Analyse cytométrique de flux des espèces réactives d'oxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de Murine et la leucémie entraînée mLL-AF9

Résumé

Nous décrivons une méthode pour utiliser la cytométrie multiparale de flux pour détecter les espèces réactives d'oxygène mitochondriales (ROS) dans les cellules hématopoïétiques et progénitrices saines murines (HSPc) et les cellules de leucémie d'un modèle de souris de leucémie myéloïde aigue (AML) conduit par MLL-AF9.

Résumé

Nous présentons une approche cytométrique de flux pour analyser le ROS mitochondrial dans diverses populations vivantes de cellules souches et progénitrices dérivées de la moelle osseuse (BM) provenant de souris en bonne santé ainsi que de souris atteintes de LAM entraînées par MLL-AF9. Plus précisément, nous décrivons un processus de coloration cellulaire en deux étapes, par lequel les cellules saines ou la leucémie BM sont d'abord tachées d'un colorant fluorogénique qui détecte les superoxydes mitochondriaux, suivie de coloration avec des anticorps monoclonaux fluorochrome-liés qui sont utilisés pour distinguer diverses populations hématopoïétiques saines et malignes. Nous fournissons également une stratégie pour l'acquisition et l'analyse des échantillons par cytométrie de flux. L'ensemble du protocole peut être réalisé dans un délai aussi court que 3-4 h. Nous soulignons également les variables clés à considérer ainsi que les avantages et les limites de la surveillance de la production de ROS dans le compartiment mitochondrial des sous-populations vivantes de tige sémino-tige et de leucémie et progénitrice utilisant des colorants fluorogènes par cytométrie de flux . En outre, nous présentons des données que l'abondance mitochondriale de ROS varie parmi les sous-populations saines distinctes de HSPC et les progéniteurs de leucémie et discutons des applications possibles de cette technique dans la recherche hématique.

Introduction

Les espèces réactives d'oxygène (ROS) sont des molécules fortement réactives dérivées de l'oxygène moléculaire. L'emplacement cellulaire le plus bien défini de la production de ROS est les mitochondries, où les électrons qui passent par la chaîne de transport d'électrons (ETC) pendant la phosphorylation oxydative (OXPHOS) sont absorbés par l'oxygène moléculaire menant à la formation d'un spécifique type de ROS appelé superoxydes¹. Grâce aux actions d'une série d'enzymes, appelées dismutases de superoxyde ou SODs, les superoxydes sont convertis en peroxydes d'hydrogène, qui sont ensuite neutralisés en eau par des enzymes telles que la catalase ou les peroxidases de glutathion (GPX). Les perturbations dans les mécanismes de régulation ROS peuvent conduire à la production excédentaire de ROS, souvent appelé stress oxydatif, qui ont des conséquences cellulaires nocives et potentiellement mortelles telles que les dommages aux macromolécules (c.-à-d. ADN, protéines, lipides). En outre, le stress oxydatif est lié à plusieurs pathologies, telles que le diabète, les maladies inflammatoires, le vieillissement et les tumeurs^2,3,4. Pour maintenir l'homéostasie redox et prévenir le stress oxydatif, les cellules possèdent une variété de mécanismes ros-régulateur⁵.

Les niveaux physiologiques de certains ROS sont nécessaires pour l'hématopoiesis embryonnaire et adulte^{approprié 6.} Cependant, l'excès de ROS est associé aux dommages d'ADN, à la différenciation cellulaire et à l'épuisement de la tige hématopoïétique et de la piscine d'ancêtre. Il existe également des preuves que les altérations de la biologie du redox peuvent différer entre la leucémie et les cellules saines. Par exemple, les niveaux de ROS ont tendance à être plus élevés dans les cellules de leucémie myéloïde aigue (LAM) par rapport à leurs homologues en bonne santé et d'autres études ont suggéré que les cellules souches de leucémie maintiennent un faible niveau stable de ROS pour la survie^7,8. Fait important, les stratégies de capitalisation thérapeutique sur ces différences redox se sont avérées prometteuses dans plusieurs contextes de cancer humain^9,10. Par conséquent, les essais qui permettent l'évaluation des niveaux de ROS dans les modèles de souris peuvent améliorer notre compréhension de la façon dont ces espèces contribuent à la physiologie cellulaire et la pathogénie de la maladie ainsi que potentiellement fournir une plate-forme pour évaluer l'efficacité de de nouvelles thérapies anticancéreuses ciblant le redox.

Protocole

Toutes les procédures animales décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Fox Chase Cancer Center.

REMARQUE: Le flux de travail du protocole est divisé en 4 parties telles qu'elles sont présentées à la figure 1 et les réactifs requis sont énumérés dans le tableau des matériaux.

1. Isolement de moelle osseuse (BM)

REMARQUE: Des souris de leucémie de MLL-AF9 ont été produites comme décrit précédemment^11.

1. Récupérer les cellules mononucléaires de moelle osseuse, comme décrit précédemment^12,13,14,15, de type sauvage C57.Bl6 souris (qui expriment le marqueur congénique CD45.2) ainsi que de C57. Souris Bl6-SJL (qui expriment le marqueur congénique CD45.1) qui ont été transplantées avec des cellules leucémiques exprimant MLL-AF9 (CD45.2^).
   REMARQUE: BM peut être récupéré à partir de souris soit en écrasant^12,13 ou en rinçant les os^14,15. Pour les expériences présentées ici, BM a été récupéré à la fois des souris saines et la leucémie via le rinçage.

2. La coloration fluorogénique mitochondriale de teinture de ROS

1. Une fois que les cellules mononucléaires de moelle osseuse ont été récupérées de souris saines et/ou de leucémie, tachez un aliquot de cellules avec Le bleu de Trypan et comptez utilisant un hémocytomètre pour déterminer le nombre de départ des cellules totales de BM.
2. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min. Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille en F-PBS (PBS complété par 2% de sérum bovin fœtal et un cocktail pénicilline/streptomycine de 1%) à une concentration de 2 x 10⁶ cellules/mL.
3. Aliquot 200 L de suspension cellulaire par tube en 9 tubes de commande monocolore étiquetés comme suit :
   Aucune tache, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (pour les HSPC sains seulement), CD45.2-APC (pour les cellules leucémiques seulement), CD34-FITC, colorant mitochondrial ROS et tache de cellules vivantes/mortes.
   REMARQUE: (Facultatif) Un contrôle positif pour l'induction du ROS mitochondrial peut être préparé en traitant 2 x 10⁵ cellules dans 200 L avec 20 M de Bisulfite de sodium de Menadione (MSB) pendant 1 h à 37 oC dans un incubateur de CO₂ de 5 %. Un deuxième contrôle pour inverser l'induction MSB-négociée de ROS mitochondrial peut être préparé en traitant 2 x 10⁵ cellules dans 200 L avec 20 M M de MSB plus 100 M N-acetyl-L-cystéine (NAC) pendant 1 h à 37 oC dans un incubateur de CO₂ de 5 %.
4. Aliquot les cellules restantes dans un tube (tube expérimental) et centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.
5. Resuspendre les cellules dans F-PBS avec une tache de cellule vivante /morte selon les instructions du fabricant. Incuber sur la glace pendant 30 min. Assurez-vous d'ajouter des taches vivantes/mortes au tube de commande d'une seule couleur.
6. Ajouter 1,0 ml de F-PBS à température ambiante (RT) aux tubes monocolores et expérimentaux tachés du colorant vivant/mort. Centrifugeuse 5 min à 300 x g à RT.
7. Resuspendre 50 g du colorant ROS mitochondrial dans 13 L de sulfoxide de diméthyle (DMSO) pour obtenir une solution de stock de 5 mM.
8. Diluer le colorant ROS mitochondrial jusqu'à une concentration finale de 5 M dans RT F-PBS avec ou sans Verapamil (50 M).
9. Aspirez le lavage de la tache de cellule vivante/morte. Ajoutez 200 ll de tache mitochondriale de colorant ROS contenant du Verapamil à chaque tube expérimental ainsi que le tube de contrôle monocolore de teinture ROS mitochondrial.
10. Vortex à mélanger et incuber pendant 10 min à 37 oC dans l'obscurité.
11. Ajoutez 1,0 ml de RT F-PBS aux tubes mitochondriques de contrôle unicolore et d'expérimentation souillés par ROS. Centrifugeuse 5 min à 300 x g à RT.
12. Aspirer le supernatant et laver les cellules avec un supplément de 1,0 ml de RT F-PBS. Centrifugeuse 5 min à 300 x g à RT.

3. Staining d'anticorps de lignée

1. Préparer les cocktails d'anticorps énumérés dans le tableau 1.
   REMARQUE: Ces cocktails d'anticorps ont été optimisés précédemment^14,15,16.
2. Aspirez le supernatant du lavage final de colorant ROS mitochondrial des tubes expérimentaux contenant bM sain et ajoutez 200 l de cocktail d'anticorps #1 à chaque tube. Vortex à mélanger. Préparez également les tubes de commande unicolore. Incuber 60 min sur glace dans l'obscurité.
3. Aspirez le supernatant du lavage final de colorant ROS mitochondrial des tubes expérimentaux contenant la leucémie BM et ajoutez 200 l de cocktail d'anticorps #2 à chaque tube. Vortex à mélanger. Incuber 60 min sur glace dans l'obscurité.
4. Laver avec 1,0 ml de F-PBS froid et centrifugeuse 5 min à 300 x g à RT.
5. Resuspendre les cellules dans 500 L de F-PBS froid et filtrer les cellules dans un tube cytomètre d'écoulement à l'aide d'un filtre de 40 m pour exclure les agrégats.

4. Acquisition et analyse de la cytométrie de flux

REMARQUE: Plusieurs sous-ensembles de tiges et d'ancêtres hématopoïétiques sont rares, comme les cellules souches hématopoïétiques à long terme. Ainsi, idéalement 3-5 millions d'événements devraient être rassemblés pour chaque tube expérimental pendant l'acquisition de cytométrie de flux pour l'analyse suffisante du ROS mitochondrial dans les divers sous-ensembles de HSPC.

1. Utilisez le tube de commande sans tache pour définir les parcelles de dispersion vers l'avant (FSC-A) et latérales (SSC-A) en fonction de la taille et de la complexité de la population cellulaire analysée.
2. Utilisez les tubes de contrôle sans taches et monocolores pour compenser le cytomètre d'écoulement.
3. Portez les débris extérieurs de la parcelle de dispersion vers l'avant et latérale(figure 2A,B, premier panneau à partir de la gauche).
4. Portez les doublets à l'aide d'un double discriminateur tel que le discriminateur avant (Figure 2A,B, deuxième panneau à partir de la gauche).
5. Suivez la stratégie de gating proposée dans la figure 2A,B pour sélectionner les cellules vivantes, les cellules basses de lignée et les divers sous-ensembles de HSPC et de leucémie.
6. Pour chaque population d'intérêt, analyser l'intensité médiane de fluorescence (IMF) du canal TRPE (axe X) dans une parcelle d'histogramme pour évaluer les différences dans le signal ROS mitochondrial(figure 3A-C, panneaux gauches). Les niveaux de ROS mitochondrial peuvent être évalués au niveau unicellulaire en comparant la coloration mitochondriale de ROS par rapport aux marqueurs spécifiques de lignée dans une parcelle de dispersion.

Résultats

Présenté est une méthode pour analyser ROS dans les mitochondries de multiples populations saines et MLL-AF9-exprimant l'ancêtre de leucémie. La figure 1 affiche une vue schématique du flux de travail du protocole, qui se compose de 4 étapes principales : 1) l'isolement de BM des souris ; 2) Tacher les cellules BM avec un colorant fluorogénique qui reconnaît le ROS mitochondrial, en particulier les superoxydes; 3) coloration d'anticorps de marqueur de surface pour délimiter diverse...

Discussion

Les colorants fluorogéniques qui ont été développés pour la détection de ROS sont fréquemment évalués dans les cellules fixes par microscopie ou dans les cellules vivantes par cytométrie de flux²². L'évaluation cytométrique de flux du ROS mitochondrial dans les cellules de BM utilisant les colorants fluorogenic mitochondriaux de ROS a deux avantages principaux : 1) C'est une technique rapide et simple qui convient à l'analyse de cellules vivantes et 2) elle permet de distinguer et d'a...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heat inactivated FBS	VWR Seradigm LIFE SCIENCE	97068-085	Media
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI	Media
PBS	Fisher Scientific	BP399-20	Buffer
15 mL conical tube	BD falcon	352096	Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube	BD falcon	352098	Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers	Fisher Scientific	22-363-547	Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer	Fisher Scientific	50-112-9751	Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite	Sigma aldrich	M5750	Pro-oxidant
NAC	Sigma aldrich	A7250	Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11	Biolegend	100310	Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5	eBioscience	15-0041-81	Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7	eBioscience	15-0081-81	Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5	Biolegend	115510	Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2	Biolegend	103210	Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5	Biolegend	108410	Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119	Biolegend	116210	Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1	Biolegend	103420	Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8	Biolegend	105825	Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7	Biolegend	108120	Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2	Biolegend	115909	Antibody
CD34 FITC clone RAM34	BD Bioscience	553733	Antibody
CD45.2 APC clone 104	Biolegend	1098313	Antibody
MitoSOX Red	ThermoFisher Scientific	M36008	Dye
Mitotracker Green	ThermoFisher Scientific	M7514	Dye
Live/dead Yellow Dye	ThermoFisher Scientific	L34967	Dye