JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نصف طريقة لاستخدام قياس التدفق متعدد المعلمات للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعليالميتوكوندريا (ROS) في الجذعية المكونة للدم الصحية والخلايا السلف الصحية (HSPCs) وخلايا سرطان الدم من نموذج الماوس من ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) مدفوعا MLL-AF9.

Abstract

نقدم نهج قياس التدفق لتحليل الميتوكوندريا ROS في مختلف النخاع العظمي الحي (BM) المستمدة من الجذعية وخلايا السلف من الفئران السليمة وكذلك الفئران مع مكافحة غسل الأموال التي يقودها MLL-AF9. على وجه التحديد، ونحن نصف عملية تلطيخ الخلايا من خطوتين، حيث يتم تلوين الخلايا BM صحية أو سرطان الدم أولا مع صبغة فلورية التي تكشف عن الأكاسيد الفائقة الميتوكوندريا، تليها تلطيخ مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المرتبطة بالفلوروكروم التي تستخدم للتمييز بين مختلف السكان السلف المكونة للدم صحية وخبيثة. كما نقدم استراتيجية للحصول على العينات وتحليلها عن طريق قياس التدفق. ويمكن تنفيذ البروتوكول بأكمله في إطار زمني قصير يصل إلى 3-4 ح. كما نسلط الضوء على المتغيرات الرئيسية التي يجب أخذها في الاعتبار وكذلك مزايا وقيود مراقبة إنتاج ROS في المقصورة الميتوكوندريا للخلايا الحية وجذع ابيضاض الدم والخلايا الفرعية السلف باستخدام الأصباغ الفلورية عن طريق قياس التدفق . وعلاوة على ذلك، نقدم بيانات أن وفرة ROS الميتوكوندريا تختلف بين السكان الفرعيين HSPC صحية متميزة وذرية سرطان الدم ومناقشة التطبيقات المحتملة لهذه التقنية في بحوث الدم.

Introduction

أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي جزيئات تفاعلية عالية مشتقة من الأكسجين الجزيئي. الموقع الخلوي الأكثر تحديدا من إنتاج ROS هو الميتوكوندريا، حيث يتم امتصاص الإلكترونات التي تمر عبر سلسلة نقل الإلكترون (ETC) أثناء الفسفورية التأكسدية (OXPHOS) عن طريق الأكسجين الجزيئي مما يؤدي إلى تشكيل محددة نوع من ROS يسمى الأكاسيد الفائقة1. من خلال إجراءات سلسلة من الإنزيمات، تسمى ديسموتاسيس فوق أكسيد أو SODs، يتم تحويل الأكاسيد الفوقية إلى بيروكسيد الهيدروجين، والتي يتم تحييدها في وقت لاحق في الماء بواسطة إنزيمات مثل الكاتالاز أو الجلوتاثيون بيروكسيداسيس (GPX). يمكن أن تؤدي الاضطرابات في آليات تنظيم ROS إلى الإنتاج الزائد من ROS، والتي غالباً ما يشار إليها باسم الإجهاد التأكسدي، والتي لها عواقب خلوية ضارة وقاتلة مثل تلف جزيء الماكرو (أي الحمض النووي والبروتين والدهون). وعلاوة على ذلك، يرتبط الإجهاد التأكسدي إلى العديد من الأمراض، مثل مرض السكري والأمراض الالتهابية والشيخوخة والأورام2،3،4. للحفاظ على التوازن الأكسدة ومنع الإجهاد التأكسدي، والخلايا تمتلك مجموعة متنوعة من آليات تنظيم ROS5.

المستويات الفسيولوجية لبعض ROS ضرورية للسلّم الأوّل والبالغين 6. ومع ذلك، يرتبط ROS الزائدة مع تلف الحمض النووي، والتمايز الخلوي واستنفاد الجذعية المكونة للدم وتجمع السلف. وهناك أيضا أدلة على أن التعديلات في علم الأحياء الأكسدة قد تختلف بين سرطان الدم والخلايا السليمة. على سبيل المثال، مستويات ROS تميل إلى أن تكون أعلى في خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) نسبة إلى نظرائهم الأصحاء ودراسات أخرى قد اقترحت أن الخلايا الجذعية سرطان الدم الحفاظ على مستوى ثابت منخفض من ROS للبقاء على قيد الحياة7،8. الأهم من ذلك، وقد أظهرت استراتيجيات للاستفادة العلاجية على هذه الاختلافات الأكسدة الوعد في العديد من إعدادات السرطان البشري9،10. لذلك، فإن الاختبارات التي تسمح بتقييم مستويات ROS في نماذج الماوس قد تحسن فهمنا لكيفية مساهمة هذه الأنواع في علم وظائف الأعضاء الخلوية ومسببات الأمراض، فضلا عن إمكانية توفير منصة لتقييم فعالية العلاجات الجديدة التي تستهدف السرطان.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في مركز فوكس تشيس للسرطان.

ملاحظة: وينقسم سير عمل البروتوكول إلى 4 أجزاء كما هو موضح في الشكل 1 ويتم سرد الكواشف المطلوبة في جدول المواد.

1. نخاع العظام (BM) العزلة

ملاحظة: تم إنشاء MLL-AF9 الفئران سرطان الدم كما هو موضح سابقا11.

  1. استعادة خلايا نخاع العظام أحادية النووية، كما هو موضح سابقا12،13،14،15، من نوع البرية C57.Bl6 الفئران (التي تعبر عن CD45.2 علامة congenic) وكذلك من C57. الفئران Bl6-SJL (التي تعبر عن علامة CD45.1 congenic) التي تم زرعها مع خلايا سرطان الدم MLL-AF9 التعبير (CD45.2+ ).
    ملاحظة: BM يمكن استردادها من الفئران إما عن طريق سحق12،13 أو عن طريق مسح العظام14،15. للتجارب المعروضة هنا، تم استرداد BM من كل من الفئران صحية وسرطان الدم عن طريق التنظيف.

2. الميتوكوندريا ROS الفلورة صبغ تلطيخ

  1. مرة واحدة وقد تم استرداد خلايا نخاع العظام أحادية النووية من الفئران صحية و / أو سرطان الدم، وصمة عار aliquot من الخلايا مع الأزرق تريبان وحساب باستخدام مقياس الهيموكيتوميلتحديد عدد البداية من مجموع خلايا BM.
  2. طرد مركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 5 دقائق.
  3. Aliquot 200 درجة مئوية من تعليق الخلية لكل أنبوب في 9 أنابيب التحكم لون واحد المسمى على النحو التالي:
    لا وصمة عار، B220-Cy5-PE، cKit-Cy7-APC، Sca1-PacBlue، CD150-APC (لHSPCs صحية فقط)، CD45.2-APC (لخلايا سرطان الدم فقط)، CD34-FITC، الميتوكوندريا ROS صبغ ولايف / ميت وصمة عار الخلية.
    ملاحظة: (اختياري) يمكن إعداد مراقبة إيجابية لتحريض ROS الميتوكوندريا عن طريق علاج 2 × 105 خلايا في 200 ميكرولتر مع 20 ميكرومتر من ميناديون الصوديوم Bisulfite (MSB) لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪. ويمكن إعداد عنصر تحكم ثان لعكس الحث بوساطة MSB من ROS الميتوكوندريا عن طريق علاج 2 × 105 خلايا في 200 ميكرولتر مع 20 ميكرومتر من MSB بالإضافة إلى 100 μM N-acetyl-L-cysteine (NAC) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪.
  4. Aliquot الخلايا المتبقية في أنبوب (أنبوب تجريبي) والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق.
  5. إعادة تعليق الخلايا في F-PBS مع وصمة عار خلية حية / ميتة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. الحضانة على الجليد لمدة 30 دقيقة تأكد من إضافة وصمة عار حية / ميتة إلى أنبوب التحكم لون واحد.
  6. إضافة 1.0 مل من درجة حرارة الغرفة (RT) F-PBS إلى كل من لون واحد وأنابيب تجريبية ملطخة بالصبغة الحية / الميتة. الطرد المركزي 5 دقائق في 300 × ز في RT.
  7. إعادة تعليق 50 ميكروغرام من صبغة ROS الميتوكوندريا في 13 ميكرولتر من كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO) للحصول على محلول مخزون 5 mM.
  8. تخفيف صبغة ROS الميتوكوندريا إلى تركيز نهائي من 5 μM في RT F-PBS مع أو بدون فيراباميل (50 درجة مئوية).
  9. يستنشق قبالة غسل وصمة عار الخلية الحية / الميتة. إضافة 200 درجة مئوية من صبغة الميتوكوندريا ROS وصمة عار تحتوي على فيراباميل إلى كل أنبوب تجريبي، فضلا عن الميتوكوندريا ROS صبغ أنبوب التحكم لون واحد.
  10. دوامة لخلط وحضانة لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية في الظلام.
  11. إضافة 1.0 مل من RT F-PBS إلى الميتوكوندريا ROS ملطخة التحكم لون واحد والأنابيب التجريبية. الطرد المركزي 5 دقائق في 300 × ز في RT.
  12. يستنشق قبالة supernatant وغسل الخلايا مع 1.0 مل إضافية من RT F-PBS. الطرد المركزي 5 دقائق في 300 × ز في RT.

3. النسب الأجسام المضادة تلطيخ

  1. إعداد كوكتيلات الأجسام المضادة المدرجة في الجدول 1.
    ملاحظة: وقد تم تحسين هذه الكوكتيلات الأجسام المضادة سابقا14،15،16.
  2. يستنشق supernatant من الميتوكوندريا النهائي ROS صبغ غسل الأنابيب التجريبية التي تحتوي على BM صحية وإضافة 200 درجة مئوية من كوكتيل الأجسام المضادة #1 إلى كل أنبوب. دوامة للخلط. أيضا إعداد أنابيب التحكم لون واحد. حضانة لمدة 60 دقيقة على الجليد في الظلام.
  3. يستنشق supernatant من الميتوكوندريا النهائي ROS صبغ غسل الأنابيب التجريبية التي تحتوي على ابيضاض الدم BM وإضافة 200 درجة مئوية من كوكتيل الأجسام المضادة #2 إلى كل أنبوب. دوامة للخلط. حضانة لمدة 60 دقيقة على الجليد في الظلام.
  4. يغسل مع 1.0 مل من الباردة F-PBS والطرد المركزي 5 دقائق في 300 × ز في RT.
  5. إعادة تعليق الخلايا في 500 درجة مئوية من F-PBS الباردة وتصفية الخلايا في أنبوب مقياس الخلايا تدفق باستخدام مرشح 40 ميكرومتر لاستبعاد المجاميع.

4. تدفق قياس السيتومتري ة وتحليل

ملاحظة: العديد من المجموعات الفرعية الجذعية المكونة للدم والسلف نادرة، مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم على المدى الطويل. وهكذا، من الناحية المثالية 3-5 مليون الأحداث ينبغي جمعها لكل أنبوب تجريبي أثناء الحصول على تدفق قياس السيتومتريلتحليل الكافي من ROS الميتوكوندريا في مختلف المجموعات الفرعية HSPC.

  1. استخدم أنبوب التحكم بدون وصمة عار لتعيين المؤامرات المبعثرة إلى الأمام (FSC-A) والجانب (SSC-A) استنادًا إلى حجم وتعقيد مجموعة الخلايا التي تم تحليلها.
  2. استخدام أنابيب التحكم لا وصمة عار ولون واحد للتعويض عن تدفق مقياس السيتومتر.
  3. بوابة من الحطام الدخيل من مؤامرة مبعثر إلى الأمام والجانب(الشكل 2A، B،اللوحة الأولى من اليسار).
  4. بوابة خارج doublets باستخدام التمييز المزدوج مثل التمييز إلى الأمام(الشكل 2A، B،اللوحة الثانية من اليسار).
  5. اتبع استراتيجية التطفل المقترحة في الشكل 2A،B لتحديد الخلايا الحية ، والخلايا المنخفضة النسب ومختلف HSPC وسرطان الدم الفرعية.
  6. لكل مجموعة من السكان من الفائدة، وتحليل متوسط كثافة الفلورة (MFI) من قناة TRPE (محور س) في مؤامرة الرسم البياني لتقييم الاختلافات في إشارة ROS الميتوكوندريا(الشكل 3A-C،لوحات اليسار). يمكن تقييم مستويات ROS الميتوكوندريا على مستوى الخلية الواحدة عن طريق مقارنة تلطيخ ROS الميتوكوندريا مقابل علامات سلالة محددة في مؤامرة مبعثرة.

النتائج

قدم هو وسيلة لتحليل ROS في الميتوكوندريا من العديد من السكان سرطان الدم صحية وMLL-AF9 التعبير عن. يعرض الشكل 1 طريقة عرض تخطيطية لسير عمل البروتوكول، والذي يتكون من 4 خطوات رئيسية: (1) عزل BM عن الفئران؛ (2) عزل BM عن الفئران؛ (3) عزل BM عن الفئران؛ (3) عزل BM عن الفئران؛ (3) عزل BM عن الفئران؛ ...

Discussion

الأصباغ الفلورية التي تم تطويرها للكشف عن ROS يتم تقييمها في كثير من الأحيان في الخلايا الثابتة عن طريق الفحص المجهري أو في الخلايا الحية عن طريق قياس التدفق22. تدفق التقييم الخلوي من ROS الميتوكوندريا في خلايا BM باستخدام الميتوكوندريا ROS الأصباغ الفلورية له ميزتان رئيسيتان: 1) وه...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مجلس إدارة مركز فوكس تشيس للسرطان (DDM)، وجائزة الجمعية الأمريكية لأمراض الدم (SMS)، الجمعية الأمريكية للسرطان RSG (SMS) ووزارة الدفاع (Award#: W81XWH-18-1-0472).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Heat inactivated FBSVWR Seradigm LIFE SCIENCE97068-085Media
Penicillin StreptomycinCorning30-002-CIMedia
PBSFisher ScientificBP399-20Buffer
15 mL conical tubeBD falcon352096Tissue Culture Supplies
50 mL conical tubeBD falcon352098Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainersFisher Scientific22-363-547Tissue Culture Supplies
RBC Lysis BufferFisher Scientific50-112-9751Tissue Culture Supplies
Menadione sodium BisulfiteSigma aldrichM5750Pro-oxidant
NACSigma aldrichA7250Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11Biolegend100310Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5eBioscience15-0041-81Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7eBioscience15-0081-81Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5Biolegend115510Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2Biolegend103210Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5Biolegend108410Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119Biolegend116210Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1Biolegend103420Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8Biolegend105825Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7Biolegend108120Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2Biolegend115909Antibody
CD34 FITC clone RAM34BD Bioscience553733Antibody
CD45.2 APC clone 104Biolegend1098313Antibody
MitoSOX RedThermoFisher ScientificM36008Dye
Mitotracker GreenThermoFisher ScientificM7514Dye
Live/dead Yellow DyeThermoFisher ScientificL34967Dye

References

  1. Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
  2. Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
  3. Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
  4. Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
  5. Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
  6. Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
  7. Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
  8. Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
  9. Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
  10. Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
  11. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  12. Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  13. Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
  14. Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
  15. Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
  16. Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
  17. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  18. Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
  19. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  20. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  21. Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
  22. Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
  23. Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
  24. Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
  25. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  26. Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
  27. Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
  28. Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151 HSCs ROS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved