibliothèques avec jusqu'à 2.000 composés¹². Le comptage direct des cellules par un marqueur étiqueté offre une autre méthode pour évaluer le nombre cellulaire, et contrairement à l'analyse MTT, il peut fournir des informations supplémentaires sur la dynamique de la croissance cellulaire. Plusieurs algorithmes accessibles au public sont disponibles pour effectuer des analyses automatisées du nombre de cellules et il existe également des algorithmes propriétaires qui font partie de progiciels pour les lecteurs d'imagerie^13,14. Dans cette description de méthode, une lignée de cellules souches neurales humaines (NSC) qui a été génétiquement modifiée pour exprimer de façon constitutive tdTomato¹⁵ servira de ligne d'essai pour comparer les résultats de viabilité cellulaire entre un essai de MTT et un comptage automatisé de cellules dans un écran évaluant la toxicité de 57 composés d'essai. Bien que l'objectif principal de cette stratégie était d'identifier et de caractériser les composés toxiques, elle a l'avantage supplémentaire d'identifier potentiellement les composés inhibiteurs de la croissance et la croissance et fournit ainsi une méthode efficace pour identifier les médicaments. qui peut moduler la croissance cellulaire.

Protocole

1. Culture NSC

REMARQUE : La manipulation d'une ligne NSC humaine sera décrite ci-dessous, mais n'importe quelle lignée cellulaire peut être utilisée pour ce protocole. Tous les travaux de culture cellulaire sont effectués dans un coffret de sécurité biologique.

1. Enrober une plaque de 96 puits avec la membrane du sous-sol/matrice extracellulaire (ECM).
   1. Dégel aliquot de ECM (Table of Materials), qui facilitera l'attachement de NSC, sur la glace. Diluer l'ECM à la concentration appropriée (généralement 1:100) dans le milieu de base de 10 ml (Tableau des matériaux) et ajouter 50 L par puits à chacun des 60 puits intérieurs d'une plaque de 96 puits (figure 1). Utilisez uniquement l'intérieur 60 puits pour éviter les artefacts qui peuvent résulter de l'effet de bord¹⁶.
   2. Laisser la plaque s'asseoir à température ambiante ou dans un incubateur de culture cellulaire (37 oC, 5 % de CO₂) pendant au moins 30 min.
2. Dissocier et plaquer les cellules souches neurales.
   REMARQUE : Les cellules utilisées dans cette méthode doivent être cultivées à au moins 80 % de confluence dans un flacon T75.
   1. Cellules de culture dans un flacon de T75 dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC et 5 % de CO₂ dans le milieu de NSC qui est composé du milieu de base, b27, acides aminés non essentiels, 2 mM de glutamine, et 10 ng/mL facteur de croissance de base de fibroblaste (FGFb ou FGF2).
   2. Retirez les cellules de l'incubateur une fois qu'elles atteignent 80% de confluence et aspirez hors du milieu NSC. Ajouter une quantité appropriée de réactif de dissociation cellulaire (3 ml pour un flacon T75; Tableau des matériaux) et incuber pendant 5 min dans l'incubateur.
   3. Après l'incubation, ajouter 7 mL de milieu NSC dans le flacon T75 et pipette vigoureusement pour s'assurer que toutes les cellules se détachent. Transférer la solution cellulaire dissociée dans un tube de 15 ml et une centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
   4. Après centrifugation, retirer le supernatant du tube et resuspendre les cellules dans 10 mL de cellules moyennes et de comptage NSC.
   5. Réajuster la concentration des cellules à 200 000 cellules/mL avec le milieu NSC. Assurez-vous que les cellules sont entièrement suspendues pour un placage homogène dans les puits.
   6. Plaque 100 l du mélange cellulaire (20 000 cellules) dans les 60 puits intérieurs de trois plaques de 96 puits qui ont été enduits comme décrit à la section 1.1. Utilisez six des huit fentes d'un tuyautte multicanal à 8 canaux pour plaquer les cellules colonne par colonne.
   7. Ajouter 100 L de milieu de base ou de milieu DeSC à tous les puits sans cellules afin de minimiser l'évaporation potentielle des puits les plus éloignés.
   8. Sous un microscope de culture cellulaire, inspectez visuellement au moins 10 puits sur chacune des trois plaques de 96 puits pour confirmer que les cellules sont ensecées à la densité prévue. Ne pas procéder à l'essai si les cellules sont plaquées à une densité trop clairsemée ou dense.

2. Traiter les cellules avec des composés

REMARQUE : La bibliothèque faite maison testée dans cette démonstration contient des composés qui modulent sans ailes/intégrés (Wnt), l'acide rétinoïque, transformant le facteur de croissance-bêta (TGF-MD), et les voies de signalisation sonic hedgehog ainsi qu'une variété de kinases tyrosines.

1. Écran primaire exploratoire pour la toxicité/numéro de cellule
   1. Aliquot 50 à 100 ml de jusqu'à 57 composés d'essai (tableau supplémentaire 1) à une concentration de 10 mm en sulfoxyde de diméthyle (DMSO) dans l'intérieur 60 puits d'une plaque de 96 puits à fond U, À fond V ou à fond rond avec trois puits DMSO comme contrôle (voir Figure 1 pour une carte de plaque). Cela servira de plaque composée principale avec 25 ll de composé qui peut être congelé et décongelé plusieurs fois.
      REMARQUE : Les plaques à fond plat ne doivent pas être utilisées car il sera plus difficile d'aspirer de petits volumes de composés à partir d'eux avec un tuyautteur de dessus de banc.
   2. Retirez les plaques de culture cellulaire de l'incubateur 16-24 h après le fractionnement décrit dans la section 1 et aspirez au large de NSC moyenne colonne par colonne avec un tuyautteur multi-puits à 8 canaux en utilisant seulement six des huit fentes multi-puits. Ajouter 95 l de milieu NSC frais à des cellules dans chacune des trois plaques de repli et remettre les plaques dans l'incubateur jusqu'à ce que l'étape 2.1.4 ci-dessous soit terminée.
   3. Ajouter 49 'L de nSC moyen à chacun des 60 puits intérieurs d'un vide à fond U, V-bottomed ou rond-fond 96-puits plaque avec un tuyautteur multi-puits à 8 canaux. Défermer la plaque composée principale et utiliser un tuyautte de présetupt ou un instrument équivalent à la pipette 1 l de composé de la plaque principale dans le milieu de 49 L de NSC dans chacun des 60 puits intérieurs.
   4. Mélanger le composé dilué 3x avec le tuyautteur de dessus de banc.
   5. Retirez les trois plaques de 96 puits de NSC de l'incubateur, pipette 15 'L de chaque composé dilué avec le tuyautte de dessus de banc et distribuez un aliquot de 5 l de composé dans chacune des trois plaques.
      REMARQUE: Cette dilution 1:20 de composé dans les cellules en combinaison avec la dilution initiale 1:50 à l'étape 2.1.3 donne une dilution 1:1000 de sorte que la concentration finale des composés sur les NSC sera de 10 M avec une concentration DMSO de 0,1% et la finale pour les contrôles DMSO sera de 0,1%.
   6. Incuber les cellules avec composé pendant 72 h et procéder à des essais de cytotoxicité. Des intervalles plus courts peuvent être utilisés, mais une période d'incubation de 72 heures devrait maximiser les effets cytotoxiques potentiels des composés testés.
2. Réponse dose d'assay
   REMARQUE : La configuration du puits 96 utilisé pour la dose-réponse est affichée dans la figure 2.
   1. Utilisez la colonne 2 pour six reproduits de commande DMSO et testez les tripliciats de jusqu'à trois composés différents à des dilutions sérielles doubles à six doses commençant par une dose élevée de 10 M.
   2. Diluer 4 l de DMSO ou d'essai composé dans DMSO en 196 'L de milieu NSC dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Ajoutez 25 L de DMSO à la colonne de puits de B2-G2 et 50 l de composés d'essai à la ligne de B3-B11 avec les trois composés testés dans des tripliciats de 10 mM en rangées B3-B5, B6-B8 et B9-B11.
   3. Pipette 25 'L de NSC moyen aux colonnes vides restantes dans la partie intérieure de la plaque de 96 puits. Retirer 25 l de composé des puits B3-B11 à l'égard d'un tuyautte multicanal, ajouter aux puits C3-C11 et mélanger au moins cinq fois. Répétez le processus pour les rangées restantes pour générer des triplicates à deux dilutions pour un total de six doses pour chacun des composés.
   4. Générer des CNS pour la réponse de la dose exactement comme décrit pour l'écran primaire dans la section 2.1. Les composés pour la réponse de dose sont ajoutés et incubés sur les cellules exactement comme décrit dans les étapes 2.1.5 et 2.1.6.
      REMARQUE : Trois répliques biologiques de l'assay de réponse de dose sont exécutées en répétant l'assay sur les NSC s'est produit à différents passages les jours séparés.

3. Cellules d'imagerie sur un lecteur de plaque

1. Après que les cellules ont été incubées avec des composés pour le temps imparti, les cellules d'image sur un lecteur de plaque pour déterminer le nombre de cellules de pré-traitement par puits.
   REMARQUE : Les instructions pour les cellules d'imagerie sont spécifiques au lecteur, mais suivent généralement une stratégie similaire. Les instructions ci-dessous s'appliquent au lecteur utilisé dans cette démonstration (Tableau des matériaux).
2. Retirez la plaque de l'incubateur et placez-la à l'intérieur du lecteur de plaque. Ouvrez le logiciel d'imageur pour configurer le protocole et les fichiers d'expérience pour l'étude. Passez au mode manuel Imager sur Task Manager et cliquez sur Capture maintenant....
3. Choisissez la plaque de 96 puits comme type de navire, sélectionnez 10x pour le grossissement, et la protéine fluorescente rouge (RP) 531 et 593 pour l'imagerie tdTomato. Choisissez un puits, puis cliquez sur Autofocus pour concentrer l'image, et Auto Expose pour le temps d'exposition approprié. Ajustez manuellement la mise au point et l'exposition si nécessaire.
4. Une fois que la mise au point et l'exposition appropriées ont été obtenues, cliquez sur l'icône de la caméra pour capturer l'image. Cliquez ensuite sur PROCESS/ANALZYE ci-dessus pour continuer à construire le protocole et sélectionner l'onglet ANALYSE.
5. Cliquez sur Analyse cellulaire dans ADD ANALYSIS STEP à droite de l'image et cliquez sur START. L'image affichera les cellules surlignées pour indiquer chaque cellule individuelle. La sélection Options peut être cliquée pour modifier les paramètres afin de mieux sélectionner les cellules en fonction du seuil de fluorescence ou de la taille des cellules. Si l'imageur compte correctement les cellules, cliquez sur ADD STEP en bas de l'écran.
6. Cliquez sur l'icône en haut de l'écran pour créer une expérience à partir d'un ensemble d'images,qui ouvrira une fenêtre avec l'expérience. Une fois ouvert, cliquez sur Procédure sous l'onglet Protocole et dans la nouvelle fenêtre qui s'ouvre sélectionnez Lire, puis dans la nouvelle fenêtre cliquez sur la plaque complète pour sélectionner uniquement les 60 puits qui contiennent les cellules (B2 ... G11). Cliquez ok pour enregistrer les modifications, puis cliquez sur OK dans la fenêtre Procédure.
7. La plaque peut maintenant être image par ce protocole et le fichier expérimental peut être enregistré. Cliquez sur l'icône de jeu pour exécuter la plaque. Une fois la première plaque a été image, imageles des deux autres plaques. À la fin de l'imagerie, téléchargez les données de comptage cellulaire sur une feuille de calcul pour analyse. Prenez toutes les images à 10x grossissement.

4. Terminal MTT cytotoxicité d'essayer

REMARQUE : Commencez l'examen MTT dans les deux heures suivant la fin de l'imagerie tdTomato.

1. Faire une solution de bouillon MTT de 5 mg/mL en pesant 25 mg de MTT et en le rependant en 5 ml de milieu NSC. Vortex la solution jusqu'à ce qu'il n'y ait pas de précipités visibles de MTT, ce qui pourrait prendre plusieurs minutes.
2. Retirez les plaques de culture cellulaire de l'incubateur et aspirez le milieu de culture cellulaire. Diluer MTT 1:10 dans le milieu de culture cellulaire et ajouter 100 L de MTT à chaque puits de cellules.
3. Incuber les cellules à 37 oC pendant 2 h. Un précipité violacé doit être visible à peu près proportionnellement au nombre de cellules dans le puits. Aspirer la solution MTT hors des plaques ou inverser la plaque rapidement pour faire glisser la solution hors de la plaque.
4. Ajouter 50 OL de 100 % de DMSO à chaque puits et secouer les assiettes à température ambiante pendant 10 min à 400 tr/min. Lisez l'absorption de chaque puits à 595 nm dans un lecteur de plaques et exportez les données sur une feuille de calcul pour analyse.

5. Analyse des données

1. Effectuer une analyse du nombre de cellules et des absorbances tdTomato avec un logiciel approprié (feuille de calcul commerciale, R). Calculer les moyennes pour l'absorption ou le nombre cellulaire des trois d'État à des fins de normalisation, puis diviser la valeur des comptes cellulaires ou des absorbances pour chaque puits de la plaque par cette moyenne et convertir en pourcentage. Ceci donne le nombre normalisé de cellules ou d'absorption par rapport au contrôle de DMSO pour chaque plaque.
2. Calculer le nombre ou l'absorption normalisé moyen et l'écart type pour les puits de repli sur les trois plaques.
   REMARQUE : À ce stade, il devrait y avoir quatre ensembles différents de valeurs normalisées : une pour chacune des plaques et une moyenne pour les trois plaques de repli.
3. Soyez prudent et utilisez une valeur normalisée à ou en dessous de 25 % pour la moyenne des trois plaques répliquées afin de classer un composé comme toxique. En outre, parce qu'un seul traitement par composé est effectué sur chaque plaque, seuls les composés d'étiquette qui tombent en dessous de ce seuil sur les trois plaques de réplique comme toxiques. Examinez les images fluorescentes de tous les composés que cette analyse filtre comme toxiques pour confirmer visuellement la toxicité.
   REMARQUE : L'identification des composés avec un effet inhibiteur de croissance ou d'amélioration de la croissance est plus difficile à évaluer dans un test exploratoire de ce type en raison de l'absence de répliques sur chaque plaque. Cependant, ce qui suit est un moyen rapide d'identifier les composés qui peuvent soit ralentir ou améliorer la croissance cellulaire.
4. Calculez l'écart type pour les trois contrôles DMSO de répétition sur chaque plaque, puis filtrez pour tous les composés dont les valeurs moyennes sont d'au moins deux écarts types au-dessus ou au-dessous du contrôle DMSO. Les composés qui tombent de ce filtre sur chacune des trois plaques peuvent justifier une enquête plus approfondie.
5. Utilisez la même stratégie d'analyse pour la réponse de dose que l'écran de toxicité primaire. Calculez les moyennes pour les contrôles DMSO pour chaque réplique biologique et utilisez ces valeurs pour normaliser les pourcentages de cellules vivantes ou d'absorptions pour cent pour chaque combinaison composé/dose. Calculez les moyens et l'erreur standard des moyens pour toutes les combinaisons composés/dose pour les trois répliques biologiques.
6. Transformer la concentration en valeur journal, générer une courbe de réponse de dose pour le journal de concentration par rapport à la viabilité normalisée, et adapter la courbe avec une analyse de régression non linéaire (analyse peut être effectuée en R ou divers statistiques commerciaux paquets). Calculer la dose létale 50 (ou techniquement dans ce cas la dose viable 50) ou la concentration de composé qui se traduit par une toxicité de 50% de l'équation de cette courbe. De nombreux progiciels calculent automatiquement ce chiffre.

Résultats

Les données automatisées sur le nombre de cellules ont permis d'identifier onze composés dont la viabilité est inférieure à 25 % lorsqu'ils ont été normalisés au contrôle du DMSO, tandis que les données du MTT ont permis d'identifier ces mêmes composés plus deux autres(tableau 1 et tableau 2, rouge ombragé). Les deux composés jugés toxiques seulement dans l'assay MTT (puits F3 et G10) avaient 31% et 39%, respectivement, le nombre de cellules tdTomato-positives comme le co...

Discussion

L'objectif principal de cet article était de décrire une stratégie qui pourrait identifier efficacement et peu coûteux les composés affectant la croissance cellulaire dans un criblage à faible et modéré-débit. Deux techniques orthogonales ont été utilisées pour évaluer le nombre de cellules afin d'accroître la confiance dans les conclusions et d'offrir des informations supplémentaires qui ne seraient pas disponibles si un seul résultat était utilisé. L'un des essais a utilisé un imageur de cellules flu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27 (50X)	ThermoFisher Scientific	17504001	Neural stem cell medium component.
BenchTop pipettor	Sorenson Bioscience	73990	Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.
BioLite 96 well multidish	Thermo Scientific	130188	Any 96 well cell culture plate will work.  We use these in our work.
Cell culture microscope	Nikon	Eclipse TS100	Visual inspection of cells to ensure proper density.
Cytation 5/ Imaging reader	BioTek	CYT3MFV	Used for cell imaging and absorbance readings.
DMSO	Fisher Scientific	610420010	Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.
FGF-basic	Peprotech	100-18B	Neural stem cell medium component.
GelTrex	ThermoFisher Scientific	A1413202	Neural stem cell basement membrane matrix.  Allows cells to attach to cell culture plates.
Gen5 3.04	BioTek		Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.
Glutamine	ThermoFisher Scientific	25030081	Neural stem cell medium component.
Microtest U-Bottom	Becton Dickinson	3077	Storage of compound libraries.
MTT	ThermoFisher Scientific	M6494	Active assay reagent to determine cellular viability.
Multichannel pippette	Rainin	E8-1200	Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.
Neurobasal medium	ThermoFisher Scientific	21103049	Neural stem cell base medium.
RFP filter cube	BioTek	1225103	Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.
TrypLE	ThermoFisher Scientific	12605036	Cell dissociation reagent.