マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析

要約

急性骨髄性白血病(AML)のマウスモデルから、マウスの健康な造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)におけるミトコンドリア活性酸素種(ROS)を検出するために多パラメータフローサイトメトリーを用いる方法について説明する。MLL-AF9.

要約

健康なマウスとMLL-AF9によって駆動されるAMLを有するマウスから、様々な生きた骨髄(BM)由来の幹および前駆細胞集団におけるミトコンドリアROSを分析するためのフローサイトメトリックアプローチを提示する。具体的には、健康または白血病BM細胞がミトコンドリアスーパーオキシドを検出するフルオロゲン性色素で最初に染色され、続いて使用されるフルオロクロム結合モノクローナル抗体による染色を行う2段階の細胞染色プロセスについて説明します。様々な健康で悪性の前駆体集団を区別する。また、フローサイトメトリーによるサンプルの取得と分析に関する戦略も提供しています。プロトコル全体は、3-4時間の短い時間枠で行うことができます。我々はまた、フローサイトメトリーによるフルオロゲン染料を用いた生造血および白血病の幹および前駆体のミトコンドリアコンパートメントにおけるROS産生のモニタリングの利点と限界を考慮すべき重要な変数を強調する。.さらに、ミトコンドリアROSの豊富さが、明確な健康なHSPCサブ集団と白血病前駆体の間で変化するデータを提示し、血液学的研究におけるこの技術の可能な応用について議論する。

概要

活性酸素種(ROS)は、分子酸素由来の反応性の高い分子です。ROS産生の最も明確に定義された細胞位置はミトコンドリアであり、酸化リン酸化(OXPHOS)中に電子輸送鎖(ETC)を通過する電子が特定の形成につながる分子酸素によって吸収されるスーパーオキシ^ド1と呼ばれるROSの種類。スーパーオキシドジスムターゼまたはSODと呼ばれる一連の酵素の作用を通じて、スーパーオキシドは過酸化水素に変換され、その後、カタレーゼやグルタチオンペルオキシダーゼ(GPX)などの酵素によって水に中和されます。ROS調節機構の摂動は、多くの場合、高分子損傷(すなわち、DNA、タンパク質、脂質)などの有害で潜在的に致命的な細胞の結果を有する酸化ストレスと呼ばれるROSの過剰産生につながる可能性があります。さらに、酸化ストレスは、糖尿病、炎症性疾患、老化および^{腫瘍2、3、4}などのいくつかの病理に関連している。酸化ホオスタシスを維持し、酸化ストレスを防ぐために、細胞は様々なROS調節機構^{を有する5.}

特定のROSの生理学的レベルは、適切な胚および成人のヘマトポエ^シス6に必要である。しかし、過剰なROSは、造来茎および前駆体プールのDNA損傷、細胞分化および枯渇に関連している。また、レドックス生物学の変化は、白血病と健康な細胞の間で異なる可能性があるという証拠もあります。例えば、ROSレベルは、彼らの健康な相手に対して急性骨髄性白血病(AML)細胞で高くなる傾向があり、他の研究は、白血病幹細胞が^生存7、8のためにROSの低定常状態レベルを維持することを示唆している。重要なことに、これらの酸化還元の違いを治療的に活用するための戦略^は、いくつかのヒト癌の^設定9、10で約束を示している。したがって、マウスモデルにおけるROSレベルの評価を可能にするアッセイは、これらの種が細胞生理学および疾患病因にどのように寄与するかについての理解を改善し、潜在的に有効性を評価するためのプラットフォームを提供する可能性がある。新しいレドックスターゲティング抗癌療法。

プロトコル

このプロトコルに記載されているすべての動物の手順は、フォックスチェイス癌センターの機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。

注:プロトコルワークフローは図1に示すように4つの部分に分かれており、必要な試薬は材料の表に記載されています。

1. 骨髄(BM)分離

注:MLL-AF9白血病マウスは、前述^の11として生成された。

1. 前述の12、13、14、15、野生型C57.Bl6マウス(CD45.2先天性マーカーを発現する)およびC57から、単核骨髄細胞を回収する。MLL-AF9発現白血病細胞(CD45.2+)で移植したBl6-SJLマウス(CD45.1前生細胞を発現する)。
   注:BM^{は、12、13を粉砕するか、}または^骨14、15を洗い流すことによってマウスから回収することができる。ここで提示された実験では、BMは、フラッシングを介して健康マウスと白血病マウスの両方から回収された。

2. ミトコンドリアROSフルオロゲン染料染色

1. 単核骨髄細胞が健康なマウスおよび/または白血病マウスから回収されたら、トリパンブルーで細胞のアリコートを染色し、血球計を使用してカウントして、総BM細胞の開始数を決定します。
2. 細胞を300 x gで5分間遠心分離し、F-PBS(PBSは2%の胎児牛血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンカクテルを補充)でペレットを再ステーペンし、2 x 10⁶細胞/mLの濃度にします。
3. 次のようにラベル付けされた9つの単色制御チューブにチューブあたりの細胞懸濁液のAliquot 200 μL:
   汚れなし、B220-Cy5-PE、cKit-Cy7-APC、Sca1-PacBlue、CD150-APC(健康なHPCのみ)、CD45.2-APC(白血病細胞のみ)、CD34-FITC、ミトコンドリアROS染料および生死細胞染色。
   注:(オプション)ミトコンドリアROSの誘導に対する陽性対照は、5%CO₂インキュベーターで37°Cで1時間のメナジオンナトリウムビスルボディ(MSB)の20μMで200μLで2x10⁵細胞を処理することによって調製することができる。ミトコンドリアROSのMSB媒介誘導を逆転させる第2の制御は、MSBの20μMに加えて100 μM N-アセチル-L-システイン(NAC)を5%CO₂インキュベーターで1時間100μMで200μLで2x10⁵細胞を処理することによって調製することができる。
4. チューブ(実験管)の残りの細胞をアリコートし、遠心分離機を300 x gで5分間使用します。
5. 製造元の指示に従って、生きている/死んだ細胞の汚れでF-PBSの細胞を再中断する。氷の上で30分間インキュベートし、単色のコントロールチューブに生きた/死んだ汚れを加えるようにしてください。
6. 生きた/死んだ色素で染色された単色および実験管の両方に室温(RT)F-PBSの1.0 mLを加える。RTで300 x gで遠心分離機5分。
7. ミトコンドリアROS色素の50μgをジメチルスルホキシド(DMSO)の13μLで再中断し、5mMストック溶液を得た。
8. ベラパミル(50μM)の有無にかかわらずRT F-PBSで5μMの最終濃度にミトコンドリアROS色素を希釈します。
9. 生きている/死んだ細胞の汚れの洗浄を吸引する。各実験チューブにベラパミルを含むミトコンドリアROS染料染料染色剤200μLを加え、ミトコンドリアROS染料単色制御チューブを追加します。
10. 渦は、暗闇の中で37°Cで10分間混合し、インキュベートする。
11. ミトコンドリアROS染色シングルカラーコントロールおよび実験チューブにRT F-PBSの1.0 mLを追加します。RTで300 x gで遠心分離機5分。
12. 上清を吸引し、RT F-PBS の追加の 1.0 mL で細胞を洗浄します。RTで300 x gで遠心分離機5分。

3. リネージ抗体染色

1. 表1に記載されている抗体カクテルを準備する。
   注:これらの抗体カクテルは、以前に14、15、16に最適化されている。
2. 健康なBMを含む実験チューブの最終ミトコンドリアROS色素洗浄から上清を吸引し、各チューブに200μLの抗体カクテル#1を加える。混ぜる渦。また、単色制御チューブを準備します。暗闇の中で氷の上で60分間インキュベートします。
3. 白血病BMを含む実験管の最終ミトコンドリアROS色素洗浄から上清を吸引し、各管に200μLの抗体カクテル#2を加える。混ぜる渦。暗闇の中で氷の上で60分間インキュベートします。
4. RTで300 x gで1.0 mLの冷たいF-PBSおよび遠心分離機5分で洗う。
5. 冷たいF-PBSの500 μLの細胞を再中断し、凝集体を除外するために40 μmフィルターを使用して流れサイトメーターチューブ内の細胞をろ過する。

4. フローサイトメトリーの取得と分析

注:いくつかの造血幹細胞および前駆体のサブセットは、長期造血幹細胞などまれである。したがって、理想的には、様々なHSPCサブセット内のミトコンドリアROSの十分な分析のために、フローサイトメトリー獲得時に各実験管に対して3〜500万のイベントを収集する必要があります。

1. 無染色制御チューブを使用して、分析された細胞集団の大きさと複雑さに基づいて前方(FSC-A)と側(SSC-A)散布プロットを設定します。
2. 無染色および単色制御管を使用して、フローサイトメーターを補正します。
3. 前方および側面散乱プロットから余分な破片をゲートアウトします(図2A,B、左から最初のパネル)。
4. 前方識別子などの二重識別子を使用して二重にゲートアウトします(図2A、B、左から2番目のパネル)。
5. 図2A、Bで提案されているゲーティング戦略に従って、生細胞、系統低細胞および様々なHSPCおよび白血病サブセットを選択する。
6. 対象の各集団について、ヒストグラムプロットにおけるTRPEチャネル(x軸)の中央値蛍光強度(MFI)を分析し、ミトコンドリアROSシグナルの違いを評価します(図3A-C、左パネル)。ミトコンドリアROSのレベルは、散布図中のミトコンドリアROS染色と特定の系統マーカーを比較することによって単一細胞レベルで評価することができる。

結果

提示されたのは、複数の健康およびMLL-AF9発現白血病前駆体のミトコンドリアにおけるROSを分析する方法である。図 1は、4 つの主要なステップで構成されるプロトコル ワークフローの概略図を示します: 1) マウスからの BM 分離;2)ミトコンドリアROS、特にスーパーオキシドを認識するフッ素色素でBM細胞を染色する。3)様々な健康および白血病血化集団を線引きする表面マ...

ディスカッション

ROSの検出のために開発されたフルオロゲン染料は、フローサイトメ^トリー22により顕微鏡検査または生細胞中の固定細胞において頻繁に評価される。ミトコンドリアROSフルオロゲン染料を用いてBM細胞内のミトコンドリアROSのフローサイトメトリック評価には2つの大きな利点があります:1)生細胞分析に適した高速かつ簡単な技術であり、2)希少な区別と分析を可能にします。...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heat inactivated FBS	VWR Seradigm LIFE SCIENCE	97068-085	Media
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI	Media
PBS	Fisher Scientific	BP399-20	Buffer
15 mL conical tube	BD falcon	352096	Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube	BD falcon	352098	Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers	Fisher Scientific	22-363-547	Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer	Fisher Scientific	50-112-9751	Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite	Sigma aldrich	M5750	Pro-oxidant
NAC	Sigma aldrich	A7250	Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11	Biolegend	100310	Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5	eBioscience	15-0041-81	Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7	eBioscience	15-0081-81	Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5	Biolegend	115510	Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2	Biolegend	103210	Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5	Biolegend	108410	Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119	Biolegend	116210	Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1	Biolegend	103420	Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8	Biolegend	105825	Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7	Biolegend	108120	Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2	Biolegend	115909	Antibody
CD34 FITC clone RAM34	BD Bioscience	553733	Antibody
CD45.2 APC clone 104	Biolegend	1098313	Antibody
MitoSOX Red	ThermoFisher Scientific	M36008	Dye
Mitotracker Green	ThermoFisher Scientific	M7514	Dye
Live/dead Yellow Dye	ThermoFisher Scientific	L34967	Dye