Una estrategia para identificar compuestos que afectan el crecimiento celular y la supervivencia en células de mamíferos cultivadas a un rendimiento bajo a moderado

Resumen

A menudo es necesario evaluar la citotoxicidad potencial de un conjunto de compuestos en las células cultivadas. Aquí, describimos una estrategia para detectar compuestos tóxicos de forma fiable en un formato de 96 pozos.

Resumen

La citotoxicidad es un parámetro crítico que debe cuantificarse al estudiar fármacos que pueden tener beneficios terapéuticos. Debido a esto, muchos ensayos de detección de drogas utilizan citotoxicidad como una de las características críticas a perfilar para compuestos individuales. Las células en cultivo son un modelo útil para evaluar la citotoxicidad antes de proceder a dar seguimiento a compuestos de plomo prometedores en modelos animales más costosos e intensivos en mano de obra. Describimos una estrategia para identificar compuestos que afectan el crecimiento celular en una línea de células madre neuronales humanas (NSC) que expresan tdTomato. La estrategia utiliza dos ensayos complementarios para evaluar el número de celdas. Un ensayo funciona a través de la reducción de 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-dphenyltetrazolium bromide (MTT) al formazan como apoderado del número de celda y el otro cuenta directamente el tdTomato que expresa NSC. Los dos ensayos se pueden realizar simultáneamente en un solo experimento y no son intensivos en mano de obra, rápidos y baratos. La estrategia descrita en esta demostración probó 57 compuestos en una pantalla primaria exploratoria para la toxicidad en un formato de placa de 96 pocillos. Tres de los éxitos se caracterizaron aún más en una respuesta de dosis de seis puntos utilizando la misma configuración de ensayo que la pantalla principal. Además de proporcionar una excelente corroboración de la toxicidad, la comparación de los resultados de los dos ensayos puede ser eficaz en la identificación de compuestos que afectan a otros aspectos del crecimiento celular.

Introducción

Una de las características más importantes que debe determinarse para un compuesto químico que tiene potencial terapéutico es su toxicidad para las células animales. Esta característica determinará si un medicamento es un buen candidato para un estudio más extenso. En la mayoría de los casos, se buscan compuestos con toxicidad mínima, pero hay situaciones en las que un compuesto con capacidad para matar tipos de células específicas es de interés, por ejemplo, fármacos antitumoraligénicos. Aunque los animales enteros son los mejores sistemas modelo para determinar la toxicidad sistémica, el costo y la mano de obra implicadas es prohibitivo cuando es necesario probar más de unos pocos compuestos. Como tal cultivo celular de mamíferos se utiliza generalmente como la alternativa más eficiente^1,2. Las pantallas de fármacos de rendimiento pequeño a mediano son una modalidad importante a través de la cual se puede evaluar la toxicidad en el cultivo celular. Estas pantallas se pueden utilizar para interrogar bibliotecas anotadas dirigidas a vías de señalización individuales. El formato general de una pantalla de este tipo es probar inicialmente todos los compuestos de la biblioteca a una sola dosis (generalmente 10 m) en una pantalla exploratoria de toxicidad primaria, y luego realizar una pantalla de respuesta de dosis secundaria en profundidad para caracterizar completamente la toxicidad perfil de los aciertos de la pantalla principal. Los métodos para implementar esta estrategia se describirán aquí y proporcionarán una manera rápida, eficiente y económica de identificar y caracterizar compuestos tóxicos.

Se han desarrollado múltiples métodos para evaluar la citotoxicidad de compuestos pequeños y nanomateriales en células de mamíferos^3,4. Cabe señalar que ciertos materiales pueden interactuar con el ensayo proporcionando resultados engañosos, y tales interacciones deben probarse al caracterizar los golpes de las pantallas de toxicidad⁴. Los ensayos de citotoxicidad incluyen exclusión azul de trypan⁵, ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH)⁶, ensayo azul de Alamar⁷, éster de acetoximetil calcien (AM)⁸y el ensayo ATP⁹. Todos estos ensayos miden varios aspectos del metabolismo celular que pueden servir como un proxy para el número de celda. Si bien todos ofrecen beneficios, ensayos a base de sal de tetrazolium como 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-dphenyltelium bromuro (MTT), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide sal interna (XTT)-1, y 4-(3-[4-4- El disulfato de yodofenilo]-2-[4-nitrofenilo]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzeno disulfonato (WST-1)^10,11 proporcionan buena precisión y facilidad de uso a bajo costo. MTT, que se utilizará en esta demostración, se reduce a un formazán insoluble por una reductasa mitocondrial y la tasa de esta conversión se correlaciona fuertemente con el número de celda. Este ensayo se ha utilizado rutinariamente tanto a pequeña escala como para bibliotecas de cribado con hasta 2.000 compuestos^12. El recuento directo de células por un marcador etiquetado ofrece otro método para evaluar el número celular, y a diferencia del ensayo MTT puede proporcionar información adicional sobre la dinámica del crecimiento celular. Varios algoritmos disponibles públicamente están disponibles para realizar análisis automatizados de recuento de celdas y también hay algoritmos propietarios que forman parte de paquetes de software para lectores de imágenes^13,14. En esta descripción del método, una línea de células madre neuronales humanas (NSC) que ha sido editada genéticamente para expresar constitutivamente tdTomato¹⁵ servirá como una línea de prueba para comparar los resultados de viabilidad celular entre un ensayo MTT y un recuento automatizado de células ensayo en una pantalla que evalúe la toxicidad de 57 compuestos de ensayo. Aunque el objetivo principal de esta estrategia era identificar y caracterizar compuestos tóxicos, tiene el beneficio adicional de identificar potencialmente los compuestos inhibidores del crecimiento y mejorar el crecimiento y por lo tanto proporciona un método eficaz para identificar drogas que puede modular el crecimiento celular.

Protocolo

1. Cultura del NSC

NOTA: La manipulación de una línea NSC humana se describirá a continuación, pero cualquier línea celular se puede utilizar para este protocolo. Todo el trabajo de cultivo celular se realiza en un gabinete de seguridad biológica.

1. Recubrir una placa de 96 pocillos con membrana de sótano/matriz extracelular (ECM).
   1. Descongelar la alícuota de ECM(Tabla de Materiales),lo que facilitará la fijación de NSC, sobre hielo. Diluir ECM a la concentración adecuada (generalmente 1:100) en un medio base de 10 ml(Tabla de materiales)y añadir 50 ml por pocto a cada uno de los 60 pozos interiores de una placa de 96 pocillos(Figura 1). Utilice sólo los 60 pozos interiores para evitar artefactos que puedan resultar del efecto de borde¹⁶.
   2. Deje que la placa se quede a temperatura ambiente o en una incubadora de cultivo celular (37 oC, 5% CO₂) durante al menos 30 min.
2. Células madre neurales de disociación y placa.
   NOTA: Las células para su uso en este método deben crecer a por lo menos 80% de confluencia en un matraz T75.
   1. Células de cultivo en un matraz T75 en una incubadora de cultivo celular a 37oC y 5% co₂ en medio NSC que se compone de medio base, B27, aminoácidos no esenciales, glutamina de 2 mM y factor de crecimiento de fibroblasto básico de 10 ng/ml (FGFb o FGF2).
   2. Retire las células de la incubadora una vez que alcancen el 80% de confluencia y aspire el medio NSC. Añadir una cantidad adecuada de reactivo de disociación celular (3 ml para un matraz T75; Tabla de Materiales) e incubar durante 5 minutos en la incubadora.
   3. Después de la incubación, agregue 7 ml de medio NSC en el matraz T75 y pipeta vigorosamente para asegurar que todas las células se sequen. Transfiera la solución celular disociada a un tubo de 15 ml y centrífuga a 200 x g durante 5 min.
   4. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante del tubo y resuspenda las células en 10 ml de células medianas de NSC y cuente las células.
   5. Reajuste la concentración de células a 200.000 células/ml con medio NSC. Asegúrese de que las células estén completamente resuspendidas para un revestimiento homogéneo en pozos.
   6. Placa de 100 l de la mezcla celular (20.000 células) en los 60 pozos interiores de tres placas de 96 pocillos que han sido recubiertas como se describe en la sección 1.1. Utilice seis de las ocho ranuras de un pipeteador multicanal de 8 canales para placar celdas columna por columna.
   7. Añadir 100 s de medio base o medio NSC a todos los pozos sin células para minimizar la posible evaporación de los pozos más exteriores.
   8. Bajo un microscopio de cultivo celular, inspeccione visualmente al menos 10 pozos en cada una de las tres placas de 96 pocillos para confirmar que las células están sembradas a la densidad esperada. No proceda con el ensayo si las células están chapadas a una densidad demasiado dispersa o densa.

2. Tratamiento de células con compuestos

NOTA: La biblioteca casera probada en esta demostración contiene compuestos que modulan las vías de señalización sórtica/integrada (Wnt), el ácido retinoico, la transformación del factor de crecimiento beta (TGF-o) y las vías de señalización sónica de erizos, así como una variedad de quinasas de tirosina.

1. Pantalla primaria exploratoria para detectar toxicidad/número celular
   1. Aliquot 50-100 mL de hasta 57 compuestos de ensayo(Tabla Suplementaria 1) a una concentración de 10 mM en 100% dimetil sulfóxido (DMSO) en los 60 pozos interiores de una placa de 96 pocillos con fondo en U, de fondo en V o de fondo redondo con tres pozos DMSO como control (ver Figura 1 para un mapa de placas). Esto servirá como la placa compuesta maestra con 25 s de compuesto que se puede congelar y descongelar varias veces.
      NOTA: Las placas de fondo plano no deben utilizarse, ya que será más difícil aspirar pequeños volúmenes de compuestos de ellos con un pipeteador de sobremesa.
   2. Retire las placas de cultivo celular de la incubadora 16-24 h después de dividirlas como se describe en la sección 1 y aspirar la columna por columna mediana NSC con un pipetador multipozo de 8 canales utilizando solo seis de las ocho ranuras multipozo. Agregue 95 ml de medio NSC fresco a las células en cada una de las tres placas de réplica y vuelva a colocar las placas en la incubadora hasta que se complete el paso 2.1.4 a continuación.
   3. Añadir 49 l de medio NSC a cada uno de los 60 pozos interiores de una placa vacía de fondo en U, fondo en V o de fondo redondo de 96 pocillos con un pipeteador multipozo de 8 canales. Desensandar la placa compuesta maestra y utilizar un pipetador de sobremesa o un instrumento equivalente para pipetear 1 l de compuesto de la placa maestra en el medio DeNC de 49 ol en cada uno de los 60 pozos interiores.
   4. Mezclar el compuesto diluido 3x con el pipeteador de la parte superior del banco.
   5. Retire las tres placas de 96 pocillos de los SCN de la incubadora, pipeta de 15 l de cada compuesto diluido con el pipeteador de la parte superior del banco y dispensar una alícuota de 5 ol de compuesto en cada una de las tres placas.
      NOTA: Esta dilución 1:20 del compuesto en las células en combinación con la dilución inicial 1:50 en el paso 2.1.3 produce una dilución de 1:1000 de tal manera que la concentración final de los compuestos en los SCN será de 10 m con una concentración de DMSO de 0,1% y la concentración final concentración para los controles DMSO será del 0,1%.
   6. Incubar células con compuesto durante 72 h y proceder con ensayos de citotoxicidad. Se pueden utilizar intervalos más cortos, pero un período de incubación de 72 horas debe maximizar los posibles efectos citotóxicos de los compuestos probados.
2. Ensayo de respuesta a la dosis
   NOTA: La configuración del 96 pozo utilizado para la dosis-respuesta se muestra en la Figura 2.
   1. Utilice la columna 2 para seis réplicas de control DMSO y triplicados de prueba de hasta tres compuestos diferentes a diluciones seriales dobles a seis dosis a partir de una dosis alta de 10 m.
   2. Diluir 4 ml de DMSO o compuesto de ensayo en DMSO en 196 ml de medio NSC en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 25 l de DMSO a la columna de pozos de B2-G2 y 50 l de compuestos de ensayo a la fila de B3-B11 con los tres compuestos probados en triplicados de 10 mM en las filas B3-B5, B6-B8 y B9-B11.
   3. Pipetear 25 l de medio NSC a las columnas vacías restantes en la parte interior de la placa de 96 pocillos. Retire 25 ml de compuesto de los pozos B3-B11 con un pipeteador multicanal, agregue a los pozos C3-C11 y mezcle al menos cinco veces. Repita el proceso para que las filas restantes generen triplicados en dos diluciones para un total de seis dosis para cada uno de los compuestos.
   4. Genere Los NSC para la respuesta de dosis exactamente como se describe para la pantalla primaria en la sección 2.1. Los compuestos para la respuesta a la dosis se añaden e incuban en las células exactamente como se describe en los pasos 2.1.5 y 2.1.6.
      NOTA: Se realizan tres réplicas biológicas del ensayo de respuesta a la dosis repitiendo el ensayo en los SCN en diferentes pasajes en días separados.

3. Células de imagen en un lector de placas

1. Después de que las células han sido incubadas con compuestos para el tiempo asignado, las células de la imagen en un lector de placas para determinar el número de celda de pretratamiento por pozo.
   NOTA: Las instrucciones para las células de imágenes son específicas del lector, pero generalmente siguen una estrategia similar. Las instrucciones siguientes se aplican al lector utilizado en esta demostración (Tabla de materiales).
2. Retire la placa de la incubadora y colóquela dentro del lector de placas. Abra el software imager para configurar archivos de protocolo y experimento para el estudio. Vaya al modo Manual de Imager en el Administrador de tareas y haga clic en Capturar ahora....
3. Elija la placa de 96 pocillos como tipo de recipiente, seleccione 10x para la ampliación y proteína fluorescente roja (RFP) 531 y 593 para la toma de imágenes tdTomato. Elija un pozo y, a continuación, haga clic en Enfoque automático para enfocar la imagen y en Exponer automáticamente para obtener el tiempo de exposición adecuado. Ajuste manualmente el enfoque y la exposición si es necesario.
4. Una vez que se hayan obtenido el enfoque y la exposición adecuados, haga clic en el icono de la cámara para capturar la imagen. A continuación, haga clic en PROCESS/ANALZYE arriba de la imagen para continuar construyendo el protocolo y seleccione la pestaña ANALYSIS.
5. Haga clic en Análisis celular en AGREGAR PASO DE ANALISIS a la derecha de la imagen y haga clic en INICIO. La imagen mostrará las celdas resaltadas para indicar cada celda individual. Se puede hacer clic en la selección Opciones para modificar los parámetros para seleccionar mejor las celdas en función del umbral de fluorescencia o el tamaño de celda. Si el imager está contando correctamente las celdas, haga clic en AGREGAR PASO en la parte inferior de la pantalla.
6. Haga clic en el icono en la parte superior de la pantalla para crear experimento a partir de conjuntode imágenes, que abrirá una ventana con el experimento. Una vez abierto, haga clic en Procedimiento bajo la pestaña Protocolo y en la nueva ventana que abre seleccione Leer, luego en la nueva ventana haga clic en la placa completa para seleccionar sólo los 60 pozos que contienen las celdas (B2... G11). Haga clic en Aceptar para guardar los cambios y, a continuación, haga clic en Aceptar en la ventana Procedimiento.
7. La placa ahora puede ser imagendeada por este protocolo y el archivo experimental se puede guardar. Haga clic en el icono de reproducción para ejecutar la placa. Una vez que se haya realizado la imagen de la primera placa, grafique las otras dos placas. Al finalizar la creación de imágenes, descargue los datos del recuento de celdas en una hoja de cálculo para su análisis. Tome todas las imágenes con un aumento de 10x.

4. Ensayo de citotoxicidad de Terminal MTT

NOTA: Comience el ensayo de MTT dentro de las dos horas posteriores a completar la toma de imágenes tdTomato.

1. Realice una solución de 5 mg/ml de MTT pesando 25 mg de MTT y reponiéndola en 5 ml de medio NSC. Vortex la solución hasta que no haya precipitados visibles de MTT, que podría tomar varios minutos.
2. Retire las placas de cultivo celular de la incubadora y aspire fuera del medio de cultivo celular. Diluir MTT 1:10 en el medio de cultivo celular y añadir 100 l de MTT a cada pozo de células.
3. Incubar células a 37oC durante 2 h. Un precipitado púrpura debe ser visible aproximadamente en proporción al número de células en el pozo. Aspirar la solución MTT fuera de las placas o invertir la placa rápidamente para mover la solución fuera de la placa.
4. Añadir 50 s de 100% DMSO a cada pocto y agitar las placas a temperatura ambiente durante 10 minutos a 400 rpm. Lea la absorbancia de cada pozo a 595 nm en un lector de placas y exporte datos a una hoja de cálculo para su análisis.

5. Análisis de datos

1. Realice un análisis de los recuentos de células tdTomato y absorbancias con el software adecuado (hoja de cálculo comercial, R). Calcule los promedios para la absorbancia o el recuento de celdas de las tres réplicas DMSO en cada placa para fines de normalización, luego divida el valor para los recuentos de celdas o absorbancias para cada pozo de la placa por este promedio y conviértalo en un porcentaje. Esto produce el recuento de celdas normalizado o la absorbancia en relación con el control DMSO para cada placa.
2. Calcule el recuento o absorbancia normalizado medio y la desviación estándar para replicar pozos en las tres placas.
   NOTA: En este punto debe haber cuatro conjuntos diferentes de valores normalizados: uno para cada una de las placas y una media para las tres placas de réplica.
3. Sea conservador y utilice un valor normalizado en o por debajo del 25% para el promedio en las tres placas de réplica para clasificar un compuesto como tóxico. Además, debido a que sólo se realiza un único tratamiento por compuesto en cada placa, sólo los compuestos de etiqueta que caen por debajo de este umbral en las tres placas de réplica como tóxicos. Examine las imágenes fluorescentes de todos los compuestos que este análisis filtra como tóxicos para confirmar visualmente la toxicidad.
   NOTA: La identificación de compuestos con un efecto inhibitorio de crecimiento o mejora del crecimiento es más difícil de evaluar en un ensayo exploratorio de este tipo debido a la falta de réplicas en cada placa. Sin embargo, la siguiente es una manera rápida de identificar compuestos que pueden ralentizar o mejorar el crecimiento celular.
4. Calcule la desviación estándar para los tres controles DMSO de réplica en cada placa y, a continuación, filtre los compuestos que tengan valores medios al menos dos desviaciones estándar por encima o por debajo del control DMSO. Los compuestos que caen fuera de este filtro en cada una de las tres placas pueden justificar una investigación adicional.
5. Utilice la misma estrategia de análisis para la respuesta a la dosis que la pantalla de toxicidad primaria. Calcule los promedios de los controles DMSO para cada réplica biológica y utilice estos valores para normalizar el porcentaje de células vivas o el porcentaje de absorbancias para cada combinación compuesta/dosis. Calcular los medios y el error estándar de los medios para todas las combinaciones compuestas/dosis para las tres réplicas biológicas.
6. Transformar la concentración a su valor de registro, generar una curva de respuesta de dosis para el registro de concentración frente a la viabilidad normalizada, y ajustar la curva con un análisis de regresión no lineal (el análisis se puede realizar en R o en varias estadísticas comerciales paquetes). Calcular la dosis letal 50 (o técnicamente en este caso la dosis viable 50) o la concentración de compuesto que resulta en 50% toxicidad de la ecuación de esta curva. Muchos paquetes de software calcularán automáticamente esta cifra.

Resultados

Los datos automatizados del recuento de células identificaron once compuestos con menos del 25% de viabilidad cuando se normalizan al control DMSO, mientras que los datos MTT identificaron estos mismos compuestos más dos adicionales(Tabla 1 y Tabla 2,rojo sombreado). Los dos compuestos encontrados tóxicos sólo en el ensayo MTT (pozos F3 y G10) tenían 31% y 39%, respectivamente, el número de células tdTomato-positivas como el control y por orden de rango fueron los dos compuestos m...

Discusión

El objetivo principal de este artículo era describir una estrategia que pudiera identificar de manera eficiente y económica compuestos que afectan el crecimiento celular en un cribado de bajo a moderado rendimiento. Se utilizaron dos técnicas ortogonales para evaluar el número de células para aumentar la confianza en las conclusiones y ofrecer información adicional que no estaría disponible si solo se utilizara un solo ensayo. Uno de los ensayos utilizó un imager de células fluorescentes para contar directamente...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27 (50X)	ThermoFisher Scientific	17504001	Neural stem cell medium component.
BenchTop pipettor	Sorenson Bioscience	73990	Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.
BioLite 96 well multidish	Thermo Scientific	130188	Any 96 well cell culture plate will work.  We use these in our work.
Cell culture microscope	Nikon	Eclipse TS100	Visual inspection of cells to ensure proper density.
Cytation 5/ Imaging reader	BioTek	CYT3MFV	Used for cell imaging and absorbance readings.
DMSO	Fisher Scientific	610420010	Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.
FGF-basic	Peprotech	100-18B	Neural stem cell medium component.
GelTrex	ThermoFisher Scientific	A1413202	Neural stem cell basement membrane matrix.  Allows cells to attach to cell culture plates.
Gen5 3.04	BioTek		Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.
Glutamine	ThermoFisher Scientific	25030081	Neural stem cell medium component.
Microtest U-Bottom	Becton Dickinson	3077	Storage of compound libraries.
MTT	ThermoFisher Scientific	M6494	Active assay reagent to determine cellular viability.
Multichannel pippette	Rainin	E8-1200	Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.
Neurobasal medium	ThermoFisher Scientific	21103049	Neural stem cell base medium.
RFP filter cube	BioTek	1225103	Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.
TrypLE	ThermoFisher Scientific	12605036	Cell dissociation reagent.