Una strategia per identificare i composti che influenzano la crescita cellulare e la sopravvivenza nelle cellule di mammaliana coltivate a bassa-moderato throughput

Riepilogo

Spesso è necessario valutare la potenziale citotossicità di un insieme di composti sulle cellule coltivate. Qui, descriviamo una strategia per lo screening affidabile dei composti tossici in un formato di 96 pozze.

Abstract

La citotossicità è un parametro critico che deve essere quantificato quando si studiano farmaci che possono avere benefici terapeutici. Per questo motivo, molti saggi di screening farmacologico utilizzano la citotossicità come una delle caratteristiche critiche da profilare per i singoli composti. Le cellule nella coltura sono un modello utile per valutare la citotossicità prima di procedere a seguire composti di piombo promettenti in modelli animali più costosi e ad alta intensità di lavoro. Descriviamo una strategia per identificare i composti che influenzano la crescita cellulare in una linea di tdTomato che esprime cellule staminali neurali umane (NSC). La strategia utilizza due saggi complementari per valutare il numero di cellulare. Un saggio funziona attraverso la riduzione di 3-(4,5-dimetilthizol-2-yl)-2-diphenyltetrazolium bromuro (MTT) a formazan come proxy per il numero di cellulare e l'altro conta direttamente il tdTomato che esprime NSC. I due saggi possono essere eseguiti contemporaneamente in un unico esperimento e non sono laboriosi, rapidi e poco costosi. La strategia descritta in questa dimostrazione ha testato 57 composti in uno schermo primario esplorativo per la tossicità in un formato di piastra di 96 pozze. Tre dei colpi sono stati ulteriormente caratterizzati in una risposta alla dose di sei punti utilizzando lo stesso set-up assay come lo schermo primario. Oltre a fornire un'eccellente corroborazione per la tossicità, il confronto dei risultati dei due saggi può essere efficace nell'identificare i composti che interessano altri aspetti della crescita cellulare.

Introduzione

Una delle caratteristiche più importanti che deve essere determinata per un composto chimico che ha un potenziale terapeutico è la sua tossicità per le cellule animali. Questa caratteristica determinerà se un farmaco è un buon candidato per uno studio più ampio. Nella maggior parte dei casi, si cercano composti con tossicità minima, ma ci sono situazioni in cui un composto con la capacità di uccidere specifici tipi di cellule è di interesse, ad esempio, farmaci anti-tumigenici. Anche se gli animali interi sono i migliori sistemi modello per determinare la tossicità sistemica, il costo e la manodopera coinvolti sono proibitivi quando più di un paio di composti devono essere testati. Come tale coltura cellulare mammiferi è generalmente utilizzato come l'alternativa più efficiente^1,2. Gli schermi farmacologici di medio-piccolo e medio throughput sono una modalità importante attraverso la quale la tossicità può essere valutata nella coltura cellulare. Queste schermate possono essere utilizzate per interrogare le librerie con notato che prendono di mira singoli percorsi di segnalazione. Il formato generale di tale schermo è quello di testare inizialmente tutti i composti della libreria ad una singola dose (generalmente 10 M) in uno schermo di tossicità primaria esplorativo, e quindi eseguire uno schermo di risposta alla dose secondaria approfondita per caratterizzare completamente la tossicità profilo degli hit dalla schermata principale. I metodi per implementare questa strategia saranno descritti qui e forniranno un modo rapido, efficiente ed economico per identificare e caratterizzare i composti tossici.

Sono stati sviluppati diversi metodi per valutare la citotossicità di piccoli composti e nanomateriali nelle cellule dei mammiferi^3,4. Va notato che alcuni materiali possono interagire con il saggio fornendo risultati fuorvianti, e tali interazioni dovrebbero essere testate quando caratterizzano i colpi provenienti da schermi di tossicità⁴. I saggi di citotossicità includono l'esclusione blu trypan⁵, lattato dehydrogenase (LDH) rilasciare asdetto⁶, Alamar blu assay⁷, calcien acetoxymethyl ester (AM)⁸, e il test ATP⁹. Tutti questi saggi misurano vari aspetti del metabolismo cellulare che può servire come proxy per il numero di cellule. Mentre tutti offrono vantaggi, saggi a base di sale di tetrazolium come 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2-diphenyltetrazolium bromuro (MT ), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide sale interno (XTT)-1, e 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzene disulfonato (WST-1)^10,11 fornire una buona precisione e facilità d'uso a basso costo. L'MTT, che verrà utilizzato in questa dimostrazione, è ridotto a un formazan insolubile da una riduttrice mitocondriale e il tasso di questa conversione è fortemente correlato al numero di cellulare. Questo saggio è stato regolarmente utilizzato sia su piccola scala che per le librerie di screening con fino a 2.000 composti¹². Il conteggio diretto delle cellule da parte di un marcatore etichettato offre un altro metodo per valutare il numero cellulare e, a differenza dell'analisi MTT, può fornire informazioni aggiuntive sulle dinamiche della crescita cellulare. Diversi algoritmi pubblicamente disponibili sono disponibili per eseguire analisi automatizzate del conteggio delle celle e ci sono anche algoritmi proprietari che fanno parte di pacchetti software per lettori di imaging^13,14. In questa descrizione del metodo, una linea di cellule staminali neurali umane (NSC) che è stata geneticamente modificata per sovrattuazionalmente esprimere tdTomato¹⁵ servirà come una linea di prova per confrontare i risultati della vitalità cellulare tra un saggio MTT e un conteggio automatico delle cellule un'immagine in una schermata che valuta la tossicità di 57 composti di prova. Anche se l'obiettivo principale di questa strategia era quello di identificare e caratterizzare i composti tossici, ha il vantaggio aggiuntivo di identificare potenzialmente i composti inibitori della crescita e di miglioramento della crescita e quindi fornisce un metodo efficace per identificare i farmaci che può modulare la crescita cellulare.

Protocollo

1. Cultura NSC

NOTA: La manipolazione di una linea NSC umana verrà descritta di seguito, ma qualsiasi linea cellulare può essere utilizzata per questo protocollo. Tutto il lavoro di coltura cellulare viene eseguito in un armadietto di sicurezza biologica.

1. Cappotto una piastra di 96 pozzetto con membrana seminterrato/matrice extracellulare (ECM).
   1. Scongelare l'aliquota di ECM (Tabella dei materiali), che faciliterà l'attaccamento di NSC, sul ghiaccio. Diluire l'ECM alla concentrazione appropriata (generalmente 1:100) nel mezzo di base di 10 mL (Tabella dei materiali) e aggiungere 50 L per pozzo a ciascuno dei 60 pozzi interni di una piastra di 96 pozzetti ( Figura1). Utilizzare solo gli interni 60 pozzi per evitare artefatti che possono derivare dall'effetto bordo¹⁶.
   2. Lasciare che la piastra si sieda a temperatura ambiente o in un'incubatrice a coltura cellulare (37 gradi centigradi, 5% CO₂) per almeno 30 min.
2. Dissociare e placare cellule staminali neurali.
   NOTA: Le celle da utilizzare in questo metodo devono essere coltivate ad almeno l'80% di confluenza in un pallone T75.
   1. Cellule di coltura in un pallone T75 in un'incubatrice a coltura cellulare a 37 gradi centigradi e 5% di CO₂ nel mezzo NSC che è composto da mezzo di base, B27, aminoacidi non essenziali, 2 m glutamon, e 10 ng/mL fattore di crescita fibroblasto di base 10 ng/mL (FGFb o FGF2).
   2. Rimuovere le cellule dall'incubatrice una volta raggiunto l'80% di confluenza e aspirare il mezzo NSC. Aggiungere una quantità appropriata di reagente di dissociazione cellulare (3 mL per un pallone T75; Tabella dei materiali) e incubare per 5 min nell'incubatrice.
   3. Dopo l'incubazione, aggiungere 7 mL di mezzo NSC nel flacone T75 e pipetta vigorosamente per garantire che tutte le cellule si staccano. Trasferire la soluzione a cellule dissociate in un tubo da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 min.
   4. Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante dal tubo e risospendere le cellule in 10 mL di NSC medio e contare le cellule.
   5. Riadattare la concentrazione delle cellule a 200.000 cellule / mL con mezzo NSC. Assicurarsi che le celle siano completamente sospese per la placcatura omogenea in pozze.
   6. Piastra 100 -L della miscela cellulare (20.000 cellule) nei 60 pozzi interni di tre piastre 96 che sono state rivestite come descritto nella sezione 1.1. Utilizzare sei degli otto slot di un pipettor multicanale a 8 canali per lastrare le celle colonna per colonna.
   7. Aggiungere 100 l di mezzo di base o NSC a tutti i pozzi senza cellule per ridurre al minimo la potenziale evaporazione dai pozzi esterni.
   8. Al microscopio a coltura cellulare, ispezionare visivamente almeno 10 pozze su ciascuna delle tre lastre del 96 po'per confermare che le cellule vengono seminate alla densità prevista. Non procedere con il saggio se le cellule sono placcate ad una densità troppo scarsa o densa.

2. Trattamento di cellule con composti

NOTA: La libreria fatta in casa testata in questa dimostrazione contiene composti che modulano senza ali/integrati (Wnt), acido retinoico, trasformazione del fattore di crescita-beta (TGF-z) e vie di segnalazione riccio sonore, nonché una varietà di chinasi di tirosina.

1. Schermo primario esplorativa per tossicità/numero di cella
   1. Aliquota di 50-100 mL fino a 57 composti di prova (Tabella supplementare 1) ad una concentrazione di 10 mM in solistere dimetilo 100% (DMSO) negli interni 60 pozze di una piastra 96-well con fondo A, V o a fondo rotondo con tre pozzi DMSO come controllo (vedi. Figura 1 per una mappa piastra). Questo servirà come la piastra composta master con 25 -L di composto che può essere congelato e scongelato più volte.
      NOTA: Piastre con fondo piatto non dovrebbero essere utilizzati in quanto sarà più difficile aspirare piccoli volumi di composti da loro con un pipettor panca superiore.
   2. Rimuovere le piastre di coltura cellulare dall'incubatrice 16-24 h dopo la divisione come descritto nella sezione 1 e aspirare NSC medio colonna per colonna con un pipettor multi-bene a 8 canali utilizzando solo sei degli otto slot multi-bene. Aggiungere 95 -L di mezzo NSC fresco alle celle in ciascuna delle tre piastre di replica e rimettere le piastre in incubatrice fino al completamento della fase 2.1.4 riportata di seguito.
   3. Aggiungete 49 ldi di mezzo NSC a ciascuno degli interni 60 pozze di una piastra 96 ben con fondo A vuota, a V o a fondo rotondo con un pipettor multi-bene a 8 canali. Sbloccare la piastra composta principale e utilizzare un pipettor panca superiore o uno strumento equivalente per pipettare 1 - L di composto dalla piastra master nel mezzo 49 L di NSC in ciascuno degli interni 60 pozzi.
   4. Mescolare il composto diluito 3x con il pipettor panca top.
   5. Togliere le tre lastre di NSC 96 pozzetto dall'incubatrice, la pipetta 15 -L di ogni composto diluito con il pipettor della panca e erogare un 5 - L' di composto in ciascuna delle tre piastre.
      NOTA: Questa diluizione 1:20 del composto nelle cellule in combinazione con la diluizione iniziale 1:50 al punto 2.1.3 produce una diluizione 1:1000 in modo tale che la concentrazione finale dei composti sui NSC sarà di 10 M con una concentrazione DMSO dello 0,1% e la finale concentrazione per i controlli DMSO sarà dello 0,1%.
   6. Incubare cellule con composto per 72 h e procedere con saggi di citotossicità. Intervalli più brevi possono essere utilizzati, ma un periodo di incubazione di 72 ore dovrebbe massimizzare i potenziali effetti citotossici dei composti testati.
2. Saggio di risposta alla dose
   NOTA: la configurazione per il 96-bene utilizzato per la risposta alla dose viene visualizzato nella Figura 2.
   1. Utilizzare la colonna 2 per sei repliche di controllo DMSO e testare triplicati fino a tre composti diversi a due diluizioni seriali a sei dosi a partire da una dose elevata di 10 M.
   2. Diluire 4 l di DMSO o composto di prova in DMSO in 196 - L di NSC medio in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 25 l di DMSO alla colonna di pozze da B2-G2 e 50 l di composti di prova alla riga da B3-B11 con i tre composti testati in triplici da 10 mM nelle righe B3-B5, B6-B8 e B9-B11.
   3. Pipette 25 - L di NSC medio alle restanti colonne vuote nella parte interna della piastra 96-po. Togliere 25 l di composto dai pozze B3-B11 con un pipettor multicanale, aggiungerlo ai pozze C3-C11 e mescolare almeno cinque volte. Ripetere il processo per le righe rimanenti per generare triplicati a diluizioni bilido per un totale di sei dosi per ciascuno dei composti.
   4. Generare NSC per la risposta alla dose esattamente come descritto per la schermata principale nella sezione 2.1. I composti per la risposta alla dose vengono aggiunti e incubati sulle cellule esattamente come descritto nei passaggi 2.1.5 e 2.1.6.
      NOTA: Tre repliche biologiche del saggio di risposta alla dose vengono eseguite ripetendo il saggio sulle NSC in diversi passaggi in giorni separati.

3. Celle di imaging su un lettore di lastre

1. Dopo che le cellule sono state incubate con composti per il tempo assegnato, le cellule di immagine su un lettore di piastre per determinare il numero di cellule pre-trattamento per bene.
   NOTA: le istruzioni per le celle di imaging sono specifiche del lettore, ma generalmente seguono una strategia simile. Le istruzioni riportate di seguito si applicano al lettore utilizzato in questa dimostrazione (Tabella dei materiali).
2. Rimuovere la piastra dall'incubatrice e posizionarla all'interno del lettore di piastre. Aprire il software imager per impostare i file di protocollo e di esperimento per lo studio. Passare alla modalità manuale Imager in Task Manager e fare clic su Acquisisci ora....
3. Scegli la piastra di 96 e ben come tipo di vaso, seleziona 10x per l'ingrandimento e le proteine fluorescenti rosse (RFP) 531 e 593 per l'imaging tdTomato. Selezionare un pozzo, quindi fare clic su Messa a fuoco automatica per mettere a fuoco l'immagine e su Esponi automaticamente per un tempo di esposizione corretto. Se necessario, regolare manualmente la messa a fuoco e l'esposizione.
4. Una volta ottenuta la messa a fuoco e l'esposizione corretta, fare clic sull'icona della fotocamera per acquisire l'immagine. Quindi, fare clic su PROCESS/ANAL-AE sopra per continuare a compilare il protocollo e selezionare la scheda ANALYSIS.
5. Fare clic su Analisi cellulare in ADD ANALYSIS STEP a destra dell'immagine e fare clic su START. L'immagine mostrerà le celle evidenziate per indicare ogni singola cella. È possibile fare clic sulla selezione Opzioni per modificare i parametri per selezionare meglio le celle in base alla soglia di fluorescenza o alle dimensioni della cella. Se l'imager sta contando correttamente le celle, quindi fare clic su AGGIUNGI STEP nella parte inferiore dello schermo.
6. Fare clic sull'icona nella parte superiore dello schermo per creare esperimento dal setdi immagini, che aprirà una finestra con l'esperimento. Una volta aperto, fare clic su Procedura nella scheda Protocollo e nella nuova finestra che si apre selezionare Lettura, quindi nella nuova finestra fare clic su piastra completa per selezionare solo i 60 pozzi che contengono le celle (B2... G11). Fare clic su OK per salvare le modifiche, quindi fare clic su OK nella finestra Procedura.
7. La piastra può ora essere immagine da questo protocollo e il file sperimentale può essere salvato. Fare clic sull'icona di riproduzione per eseguire la piastra. Una volta che la prima piastra è stata immagine, immagine le altre due piastre. Al termine dell'imaging, scaricare i dati del conteggio delle celle in un foglio di calcolo per l'analisi. Scatta tutte le immagini con un ingrandimento di 10 volte.

4. Saggio di citotossicità della citotossicità dell'MTT terminale

NOTA: Iniziare il saggio MTT entro due ore dal completamento dell'imaging tdTomato.

1. Fare una soluzione di 5 mg/mL MTT di pesare 25 mg di MTT e riaverlo in 5 mL di mezzo NSC. Vorticare la soluzione fino a quando non ci sono precipitati visibili di MTT, che potrebbe richiedere diversi minuti.
2. Rimuovere le lastre di coltura cellulare dall'incubatrice e aspirare fuori mezzo di coltura cellulare. Diluire MTT 1:10 nel mezzo di coltura cellulare e aggiungere 100 L di MTT a ogni pozzetto di cellule.
3. Incubano le cellule a 37 gradi centigradi per 2 h. Un precipitato violaceo dovrebbe essere visibile approssimativamente in proporzione al numero di cellule nel pozzo. Aspirate la soluzione MTT fuori piastre o invertire la piastra rapidamente per flick soluzione fuori dalla piastra.
4. Aggiungere 50 L di 100% DMSO ad ogni pozzo e agitare le piastre a temperatura ambiente per 10 min a 400 giri/m. Leggere l'assorbimento di ogni pozzo a 595 nm in un lettore di lastre ed esportare i dati in un foglio di calcolo per l'analisi.

5. Analisi dei dati

1. Eseguire un'analisi dei conteggi delle cellule tdTomato e degli assorbimenti con software appropriato (foglio di calcolo commerciale, R). Calcolare le medie per l'assorbimento o il numero di cellule delle tre repliche DMSO su ogni piastra per scopi di normalizzazione, quindi dividere il valore per il conteggio delle cellule o le assorbiture per ogni bene sulla piastra per questa media e convertire in una percentuale. Questo produce il conteggio delle cellule normalizzate o l'assorbimento relativo al controllo DMSO per ogni piastra.
2. Calcolare il conteggio medio normalizzato o l'assorbimento e la deviazione standard per replicare i pozze sulle tre piastre.
   NOTA: A questo punto dovrebbero esserci quattro diversi set di valori normalizzati: uno per ciascuna delle piastre e una media per le tre piastre di replica.
3. Essere conservativi e utilizzare un valore normalizzato pari o inferiore al 25% per la media tra le tre piastre di replica per classificare un composto come tossico. Inoltre, poiché su ogni piastra viene eseguito un solo trattamento per composto, solo i composti etichetta che scendono al di sotto di questa soglia su tutte e tre le piastre di replicazione come tossiche. Esaminare le immagini fluorescenti di tutti i composti che questa analisi filtra come tossici per confermare visivamente la tossicità.
   NOTA: L'identificazione di composti con un inibitorio della crescita o effetto di miglioramento della crescita è più difficile da valutare in un saggio esplorativo di questo tipo a causa della mancanza di repliche su ogni piastra. Tuttavia, il seguente è un modo rapido per identificare i composti che possono rallentare o migliorare la crescita cellulare.
4. Calcolare la deviazione standard per i tre controlli DMSO replicati su ogni piastra e quindi filtrare per tutti i composti che hanno valori medi almeno due deviazioni standard sopra o sotto il controllo DMSO. Composti che non rientrano in questo filtro su ciascuna delle tre piastre possono giustificare ulteriori indagini.
5. Utilizzare la stessa strategia di analisi per la risposta alla dose come schermata di tossicità primaria. Calcolare le medie per i controlli DMSO per ogni replica biologica e utilizzare questi valori per normalizzare la percentuale di cellule vive o la percentuale di assorbimenti per ogni combinazione composto/dose. Calcolare i mezzi e l'errore standard dei mezzi per tutte le combinazioni composto/dose per le tre repliche biologiche.
6. Trasformare la concentrazione nel suo valore di log, generare una curva di risposta alla dose per il registro della concentrazione rispetto alla vitalità normalizzata e adattare la curva con un'analisi di regressione non lineare (l'analisi può essere eseguita in R o in varie statistiche commerciali pacchetti). Calcolare la dose letale 50 (o tecnicamente in questo caso la dose praticabile 50) o la concentrazione di composto che si traduce in 50% tossicità dall'equazione di questa curva. Molti pacchetti software calcoleranno automaticamente questa cifra.

Risultati

I dati automatizzati del conteggio delle cellule hanno identificato undici composti con minore del 25% di fattibilità quando vengono normalizzati al controllo DMSO, mentre i dati MTT identificavano questi stessi composti più due ulteriori (Tabella 1 e Tabella 2, rosso scuro). I due composti trovati tossici solo nell'esempio MTT (pozzi F3 e G10) avevano rispettivamente il 31% e il 39%, il numero di cellule tdTomato-positive come controllo e per ordine di rango erano i successivi due com...

Discussione

L'obiettivo principale di questo articolo era descrivere una strategia in grado di identificare in modo efficiente e conveniente i composti che influenzano la crescita delle cellule in uno screening a bassa o moderata velocità effettiva. Sono state utilizzate due tecniche ortogonali per valutare il numero di cellule per aumentare la fiducia nelle conclusioni e offrire ulteriori approfondimenti che non sarebbero disponibili se fosse stato utilizzato un solo saggio. Uno dei saggi ha usato un imager cellulare fluorescente ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27 (50X)	ThermoFisher Scientific	17504001	Neural stem cell medium component.
BenchTop pipettor	Sorenson Bioscience	73990	Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.
BioLite 96 well multidish	Thermo Scientific	130188	Any 96 well cell culture plate will work.  We use these in our work.
Cell culture microscope	Nikon	Eclipse TS100	Visual inspection of cells to ensure proper density.
Cytation 5/ Imaging reader	BioTek	CYT3MFV	Used for cell imaging and absorbance readings.
DMSO	Fisher Scientific	610420010	Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.
FGF-basic	Peprotech	100-18B	Neural stem cell medium component.
GelTrex	ThermoFisher Scientific	A1413202	Neural stem cell basement membrane matrix.  Allows cells to attach to cell culture plates.
Gen5 3.04	BioTek		Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.
Glutamine	ThermoFisher Scientific	25030081	Neural stem cell medium component.
Microtest U-Bottom	Becton Dickinson	3077	Storage of compound libraries.
MTT	ThermoFisher Scientific	M6494	Active assay reagent to determine cellular viability.
Multichannel pippette	Rainin	E8-1200	Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.
Neurobasal medium	ThermoFisher Scientific	21103049	Neural stem cell base medium.
RFP filter cube	BioTek	1225103	Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.
TrypLE	ThermoFisher Scientific	12605036	Cell dissociation reagent.