Uma estratégia para identificar compostos que afetam o crescimento celular e sobrevivência em células de mamíferos cultivadas em baixa a moderada taxa de transferência

Resumo

Muitas vezes é necessário avaliar a citotoxicidade potencial de um conjunto de compostos em células cultivadas. Aqui, nós descrevemos uma estratégia para tela confiável para compostos tóxicos em um formato 96-well.

Resumo

A citotoxicidade é um parâmetro crítico que precisa ser quantificado ao estudar drogas que podem ter benefícios terapêuticos. Por causa disso, muitos ensaios de triagem de drogas utilizam a citotoxicidade como uma das características críticas a serem perfiladas para compostos individuais. As células na cultura são um modelo útil para avaliar a citotoxicidade antes de prosseguir para o acompanhamento de compostos promissores de chumbo em modelos animais mais dispendiosos e trabalhoso. Nós descrevemos uma estratégia para identificar os compostos que afetam o crescimento da pilha em um tdTomato que expressa a linha de pilhas de haste neural humanas (NSC). A estratégia utiliza dois ensaios complementares para avaliar o número de células. Um ensaio funciona através da redução de 3-(4, 5-dimetilthizol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólio brometo (MTT) para formazan como um proxy para o número da célula e o outro conta diretamente o tdTomato expressando NSCs. Os dois ensaios podem ser realizados simultaneamente em um único experimento e não são trabalhoso, rápido e barato. A estratégia descrita nesta demonstração testou 57 compostos em uma tela preliminar exploratória para a toxicidade em um formato da placa de 96 poços. Três dos hits foram caracterizados mais em uma resposta da dose de seis pontos usando o mesmo ajuste-acima do ensaio que a tela preliminar. Além de proporcionar excelente corroboração para toxicidade, a comparação dos resultados dos dois ensaios pode ser efetiva na identificação de compostos que afetam outros aspectos do crescimento celular.

Introdução

Uma das características mais importantes que precisa ser determinada para um composto químico que tem potencial terapêutico é a sua toxicidade para as células animais. Esta característica determinará se uma droga é um bom candidato para um estudo mais extenso. Na maioria dos casos, os compostos com toxicidade mínima são procurados, mas há situações em que um composto com a capacidade de matar tipos de células específicas é de interesse, por exemplo, drogas antitumorigenic. Embora os animais inteiros sejam os melhores sistemas do modelo para determinar a toxicidade sistemática, o custo e o trabalho envolvidos são proibitivos quando mais do que alguns compostos precisam de ser testados. Como essa cultura de células de mamíferos é geralmente usada como a alternativa mais eficiente^1,2. Telas de medicamentos de pequeno a médio débito são uma modalidade importante através da qual a toxicidade pode ser avaliada na cultura celular. Essas telas podem ser usadas para interrogar bibliotecas anotadas visando caminhos de sinalização individuais. O formato geral de tal tela é inicialmente testar todos os compostos na biblioteca em uma única dose (geralmente 10 μM) em uma tela de toxicidade primária exploratória e, em seguida, executar uma tela de resposta de dose secundária em profundidade para caracterizar plenamente a toxicidade Perfil de acertos da tela principal. Os métodos para implementar essa estratégia serão descritos aqui e fornecerão uma maneira rápida, eficiente e barata de identificar e caracterizar compostos tóxicos.

Foram desenvolvidos vários métodos para avaliar a citotoxicidade de pequenos compostos e nanomateriais em células de mamíferos^3,4. Deve-se notar que certos materiais podem interagir com o ensaio fornecendo resultados enganosos, e tais interações devem ser testadas quando caracterizar hits de telas de toxicidade⁴. Os ensaios de citotoxicidade incluem a exclusão azul de Tripan⁵, o ensaio de libertação de lactato desidrogenase (LDH)⁶, o ensaio azul Alamar⁷, o éster acetoxymetil calcien (AM)⁸e o ensaio ATP⁹. Todos estes ensaios medem vários aspectos do metabolismo celular que pode servir como um proxy para o número de células. Enquanto todos oferecem benefícios, tetrazólio sal-base de ensaios como 3-(4, 5-dimetilthizol-2-yl)-2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT), 2,3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofeny)-2h-tetrazólio-5-carboxyanilide sal interno (xtt)-1 e 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-Nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzeno disulfonato (WST-1)^{10,11fornecer boa} precisão e facilidade de uso a baixo custo. O MTT, que será usado nesta demonstração, é reduzido a um formazan insolúvel por um redutase mitochondrial e a taxa desta conversão correlaciona fortemente com o número de pilha. Este ensaio tem sido rotineiramente utilizado em uma pequena escala e para bibliotecas de triagem com até 2.000 compostos¹². A contagem direta de células por um marcador rotulado oferece outro método para avaliar o número de celular, e ao contrário do ensaio MTT pode fornecer informações adicionais sobre a dinâmica do crescimento celular. Vários algoritmos disponíveis publicamente estão disponíveis para realizar análises automatizadas de contagem de células e também há algoritmos proprietários que fazem parte dos pacotes de software para^{leitores de imagens}13,14. Nesta descrição do método, uma linha de células-tronco neurais humanas (NSC) que foi editada geneticamente para expressar constitutivamente o tdTomato¹⁵ servirá como uma linha de teste para comparar os resultados da viabilidade celular entre um ensaio de MTT e uma contagem de células automatizada ensaio em uma tela avaliando a toxicidade de 57 compostos de teste. Embora o objetivo principal desta estratégia fosse identificar e caracterizar compostos tóxicos, ele tem o benefício adicional de potencialmente identificar os compostos de crescimento inibitório e crescimento e, portanto, fornece um método eficaz para a identificação de drogas que pode modular o crescimento celular.

Protocolo

1. cultura NSC

Nota: a manipulação de uma linha NSC humana será descrita abaixo, mas qualquer linha celular pode ser usada para este protocolo. Todo o trabalho da cultura da pilha é executado em um armário de segurança biológico.

1. Cubra uma placa de 96 poços com membrana basal/matriz extracelular (ECM).
   1. Thaw alíquota de ECM (tabela de materiais), que facilitará a fixação de NSC, no gelo. Diluir o ECM para a concentração apropriada (geralmente 1:100) em meio de base de 10 mL (tabela de materiais) e adicionar 50 μL por poço a cada um dos 60 poços interiores de uma placa de poço 96 (Figura 1). Use somente os poços interiores 60 para evitar artefatos que possam resultar do efeito de aresta¹⁶.
   2. Deixe a placa se sentar à temperatura ambiente ou em uma incubadora de cultura celular (37 ° c, 5% CO₂) por pelo menos 30 min.
2. Dissociar e placas células-tronco neurais.
   Nota: as células para utilização neste método devem ser cultivadas para, pelo menos, 80% de confluência num balão T75.
   1. Células de cultura em um balão T75 em uma incubadora de cultura celular a 37 ° c e 5% CO₂ em meio NSC que é composto por meio de base, B27, aminoácidos não essenciais, 2 mm de glutamina e 10 ng/ml fator de crescimento básico de fibroblastos (FGFB ou FGF2).
   2. Remova as pilhas da incubadora uma vez que alcangam 80% confluência e aspiram fora do meio de NSC. Adicionar uma quantidade apropriada de reagente de dissociação celular (3 mL para um balão de T75; Tabela de materiais) e incubar por 5 min na incubadora.
   3. Após a incubação, adicione 7 mL de meio NSC no balão T75 e pipetar vigorosamente para garantir que todas as células se desanexem. Transfira a solução de células dissociadas para um tubo de 15 mL e Centrifugue a 200 x g durante 5 min.
   4. Após a centrifugação, retire o sobrenadante do tubo e reressuscitem as células em 10 mL de meio NSC e células de contagem.
   5. Readjust concentração de células para 200.000 células/mL com meio NSC. Assegure-se de que as células sejam totalmente reabertas para o revestimento homogêneo em poços.
   6. Placa 100 μL da mistura da pilha (20.000 pilhas) nos 60 poços interiores de 3 96-placas do poço que foram revestidas como descrito na seção 1,1. Use seis dos oito entalhes de um pipetador multicanal de 8 canais para células de placa coluna a coluna.
   7. Adicione 100 μL de meio de base ou meio NSC a todos os poços sem células para minimizar a evaporação potencial de poços mais exteriores.
   8. um microscópio da cultura da pilha, inspecione visualmente pelo menos 10 poços em cada um das placas 3 96-well para confirmar que as pilhas estão semeadas na densidade esperada. Não proceder com o ensaio se as células forem banhadas a uma densidade demasiado esparsa ou densa.

2. tratamento de células com compostos

Nota: a biblioteca caseira testada nesta demonstração contém compostos que modulam sem asas/integrados (WNT), ácido retinóico, transformando fator de crescimento-beta (TGF-β), e Sonic Hedgehog sinalização vias, bem como uma variedade de tirosina quinases.

1. Tela primária exploratória para toxicidade/número de células
   1. Alíquota 50 − 100 mL de até 57 compostos de teste (tabela suplementar 1) na concentração de 10 mM em 100% de sulfóxido de DIMETIL (DMSO) no interior 60 poços de uma placa de 96-poço com fundo de U, com fundo em V ou com fundo redondo, com três poços DMSO como controle (ver Figura 1 para um mapa de placas). Isso servirá como a placa de composto mestre com 25 μL de composto que pode ser congelado e descongelados várias vezes.
      Nota: as placas de fundo liso não devem ser usadas porque será mais difícil aspirar volumes pequenos dos compostos deles com um pipettor da parte superior de banco.
   2. Remova as placas da cultura da pilha da incubadora 16-24 h após a rachadura como descrito na seção 1 e aspirar fora do meio de NSC coluna-por-coluna com um pipetador do multi-poço de 8 canais usando somente seis dos oito entalhes do multi-poço. Adicione 95 μL de meio de NSC fresco às células em cada uma das três placas replicadas e coloque as placas de volta na incubadora até que a etapa 2.1.4 abaixo seja concluída.
   3. Adicione 49 μL de meio NSC a cada um dos 60 poços interiores de uma placa de 96-poço com fundo em U, com fundo em V ou com fundo redondo, com um pipetador multipoços de 8 canais. Unseal a placa mestra do composto e use um pipetador da parte superior de banco ou um instrumento equivalente para pipeta 1 μl do composto da placa mestra no μl 49 do meio de NSC em cada um dos poços 60 interiores.
   4. Misture o composto diluído 3x com o pipettor de bancada.
   5. Retire as placas 3 96-well das NSCs da incubadora, pipete 15 μL de cada composto diluído com a pipeta de bancada e dispense uma alíquota de 5 μL de composto em cada uma das três placas.
      Nota: Esta diluição 1:20 do composto nas células em combinação com a diluição inicial 1:50 no passo 2.1.3 produz uma diluição de 1:1000 de tal forma que a concentração final dos compostos nos NSCs será de 10 μM com uma concentração de DMSO de 0,1% e o final concentração para os controles DMSO será 0,1%.
   6. Incubar células com composto para 72 h e proceder com ensaios de citotoxicidade. Intervalos mais curtos podem ser usados, mas um período de incubação de 72 horas deve maximizar os potenciais efeitos citotóxicos de compostos testados.
2. Ensaio de resposta da dose
   Nota: a set-up para o 96-well usado para a dose-resposta é indicada na Figura 2.
   1. Use a coluna 2 para seis repetições de controle DMSO e triplicatas de teste de até três compostos diferentes em diluições seriadas de duas dobras em seis doses, começando com uma dose alta de 10 μM.
   2. Diluir 4 μL de DMSO ou composto de teste em DMSO em 196 μL de meio NSC em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicionar 25 μL de DMSO à coluna de poços de B2-G2 e 50 μL de compostos de teste para a linha de B3-B11 com os três compostos testados em triplicados de 10 mM nas fileiras B3-B5, B6-B8 e B9-B11.
   3. Pipete 25 μL de meio NSC para as restantes colunas vazias na porção interior da placa 96-well. Retire 25 μL de composto dos poços B3-B11 com um pipetador multicanal, adicione aos poços C3-C11 e misture pelo menos cinco vezes. Repita o processo para as linhas restantes para gerar triplica em duas vezes diluições para um total de seis doses para cada um dos compostos.
   4. Gere NSCs para a resposta da dose exatamente como descrito para a tela preliminar na seção 2,1. Os compostos para a resposta da dose são adicionados e incubados nas células exatamente como descrito nas etapas 2.1.5 e 2.1.6.
      Nota: três repetições biológicas do ensaio de resposta à dose são realizadas repetindo-se o ensaio sobre as NSCs em diferentes passagens em dias distintos.

3. células de imagem em um leitor de placas

1. Depois que as células foram incubadas com compostos para o tempo alocado, células de imagem em um leitor de placa para determinar o número de células de pré-tratamento por poço.
   Observação: instruções para células de imagem são específicas do leitor, mas geralmente seguem uma estratégia semelhante. As direções abaixo se aplicam ao leitor utilizado nesta demonstração (tabela de materiais).
2. Retire a placa da incubadora e coloque-a dentro do leitor de placas. Abra o software do Imager para configurar o protocolo e os arquivos de experimento para o estudo. Vá para o modo manual do Imager no Gerenciador de tarefas e clique em capturar agora....
3. Escolha a placa 96-well como o tipo da embarcação, selecione 10x para a ampliação, e a proteína fluorescente vermelha (RFP) 531 e 593 para a imagem latente tdTomato. Escolha um poço, em seguida, clique em autofocus para focar a imagem, e auto expor para o tempo de exposição adequada. Ajuste manualmente o foco e a exposição, se necessário.
4. Uma vez que o foco e a exposição apropriados foram obtidos, estale o ícone da câmera para capturar o retrato. Em seguida, clique em process/ANALZYE acima da imagem para continuar a criar o protocolo e selecione a guia análise.
5. Clique em análise celular em Adicionar etapa de análise à direita da imagem e clique em Iniciar. A imagem mostrará as células destacadas para indicar cada célula individual. A seleção de opções pode ser clicada para alterar os parâmetros para selecionar melhor as células com base no limite de fluorescência ou no tamanho da célula. Se o gerador de imagens estiver contando corretamente as células, clique em Adicionar etapa na parte inferior da tela.
6. Clique no ícone na parte superior da tela para criar experimento a partir do conjunto de imagens, que abrirá uma janela com o experimento. Uma vez aberto, clique em procedimento na guia Protocolo e na nova janela que abre selecione ler, em seguida, na nova janela, clique em chapa completa para selecionar apenas os 60 poços que contêm as células (B2... G11). Clique em OK para salvar as alterações e clique em OK na janela de procedimento.
7. A placa pode agora ser imaged por este protocolo e o arquivo experimental pode ser conservado. Clique no ícone de reprodução para executar a placa. Uma vez que a primeira placa foi imaged, imagem as outras duas placas. Após a conclusão da imagem, baixe os dados de contagem de células para uma planilha para análise. Tire todas as imagens com ampliação de 10x.

4. ensaio de citotoxicidade terminal MTT

Nota: comece o ensaio de MTT dentro de duas horas de terminar a imagem latente de tdTomato.

1. Faça uma solução de estoque de 5 mg/mL de MTT pesando 25 mg de MTT e a ressuscitem em 5 mL de meio NSC. Vortex a solução até que não haja precipitados visíveis de MTT, o que pode demorar vários minutos.
2. Retire as placas de cultura celular da incubadora e aspirar o meio de cultura celular. Diluir MTT 1:10 em meio de cultura celular e adicionar 100 μL de MTT a cada poço de células.
3. Incubar células a 37 ° c por 2 h. Um precipitado purpúreo deve ser visível aproximadamente na proporção do número de células no poço. Aspirar a solução de MTT fora das placas ou inverta a placa rapidamente para deslizar a solução fora da placa.
4. Adicionar 50 μL de 100% de DMSO a cada poço e agitar as placas à temperatura ambiente durante 10 min a 400 rpm. Leia a absorvência de cada poço em 595 nanômetro em um leitor da placa e exporte dados a uma folha de cálculo para a análise.

5. análise de dados

1. Realizar uma análise de contagens de células tdTomato e absorvências com software apropriado (planilha comercial, R). Calcule médias para a absorvência ou contagem de células dos três replicações DMSO em cada placa para fins de normalização, em seguida, divida o valor para as contagens de células ou absorvências para cada poço na placa por esta média e converta para uma porcentagem. Isso produz a contagem de células normalizadas ou a absorvância em relação ao controle DMSO para cada placa.
2. Calcule a contagem normalizada média ou a absorvância e o desvio padrão para os poços replicantes nas três placas.
   Nota: neste ponto deve haver quatro conjuntos diferentes de valores normalizados: um para cada uma das placas e uma média para as três placas replicantes.
3. Ser conservador e usar um valor normalizado em ou abaixo de 25% para a média entre as três placas replicar para classificar um composto como tóxico. Também, porque somente um único tratamento por o composto é executado em cada placa, somente os compostos da etiqueta que caem abaixo deste limiar em todas as três placas replicate como tóxicos. Examine imagens fluorescentes de todos os compostos que esta análise filtra como tóxico para confirmar visualmente a toxicidade.
   Nota: a identificação de compostos com um efeito inibidor de crescimento ou aumento do crescimento é mais difícil de avaliar em um ensaio exploratório deste tipo devido à falta de repetições em cada placa. No entanto, o seguinte é uma maneira rápida de identificar compostos que podem retardar ou aumentar o crescimento celular.
4. Calcule o desvio padrão para os três controles DMSO replicadas em cada placa e, em seguida, filtre para quaisquer compostos que tenham valores médios de pelo menos dois desvios padrão acima ou abaixo do controle DMSO. Os compostos que caem deste filtro em cada uma das três placas podem justificar uma investigação mais adicional.
5. Use a mesma estratégia de análise para a resposta da dose como a tela de toxicidade primária. Calcule as médias dos controles DMSO para cada replicação biológica e use esses valores para normalizar as células de porcentagem ao vivo ou os percentuais de absorvência para cada combinação de compostos/doses. Calcule os meios e o erro padrão dos meios para todas as combinações compostas/dose para as três repetições biológicas.
6. Transforme a concentração em seu valor de log, gere uma curva de resposta de dose para o log de concentração versus viabilidade normalizada, e ajuste a curva com uma análise de regressão não-linear (a análise pode ser realizada em R ou várias estatísticas comerciais pacotes). Calcule a dose letal 50 (ou tecnicamente, neste caso, a dose viável 50) ou concentração de composto que resulta em 50% de toxicidade a partir da equação desta curva. Muitos pacotes de software calcularão automaticamente esta figura.

Resultados

Os dados de contagem de células automatizadas identificaram onze compostos com menos de 25% de viabilidade quando normalizados para o controle DMSO, enquanto os dados do MTT identificaram esses mesmos compostos mais dois adicionais (tabela 1 e tabela 2, vermelho sombreado). Os dois compostos encontrados para serem tóxicos apenas no ensaio de MTT (poços F3 e G10) tiveram 31% e 39%, respectivamente, o número de células tdTomato-positivas como o controle e por ordem de classificação ...

Discussão

O objetivo preliminar deste artigo era descrever uma estratégia que pudesse eficientemente e barata identificar os compostos que afetam o crescimento da pilha em uma baixa-à avaliação da moderado-taxa de transferência. Duas técnicas ortogonais foram utilizadas para avaliar o número de células para aumentar a confiança nas conclusões e oferecer insights adicionais que não estariam disponíveis se apenas um único ensaio fosse utilizado. Um dos ensaios usou um Imager da pilha fluorescente para contar diretamente...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27 (50X)	ThermoFisher Scientific	17504001	Neural stem cell medium component.
BenchTop pipettor	Sorenson Bioscience	73990	Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.
BioLite 96 well multidish	Thermo Scientific	130188	Any 96 well cell culture plate will work.  We use these in our work.
Cell culture microscope	Nikon	Eclipse TS100	Visual inspection of cells to ensure proper density.
Cytation 5/ Imaging reader	BioTek	CYT3MFV	Used for cell imaging and absorbance readings.
DMSO	Fisher Scientific	610420010	Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.
FGF-basic	Peprotech	100-18B	Neural stem cell medium component.
GelTrex	ThermoFisher Scientific	A1413202	Neural stem cell basement membrane matrix.  Allows cells to attach to cell culture plates.
Gen5 3.04	BioTek		Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.
Glutamine	ThermoFisher Scientific	25030081	Neural stem cell medium component.
Microtest U-Bottom	Becton Dickinson	3077	Storage of compound libraries.
MTT	ThermoFisher Scientific	M6494	Active assay reagent to determine cellular viability.
Multichannel pippette	Rainin	E8-1200	Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.
Neurobasal medium	ThermoFisher Scientific	21103049	Neural stem cell base medium.
RFP filter cube	BioTek	1225103	Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.
TrypLE	ThermoFisher Scientific	12605036	Cell dissociation reagent.