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요약

배양 된 세포에 화합물 세트의 잠재적 인 세포 독성을 평가하는 것이 종종 필요합니다. 여기서, 우리는 96 웰 형식으로 독성 화합물을 안정적으로 선별하는 전략을 설명합니다.

초록

세포 독성은 치료 혜택을 가질 수 있는 약물을 공부할 때 정량화 될 필요가 중요 한 매개 변수. 이 때문에, 많은 약물 스크리닝 검사는 개별 화합물에 대해 프로파일화되는 중요한 특성 중 하나로 세포 독성을 이용한다. 배양되는 세포는 더 비싸고 노동 집약적인 동물 모형에 있는 유망한 지도 화합물에 후속을 진행하기 전에 세포 독성을 평가하는 유용한 모형입니다. 우리는 인간 신경 줄기 세포 (NSC) 선을 표현하는 tdTomato에 있는 세포 성장에 영향을 미치는 화합물을 확인하는 전략을 기술합니다. 이 전략은 세포 수를 평가하기 위해 2개의 상보적인 assays를 이용합니다. 1개의 분석제는 3-(4,5-디메틸티졸-2-yl)-2,5-디페닐테틀라졸륨 브로마이드(MTT)의 감소를 통해 세포 수에 대한 프록시로서 포르마잔을 하고 다른 하나는 직접 TdTomato 발현 NSC를 계산한다. 2개의 실험은 단 하나 실험에서 동시에 수행될 수 있고 노동 집약적이고, 급속하고, 저렴하지 않습니다. 이 데모에 설명된 전략은 96웰 플레이트 형식의 독성에 대한 예비 1차 화면에서 57개의 화합물을 테스트했습니다. 3개의 안타는 1차 화면과 동일한 분석 설정을 사용하여 6점 투여 반응에서 더 특징을 보였다. 독성에 대한 우수한 부식을 제공하는 것 외에도, 두 가지 측정법의 결과의 비교는 세포 성장의 다른 양상에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 데 효과적일 수 있다.

서문

치료 잠재력을 가지고 있는 화학 화합물에 대 한 결정 해야 하는 가장 중요 한 특성 중 하나는 동물 세포에 그것의 독성. 이 특성은 약물이 더 광범위한 연구를위한 좋은 후보인지 여부를 결정합니다. 대부분의 경우, 최소한의 독성을 가진 화합물이 모색되지만 특정 세포 유형을 죽일 수 있는 능력을 가진 화합물이 관심있는 상황이 있습니다, 예를 들어, 항 종양성 약물. 전체 동물이 전신 독성을 결정하는 가장 좋은 모델 시스템이지만, 몇 가지 화합물을 테스트해야 할 때 관련된 비용과 노동력은 엄다합니다. 이와 같은 포유류 세포 배양은 일반적으로 가장 효율적인대안1,2로사용된다. 중소형 처리량 약물 스크린은 세포 배양에서 독성을 평가할 수 있는 중요한 양상입니다. 이러한 화면은 개별 신호 경로를 대상으로 하는 추가라이브러리를 심문하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 스크린의 일반적인 형식은 처음에 예비 1차 독성 화면에서 단일 용량(일반적으로 10 μM)으로 라이브러리의 모든 화합물을 테스트한 다음, 독성을 완전히 특성화하기 위해 심층적인 이차 용량 응답 스크린을 수행하는 것입니다. 기본 화면에서 조회수의 프로필을 볼 수 있습니다. 이 전략을 구현하는 방법은 여기에 설명되어 독성 화합물을 식별하고 특성화하는 빠르고 효율적이며 저렴한 방법을 제공합니다.

포유류 세포에서 작은 화합물 및 나노 물질의 세포 독성을 평가하기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다3,4. 특정 물질이 잘못된 결과를 제공하는 분석과 상호 작용할 수 있으며, 독성 화면에서 안타를 특성화 할 때 이러한 상호 작용을 테스트해야합니다4. 세포독성 분석법은 트라이판 블루 배제5,락테이트 탈수소효소(LDH) 방출분석분석6,알라마르블루분석7,칼시엔 아세톡시메틸에스테르(AM)8,ATP 분석기9를포함한다. 이 모든 측정은 세포 번호에 대한 프록시 역할을 할 수있는 세포 대사의 다양한 측면을 측정합니다. 모든 혜택을 제공하는 동안, 테트라 졸륨 염계 측정기 3-(4,5-디메틸티졸-2-yl)-2,5-디페닐테테라졸리움 브로마이드(MTT), 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페니)-2H-테트라즈리움-1-카르데 및 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-니트로페닐]-2H-5-테트라졸리오)-1,3-벤젠 이설포네이트 (WST-1)10,11은 저렴한 비용으로 좋은 정확성과 사용 편의성을 제공합니다. 이 데모에서 사용되는 MTT는 미토콘드리아 환원효소에 의해 불용성 포르마잔으로 감소되고 이 변환의 속도는 세포 수와 강하게 상관관계가 있다. 이 분석은 작은 규모와 최대 2,000 개의 화합물12를가진 선별 라이브러리에 일상적으로 활용되었습니다. 표지된 마커에 의한 세포의 직접 계수는 세포 수를 평가하는 또 다른 방법을 제공하며, MTT 분석과는 달리 세포 성장의 역학에 대한 추가 정보를 제공할 수 있다. 공개적으로 사용할 수 있는 여러 알고리즘은 자동화된 셀 수 분석을 수행할 수 있으며 이미징 판독기13,14를위한 소프트웨어 패키지의 일부인 독점 알고리즘도 있습니다. 이 방법 설명에서, tdTomato15를 구성적으로 발현하기 위해 유전자 편집된 인간 신경 줄기 세포(NSC) 라인은 MTT 분석과 자동화된 세포 계수 사이의 세포 생존 결과를 비교하는 테스트 라인역할을 할 것이다. 57 개의 시험 화합물의 독성을 평가하는 화면에서 분석. 이 전략의 주요 목표는 독성 화합물을 식별하고 특성화하는 것이었지만, 잠재적으로 성장 억제 및 성장 강화 화합물을 식별하는 추가적인 이점을 가지고 있으므로 약물을 식별하는 효과적인 방법을 제공합니다. 즉, 세포 성장을 조절 할 수 있습니다.

프로토콜

1. NSC 문화

참고: 인간 NSC 라인의 조작은 아래에 설명될 것이지만 모든 세포주가 이 프로토콜에 사용될 수 있다. 모든 세포 배양 작업은 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다.

  1. 지하 막 / 세포 외 매트릭스 (ECM)로 96 웰 플레이트를 코팅하십시오.
    1. 얼음에 NSC의 부착을 용이하게하는 ECM(재료의 테이블)의aliquot를 해동합니다. ECM을 10 mL 염기배지(표)에서적절한 농도(일반적으로 1:100)로 희석하고, 96웰 플레이트의 60개의 내부 웰각각에 웰당 50 μL을 첨가한다(그림1). 가장자리 효과16에서발생할 수 있는 아티팩트를 피하기 위해 내부 60웰만 사용하십시오.
    2. 플레이트를 실온 또는 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에적어도 30분 동안 앉게 한다.
  2. 해리 및 플레이트 신경 줄기 세포.
    참고: 이 방법에서 사용하기 위한 세포는 T75 플라스크에서 적어도 80% 합류로 성장되어야 한다.
    1. 37°C에서 세포 배양 인큐베이터에서 T75 플라스크에서 배양 세포는 기본 배지, B27, 비필수 아미노산, 2 mM 글루타민, 및 10 ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자(FGFb 또는 FGF2)로 구성된 NSC배지에서 5% CO2를 한다.
    2. 인큐베이터에서 세포를 제거하고 80 % 합류에 도달하면 NSC 배지를 흡인하십시오. 적당량의 세포 해리 시약(T75 플라스크의 경우 3 mL) 첨가; 재료 표) 인큐베이터에서 5분 동안 배양합니다.
    3. 배양 후, 모든 세포가 분리될 수 있도록 T75 플라스크와 피펫에 NSC 배지 7mL를 적극적으로 첨가합니다. 해리된 세포 용액을 15 mL 튜브 및 원심분리기를 200 x g에서 5분 동안 이송합니다.
    4. 원심 분리 후, 관에서 상온을 제거하고 NSC 배지 및 카운트 세포의 10 mL에서 세포를 다시 중단.
    5. NSC 배지로 세포의 농도를 200,000 세포/mL로 재조정합니다. 웰에 균일 한 도금세포를 완전히 재중단되었는지 확인하십시오.
    6. 플레이트 100 μL은 섹션 1.1에 기재된 바와 같이 코팅된 3개의 96웰 플레이트의 60개의 내부 웰에서 세포 혼합물(20,000 셀)을 한다. 8채널 멀티채널 파이펫터의 8개 슬롯 중 6개 슬롯을 열별로 플레이트 셀에 사용합니다.
    7. 셀이 없는 모든 웰에 100 μL의 염기 배지 또는 NSC 배지를 추가하여 가장 바깥쪽 우물에서 발생할 수 있는 증발을 최소화합니다.
    8. 세포 배양 현미경하에서, 세포가 예상 된 밀도에서 시드되는지 확인하기 위해 3 개의 96 웰 플레이트 각각에 적어도 10 개의 우물을 육안으로 검사합니다. 세포가 너무 희소하거나 조밀 한 밀도로 도금된 경우 분석으로 진행하지 마십시오.

2. 화합물로 세포 치료

참고 : 이 데모에서 테스트 된 홈 메이드 라이브러리에는 날개없는 / 통합 (Wnt), 레티노산, 성장 인자 베타 (TGF-β) 및 소닉 고슴도치 신호 경로뿐만 아니라 다양한 티로신 키나아제를 조절하는 화합물이 포함되어 있습니다.

  1. 독성/세포 수에 대한 예비 1차 화면
    1. Aliquot 50-100 mL 의 50-100 mL 의 57 테스트 화합물(보충 표 1)100% 디메틸 설폭화물 (DMSO)에 10mMM의 농도로 내부 60 웰의 U 바닥, V 바닥 또는 둥근 바닥 96 웰 플레이트와 3 개의 DMSO 우물을 제어 (참조) 플레이트 맵에 대한 그림 1). 이것은 여러 번 동결 및 해동될 수 있는 화합물의 25 μL을 가진 마스터 화합물 플레이트로서 작용할 것이다.
      참고 : 평평한 바닥 판은 벤치 상단 파이프터로 소량의 화합물을 흡인하는 것이 더 어려울 것이기 때문에 사용해서는 안됩니다.
    2. 섹션 1에 기재된 바와 같이 분할후 인큐베이터 16-24시간에서 세포 배양 플레이트를 제거하고 8채널 멀티웰 플롯 중 6개만을 사용하여 8채널 멀티웰 피펫기로 NSC 배지 컬럼바이컬을 흡인한다. 3개의 복제 플레이트 각각에 95 μL의 신선한 NSC 배지를 첨가하고 아래 2.1.4단계가 완료될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 다시 놓습니다.
    3. 8채널 멀티웰 피펫터가 있는 빈 U-bottom, V-바닥 또는 둥근 바닥 96웰 플레이트의 내부 60개 웰각각에 49 μL의 NSC 배지를 추가합니다. 마스터 컴파운드 플레이트를 풀고 벤치 상부 피펫터 또는 동등한 계측기를 사용하여 마스터 플레이트로부터 화합물의 1 μL을 각각의 내부 60웰에서 NSC 배지의 49 μL로 파이펫에 넣습니다.
    4. 희석된 화합물을 벤치 상단 피펫터와 3x 혼합합니다.
    5. 인큐베이터에서 3개의 96웰 플레이트를 제거하고, 벤치 탑 피펫으로 각 희석 화합물의 피펫 15 μL을 제거하고 3개의 플레이트 각각에 5 μL의 화합물을 분배한다.
      참고: 이 1:20 단계 2.1.3단계에서 초기 1:50 희석과 함께 세포 내로 화합물의 희석은 1:1000 희석을 산출하여 NSC에 화합물의 최종 농도가 0.1%의 DMSO 농도와 최종 10 μM이 되도록 합니다. DMSO 제어에 대한 농도는 0.1%가 됩니다.
    6. 72 시간 동안 화합물로 세포를 배양하고 세포 독성 세포 독성 세포 로 진행합니다. 더 짧은 간격을 사용할 수 있습니다 하지만 72 시간 잠복기 테스트 화합물의 잠재적인 세포 독성 효과 극대화 한다.
  2. 투여량 반응 분석
    참고: 투여량 응답에 사용되는 96웰에 대한 설정은 그림 2에 표시되어 있습니다.
    1. 6개의 DMSO 대조군을 위해 컬럼 2를 사용하여 10 μM의 고용량으로 시작하여 6회 투여량에서 2배 직렬 희석에서 최대 3개의 상이한 화합물을 복제하고 시험합니다.
    2. DMSO 또는 시험 화합물 의 4 μL을 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에서 NSC 배지의 196 μL로 희석한다. B2-G2의 우물 열에 25 μL의 DMSO를 추가하고 B3-B11에서 테스트 화합물의 50 μL을 행에 추가하고 10 mM의 세 가지 테스트 화합물을 B3-B5, B6-B8 및 B9-B11행으로 삼중배액으로 추가합니다.
    3. 96웰 플레이트의 내부 부에 남아 있는 빈 컬럼에 NSC 배지의 피펫 25 μL. 다중 채널 파이펫터로 웰 B3-B11에서 25 μL의 화합물을 제거하고, 웰 C3-C11에 추가하고, 적어도 5번 혼합합니다. 나머지 행에 대 한 프로세스를 반복 2 배 희석에서 삼각계를 생성 하는 각 화합물에 대 한 총 6 개의 복용량에 대 한.
    4. 섹션 2.1에서 기본 화면에 대해 설명된 대로 투여량 응답에 대한 NSC를 생성한다. 투여량 반응에 대한 화합물은 단계 2.1.5 및 2.1.6에 기재된 바와 같이 세포상에 정확하게 첨가및 배양된다.
      참고: 투여량 반응 분석의 3개의 생물학적 복제는 별도의 날에 상이한 구절에서 NSC에 대한 분석검사를 반복함으로써 수행된다.

3. 플레이트 리더의 이미징 셀

  1. 세포가 할당된 시간 동안 화합물로 배양된 후, 플레이트 리더상에서 이미지 셀은 웰당 전처리 세포 수를 결정한다.
    참고 : 이미징 세포에 대한 지침은 독자에 특정하지만 일반적으로 유사한 전략을 따릅니다. 아래 지침은 이데모(재질 표)에사용된 판독기에 적용됩니다.
  2. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 플레이트 리더 내부에 놓습니다. 이미저 소프트웨어를 열어 스터디용 프로토콜 및 실험 파일을 설정합니다. 작업 관리자에서 이미저 수동 모드로 이동하여 지금 캡처를 클릭합니다....
  3. 용기 유형으로 96웰 플레이트를 선택하고 배율을 위해 10x를 선택하고, 이미징 tdTomato의 경우 적색 형광 단백질(RFP) 531 및 593을 선택합니다. 웰을 선택한 다음 자동 초점을 클릭하여 이미지에 초점을 맞추고 적절한 노출 시간을 위해 자동 노출을 클릭합니다. 필요한 경우 초점과 노출을 수동으로 조정합니다.
  4. 적절한 초점과 노출이 완료되면 카메라 아이콘을 클릭하여 사진을 캡처합니다. 그런 다음 이미지 위의 프로세스/ANALZYE를 클릭하여 프로토콜을 계속 빌드하고 분석 탭을 선택합니다.
  5. 이미지 오른쪽에 있는 분석 추가 단계에서 셀룰러 분석을 클릭하고 시작을 클릭합니다. 각 개별 셀을 나타내기 위해 강조 표시된 셀이 이미지에 표시됩니다. 옵션 선택을 클릭하여 형광 임계값 또는 셀 크기에 따라 더 나은 셀을 선택하도록 매개 변수를 변경할 수 있습니다. 이미저에서 셀을 올바르게 계산하는 경우 화면 하단의 단계 추가를 클릭합니다.
  6. 화면 상단의 아이콘을 클릭하여 이미지 세트에서 실험 만들기를클릭하여 실험창을 엽니다. 일단 열리면 프로토콜 탭 아래에서 프로시저를 클릭하고 열리는 새 창에서 읽기를선택한 다음 새 창에서 전체 플레이트를 클릭하여 셀을 포함하는 60개의 웰만 선택합니다(B2... G11). 확인을 클릭하여 변경 내용을 저장한 다음 절차 창에서 확인을 클릭합니다.
  7. 이제 이 프로토콜로 플레이트를 이미지화할 수 있으며 실험 파일을 저장할 수 있습니다. 플레이트를 실행하려면 재생 아이콘을 클릭합니다. 첫 번째 플레이트가 이미지화되면 다른 두 플레이트를 이미지화합니다. 이미징이 완료되면 분석을 위해 셀 카운트 데이터를 스프레드시트에 다운로드합니다. 모든 이미지를 10배 배율로 찍습니다.

4. 말단 MTT 세포 독성 분석

참고 : tdTomato 이미징을 완료 한 후 2 시간 이내에 MTT 분석시험을 시작합니다.

  1. 25 mg의 MTT를 계량하고 NSC 매체의 5 mL에서 다시 중단하여 5 mg / mL MTT 재고 솔루션을 만드십시오. MTT의 눈에 보이는 침전이 없을 때까지 용액을 소용돌이치며, 이는 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
  2. 인큐베이터로부터 세포 배양 판을 제거하고 세포 배양 배지를 흡인한다. MTT 1:10을 세포 배양 배지에서 희석시키고 각 유정에 MTT 100 μL을 첨가한다.
  3. 2 시간 동안 37 °C에서 세포를 배양합니다. 보라색 침전제는 우물에있는 세포의 수에 비례하여 대략 적으로 볼 수 있어야합니다. MTT 용액을 플레이트에서 흡인하거나 플레이트를 신속하게 반전하여 플레이트에서 용액을 플릭합니다.
  4. 각 우물에 50 μL의 100% DMSO를 추가하고 400 rpm에서 10 분 동안 실온에서 접시를 흔들어줍니다. 플레이트 리더에서 595 nm에서 각 웰의 흡광도를 읽고 분석을 위해 스프레드시트로 데이터를 내보냅니다.

5. 데이터 분석

  1. 적절한 소프트웨어 (상용 스프레드 시트, R)와 tdTomato 세포 수와 흡광도의 분석을 수행합니다. 정상화를 위해 각 플레이트에 복제된 3개의 DMSO 의 흡광도 또는 셀 수에 대한 평균을 계산한 다음 플레이트의 각 웰에 대한 셀 수 또는 흡광도값을 이 평균으로 나누고 백분율로 변환합니다. 이것은 각 플레이트에 대한 DMSO 제어에 비해 정규화된 세포 수 또는 흡광도를 산출한다.
  2. 세 플레이트의 복제 웰에 대한 평균 정규화 개수 또는 흡광도 및 표준 편차를 계산합니다.
    참고: 이 시점에서 정규화된 값의 네 가지 세트가 있어야 합니다: 각 플레이트에 대해 하나, 세 개의 복제 플레이트에 대해 평균 하나.
  3. 세 복제 플레이트에 걸쳐 평균에 대해 25% 이하의 정규화된 값을 사용하여 화합물을 독성으로 분류합니다. 또한, 화합물당 단일 처리만이 각 플레이트에서 수행되므로, 3개의 복제 플레이트 모두에 이 임계값 이하로 떨어지는 화합물만 독성으로 분류됩니다. 이 분석이 독성으로 필터링하여 독성을 시각적으로 확인하는 모든 화합물의 형광 이미지를 검사합니다.
    참고: 성장 억제 또는 성장 강화 효과를 가진 화합물의 식별은 각 플레이트에 복제물이 부족하기 때문에 이러한 유형의 예비 분석에서 평가하기가 더 어렵다. 그러나, 다음은 감속 하거나 세포 성장을 향상 시킬 수 있는 화합물을 식별 하는 빠른 방법.
  4. 각 플레이트에서 3개의 복제 된 DMSO 컨트롤에 대한 표준 편차를 계산한 다음 DMSO 컨트롤 위 또는 아래에 평균 값이 두 개 이상 있는 화합물을 필터링합니다. 세 판의 각각에이 필터에서 떨어지는 화합물은 추가 조사를 보증 할 수있다.
  5. 1차 독성 스크린으로서 투여량 반응에 대해 동일한 분석 전략을 사용한다. 각 생물학적 복제에 대한 DMSO 컨트롤의 평균을 계산하고 이러한 값을 사용하여 각 화합물/투여량 조합에 대한 백분율 라이브 셀 또는 퍼센트 흡광도를 정규화합니다. 세 가지 생물학적 복제에 대한 모든 화합물/투여량 조합에 대한 평균 및 표준 오차를 계산합니다.
  6. 농도를 로그 값으로 변환하고, 농도 로그 대 정규화된 생존 가능성에 대한 투여량 응답 곡선을 생성하고, 비선형 회귀 분석으로 곡선에 맞춥습니다(분석은 R 또는 다양한 상업적 통계에서 수행될 수 있습니다) 패키지)를 참조하십시오. 치명적인 복용량을 계산 50 (또는 기술적으로이 경우 실행 가능한 복용량 50) 또는 이 곡선의 방정식에서 50% 독성을 초래 하는 화합물의 농도. 많은 소프트웨어 패키지가 자동으로 이 수치를 계산합니다.

결과

자동화된 셀 카운트 데이터는 DMSO 제어로 정규화될 때 25% 미만의 생존율로 11개의 화합물을 확인했으며 MTT 데이터는 이러한 동일한 화합물과 2개의 추가 화합물을 확인하였다(표1 및 표 2,적색). MTT 분석(wells F3 및 G10)에서만 독성이 있는 것으로 밝혀진 두 화합물은 각각 31%와 39%를 가졌고, 대조군및 계급 순서에 의한 tdTomato 양성 세포의 수는 독성으로 간주된 후 이 라이브러...

토론

이 문서의 주요 목표는 낮은-중간 처리량 스크리닝에서 세포 성장에 영향을 미치는 화합물을 효율적이고 저렴하게 식별할 수 있는 전략을 설명하는 것이었습니다. 2개의 직교 기술은 결론에 있는 신뢰를 증가하고 단 하나 분석분석만 사용된 경우에 유효하지 않을 추가 통찰력을 제안하기 위하여 세포 수를 평가하기 위하여 이용되었습니다. 상기 한 가지 는 형광 세포 이미저를 사용하여 tdTomato 양...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

이 작품은 NINDS 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
B-27 (50X)ThermoFisher Scientific17504001Neural stem cell medium component.  
BenchTop pipettorSorenson Bioscience73990Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot.
BioLite 96 well multidishThermo Scientific130188Any 96 well cell culture plate will work.  We use these in our work.
Cell culture microscopeNikonEclipse TS100Visual inspection of cells to ensure proper density.
Cytation 5/ Imaging readerBioTekCYT3MFVUsed for cell imaging and absorbance readings.
DMSOFisher Scientific610420010Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements.
FGF-basicPeprotech100-18BNeural stem cell medium component.  
GelTrexThermoFisher ScientificA1413202Neural stem cell basement membrane matrix.  Allows cells to attach to cell culture plates.
Gen5 3.04BioTekAnalysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells.
GlutamineThermoFisher Scientific25030081Neural stem cell medium component.  
Microtest U-BottomBecton Dickinson3077Storage of compound libraries.
MTTThermoFisher ScientificM6494Active assay reagent to determine cellular viability.
Multichannel pippetteRaininE8-1200Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO.
Neurobasal mediumThermoFisher Scientific21103049Neural stem cell base medium.
RFP filter cubeBioTek1225103Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells.
TrypLEThermoFisher Scientific12605036Cell dissociation reagent.

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