Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

Resumo

Nós descrevemos um método para usar a citometria do fluxo do multiparâmetro para detectar a espécie reactiva mitochondrial do oxigênio (ROS) em pilhas hematopoietic saudáveis murino da haste e do progenitor (hspcs) e nas pilhas da leucemia de um modelo do rato da leucemia Myeloid aguda (AML) conduzida por MLL-AF9.

Resumo

Nós apresentamos uma aproximação cytometric do do fluxo para analisar ROS mitochondrial na vária medula viva (BM)-populações derivadas da pilha da haste e do progenitor dos ratos saudáveis assim como ratos com AML conduzido por MLL-AF9. Especificamente, nós descrevemos um processo de coloração da pilha de duas etapas, por meio de que as pilhas saudáveis ou da leucemia BM são manchadas primeiramente com um corante cromogênicos fluorogênicos que detecte superóxidos mitochondrial, seguidos manchando com os anticorpos monoclonais fluorochrome-lig que são usados para distinguir várias populações hematopoiéticas saudáveis e malignas do progenitor. Também fornecemos uma estratégia para a aquisição e análise das amostras por citometria de fluxo. Todo o protocolo pode ser realizado em um prazo tão curto quanto 3-4 h. Destacamos, também, as principais variáveis a serem consideradas, bem como as vantagens e limitações do monitoramento da produção de Eros no compartimento mitocondrial de subpopulações hematopoiéticas e de leucemia de tronco e progenitoras ao vivo, utilizando corantes fluorogênicos por citometria de fluxo . Além disso, nós apresentamos dados que a abundância mitochondrial dos Ros varia entre subpopulações saudáveis distintas do hspc e progenitores da leucemia e discutimos as aplicações possíveis desta técnica na pesquisa hematológicas.

Introdução

Espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas altamente reativas derivadas de oxigênio molecular. A localização celular mais bem definida da produção de Eros é a mitocôndria, onde elétrons que passam pela cadeia de transporte de elétrons (ETC) durante a fosforilação oxidativa (OXPHOS) são absorvidos por oxigênio molecular, levando à formação de um específico tipo de ROS denominados superóxidos¹. Através das ações de uma série de enzimas, chamadas superóxido superóxido ou Sods, os superóxidos são convertidos em peróxidos de hidrogênio, que são posteriormente neutralizados em água por enzimas como catalase ou glutationa peroxidases (GPX). Perturbações nos mecanismos de regulamentação de ROS podem levar ao excesso de produção de Eros, muitas vezes referido como estresse oxidativo, que têm conseqüências celulares prejudiciais e potencialmente letais, como danos de macromoléculas (ou seja, DNA, proteínas, lipídios). Além disso, o estresse oxidativo está relacionado a diversas patologias, como diabetes, doenças inflamatórias, envelhecimento e tumores^2,3,4. Para manter a homeostase redox e prevenir o estresse oxidativo, as células possuem uma variedade de mecanismos de regulação de ROS⁵.

Os níveis fisiológicos de certas Eros são necessários para a hematopoiese embrionária e adulta adequada⁶. No entanto, o excesso de Eros está associado a danos no DNA, diferenciação celular e exaustão da haste hematopoiética e do grupo progenitor. Há também evidências de que alterações na biologia redox podem diferir entre leucemia e células saudáveis. Por exemplo, os níveis de Ros tendem a ser mais elevados em células de leucemia mielóide aguda (AML) em relação aos seus homólogos saudáveis e outros estudos sugeriram que as células-tronco de leucemia mantêm um baixo nível de estado estacionário de Ros para a sobrevivência^7,8. É importante ressaltar que as estratégias para capitalizar terapeuticamente nessas diferenças redox mostraram-se promissora em várias^{configurações de câncer}humano^9,10. Portanto, os ensaios que permitem a avaliação dos níveis de Eros em modelos de camundongo podem melhorar nossa compreensão de como essas espécies contribuem para a fisiologia celular e a patogênese da doença, bem como potencialmente fornecem uma plataforma para avaliar a eficácia da novo redox-visando terapias anti-câncer.

Protocolo

Todos os procedimentos animais descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) no Fox Chase Cancer Center.

Nota: O fluxo de trabalho do protocolo é dividido em 4 partes conforme apresentado na Figura 1 e os reagentes necessários estão listados na tabela de materiais.

1. isolação da medula óssea (BM)

Nota: Os ratos da leucemia de MLL-AF9 foram gerados como descrito previamente¹¹.

1. Recupere pilhas mono-nucleares da medula, como descrito previamente^12,13,14,15, do tipo selvagem camundongos C57. Bl6 (que expressam o marcador do CD 45,2 congênicos) assim como de C57. Camundongos Bl6-SJL (que expressam o marcador congênico CD-m) que foram transplantados com células de leucemia expressando MLL-AF9 (CD 45,2⁺).
   Nota: O BM pode ser recuperado dos ratos ou esmagando^12,13 ou nivelando os ossos^14,15. Para os experimentos aqui apresentados, a BM foi recuperada de camundongos saudáveis e de leucemia via rubor.

2. coloração de corante Fluorogênico de ROS mitocondrial

1. Uma vez que as pilhas mono-nucleares da medula foram recuperadas dos ratos saudáveis e/ou da leucemia, manchar uma alíquota das pilhas com azul de trypan e contar usando um hemocitômetro para determinar o número começar de pilhas totais do BM.
2. Centrifugue as células a 300 x g durante 5 min. aspirar o sobrenadante e ressuscitem o pellet em F-PBS (PBS suplementado com 2% soro fetal bovino e um 1% penicilina/estreptomicina cocktail) para uma concentração de 2 x 10⁶ células/ml.
3. Alíquota 200 μL de suspensão celular por tubo em 9 tubos de controlo de cor única rotulados da seguinte forma:
   Nenhuma mancha, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (para HSPCs saudável somente), CD 45,2-APC (para pilhas da leucemia somente), CD34-FITC, tintura mitochondrial dos ROS e mancha viva/inoperante da pilha.
   Nota: Opcional Um controle positivo para a indução de ROS mitochondrial pode ser preparado tratando 2 x 10⁵ pilhas em 200 μl com 20 ΜM do bissulfito de sódio do Menadione (MSB) para 1 h em 37 ° c em uma incubadora de 5% co₂ . Um segundo controle para inverter a indução mediada por MSB de ROS mitochondrial pode ser preparado tratando 2 x 10⁵ pilhas em 200 μl com 20 ΜM de MSB mais 100 μm N-acetil-L-cisteína (NAC) para 1 h em 37 ° c em uma incubadora de 5% co₂ .
4. Aliquot as pilhas restantes em um tubo (tubo experimental) e Centrifugue em 300 x g por 5 minutos.
5. Resuspend as pilhas em F-PBS com uma mancha viva/inoperante da pilha de acordo com as instruções do fabricante. Incubar no gelo por 30 min. Certifique-se de adicionar a mancha viva/inoperante ao tubo de controle da único-cor.
6. Adicionar 1,0 mL de temperatura ambiente (RT) F-PBS para ambos os tubos de cor única e experimental manchado com o corante vivo/morto. Centrifugar 5 min a 300 x g em RT.
7. Resuspend 50 μg do corante mitocondrial de ROS em 13 μL de dimetil sulfóxido (DMSO) para obter uma solução de estoque de 5 mM.
8. Diluir a tintura mitocondrial de ROS para uma concentração final de 5 μM em RT F-PBS com ou sem verapamil (50 μM).
9. Aspirar fora da lavagem da mancha viva/inoperante da pilha. Adicionar 200 μL de coloração de corante de ROS mitocondrial contendo Verapamil a cada tubo experimental, bem como o tubo de controlo de cor única de corante ROS mitocondrial.
10. Vortex para misturar e incubar por 10 min a 37 ° c no escuro.
11. Adicione 1,0 mL de RT F-PBS ao controle de cor única e tubos experimentais com coloração de ROS mitocondrial. Centrifugar 5 min a 300 x g em RT.
12. Aspirar o sobrenadante e lavar as células com um adicional de 1,0 mL de RT F-PBS. Centrifugar 5 min a 300 x g em RT.

3. coloração do anticorpo da linhagem

1. Prepare os coquetéis de anticorpos listados na tabela 1.
   Nota: Estes^{cocktails de anticorpos}foram otimizados anteriormente^14,15,16.
2. Aspirar o sobrenadante da lavagem final de corante ROS mitocondrial dos tubos experimentais contendo BM saudável e adicionar 200 μL de cocktail de anticorpos #1 a cada tubo. Vortex para misturar. Também prepare os tubos de controle de cor única. Incubar por 60 min no gelo no escuro.
3. Aspirar o sobrenadante da lavagem final de corante ROS mitocondrial dos tubos experimentais contendo leucemia BM e adicionar 200 μL do coquetel de anticorpos #2 para cada tubo. Vortex para misturar. Incubar por 60 min no gelo no escuro.
4. Lave com 1,0 mL de F-PBS frio e Centrifugue 5 min a 300 x g em RT.
5. Reressuscita as células em 500 μL de F-PBS a frio e filtre as células em um tubo de citometro de fluxo usando um filtro de 40 μm para excluir agregados.

4. aquisição e análise de citometria de fluxo

Nota: Diversos subconjuntos hematopoietic da haste e do progenitor são raros, tais como pilhas de haste hematopoietic a longo prazo. Assim, idealmente 3-5 milhões de eventos devem ser coletados para cada tubo experimental durante a aquisição de citometria de fluxo para análise suficiente de ROS mitocondriais nos vários subconjuntos de HSPC.

1. Use o tubo de controle sem mancha para definir as parcelas de dispersão para frente (FSC-A) e lateral (SSC-A) com base no tamanho e na complexidade da população de células analisada.
2. Use os tubos de controle da nenhum-mancha e da único-cor para compensar o cytometer do fluxo.
3. Portão fora detritos estranhos do gráfico de dispersão para a frente e lateral (Figura 2a, B, primeiro painel da esquerda).
4. Porta para fora doublets usando um discriminador duplo, como o discriminador para a frente (Figura 2a, B, segundo painel da esquerda).
5. Siga a estratégia de gating proposta na Figura 2a,B para selecionar células ao vivo, linhagem células baixas e os vários subconjuntos hspc e leucemia.
6. Para cada população de interesse, analisar a intensidade de fluorescência mediana (MFI) do canal TRPE (eixo x) em um gráfico de histograma para avaliar as diferenças no sinal de ROS mitocondrial (Figura 3a-C, painéis esquerdos). Os níveis de ROS mitochondrial podem ser avaliados a nível da único-pilha comparando ROS mitochondrial que mancham contra marcadores específicos da linhagem em um gráfico de dispersão.

Resultados

Apresentado é um método para análise de ROS nas mitocôndrias de múltiplas populações de progenitoras de leucemia, saudáveis e MLL-AF9. A Figura 1 exibe uma visão esquemática do fluxo de trabalho do protocolo, que consiste em 4 etapas principais: 1) isolamento BM de camundongos; 2) coloração das células BM com corante fluorogênico que reconhece ROS mitocondrial, particularmente superóxidos; 3) mancha do anticorpo do marcador de superfície para delinear várias populações hem...

Discussão

Corantes fluorogênicos que foram desenvolvidos para a detecção de Eros são freqüentemente avaliados em células fixas por microscopia ou em células ao vivo por citometria de fluxo²². A avaliação citométrica do fluxo de Ros mitochondrial em pilhas de BM usando tinturas cromogênicos fluorogênicos mitocondrial dos Ros tem duas vantagens principais: 1) é uma técnica rápida e simples que seja apropriada para a análise viva da pilha e 2) permite distinguir e analisar raro populações no ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heat inactivated FBS	VWR Seradigm LIFE SCIENCE	97068-085	Media
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI	Media
PBS	Fisher Scientific	BP399-20	Buffer
15 mL conical tube	BD falcon	352096	Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube	BD falcon	352098	Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers	Fisher Scientific	22-363-547	Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer	Fisher Scientific	50-112-9751	Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite	Sigma aldrich	M5750	Pro-oxidant
NAC	Sigma aldrich	A7250	Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11	Biolegend	100310	Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5	eBioscience	15-0041-81	Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7	eBioscience	15-0081-81	Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5	Biolegend	115510	Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2	Biolegend	103210	Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5	Biolegend	108410	Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119	Biolegend	116210	Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1	Biolegend	103420	Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8	Biolegend	105825	Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7	Biolegend	108120	Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2	Biolegend	115909	Antibody
CD34 FITC clone RAM34	BD Bioscience	553733	Antibody
CD45.2 APC clone 104	Biolegend	1098313	Antibody
MitoSOX Red	ThermoFisher Scientific	M36008	Dye
Mitotracker Green	ThermoFisher Scientific	M7514	Dye
Live/dead Yellow Dye	ThermoFisher Scientific	L34967	Dye