뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

요약

우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)의 마우스 모델에서 뮤린 건강한 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 및 백혈병 세포에서 미토콘드리아 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기 위해 다매개 변수 흐름 세포측정법을 사용하는 방법을 설명합니다. MLL-AF9.

초록

우리는 MLL-AF9에 의해 구동되는 AML을 가진 마우스뿐만 아니라 건강한 마우스에서 다양한 살아있는 골수 (BM) 파생된 줄기 및 전구 세포 인구에 있는 미토콘드리아 ROS를 분석하기 위한 교류 세포 측정 접근을 제시합니다. 구체적으로, 우리는 건강한 또는 백혈병 BM 세포가 미토콘드리아 과산화물을 검출하는 형광성 염료로 먼저 염색되고, 그 다음에 사용되는 불소크롬 연결된 단클론 항체로 염색하는 2 단계 세포 염색 과정을 기술합니다. 다양한 건강하고 악성 조혈 선조 집단을 구별합니다. 우리는 또한 유세포분석에 의한 시료를 획득하고 분석하기 위한 전략을 제공합니다. 전체 프로토콜은 3-4 시간만큼 짧은 시간 내에 수행 될 수있다. 우리는 또한 살아있는 조혈 및 백혈병 줄기 및 전구 소집단의 미토콘드리아 구획에서 ROS 생산을 모니터링하는 장점과 한계뿐만 아니라 유세포 측정에 의한 형광 염료를 사용하여 고려해야 할 주요 변수를 강조합니다. . 게다가, 우리는 미토콘드리아 ROS 풍부가 명백한 건강한 HSPC 하위 인구 및 백혈병 전구체 사이에서 변화한다는 것을 데이터를 제출하고 혈액학 연구에서 이 기술의 가능한 응용을 토론합니다.

서문

반응성 산소 종 (ROS)은 분자 산소에서 파생 된 반응성이 높은 분자입니다. ROS 생산의 가장 잘 정의 된 세포 위치는 미토 콘 드리 아, 어디 전자 수송 사슬을 통해 통과 하는 전자 (ETC) 산화 인 산화 동안 (OXPHOS) 특정의 형성으로 이어지는 분자 산소에 의해 흡수 수퍼 옥사이드^1이라고불리는 ROS의 유형 . 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 또는 SOD라고 하는 일련의 효소의 활동을 통해, 수퍼옥사이드는 과산화수소로 변환되며, 이 수소는 카탈라제 또는 글루타티온 과산화효소(GPX)와 같은 효소에 의해 물로 중화됩니다. ROS 조절 메커니즘의 교란은 종종 산화 스트레스라고도 하는 ROS의 과잉 생산으로 이어질 수 있으며, 이는 거대 분자 손상 (즉, DNA, 단백질, 지질)과 같은 유해하고 잠재적으로 치명적인 세포 결과를 가지고 있습니다. 더욱이, 산화 스트레스는 당뇨병, 염증성 질환, 노화 및 종양^2,3,4와같은 여러 병리와 관련이 있다. 항상성을 유지하고 산화 스트레스를 방지하기 위해 세포는 다양한 ROS 조절 메커니즘을 가지고^5.

특정 ROS의 생리수준은 적절한 배아 및 성인 조혈에 필요하다^6. 그러나, 과잉 ROS는 조혈 줄기 및 전구 풀의 DNA 손상, 세포 분화 및 고갈과 관련이 있다. 또한 레독스 생물학에 있는 변경백혈병과 건강한 세포 사이에서 다를 수 있다는 기록이 있습니다. 예를 들어, ROS 수준은 그들의 건강한 대조물의 대조와 다른 연구에 비해 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포에서 더 높은 경향이 백혈병 줄기 세포생존을 위한 ROS의 낮은 정상 상태 수준을 유지한다는 것을^{건의했습니다 7,8.} 중요한 것은, 이러한 산화물의 차이를 치료적으로 활용하기 위한 전략은 몇몇 인간적인 암 조정^9,10에서약속을 보여주었습니다. 그러므로, 마우스 모형에 있는 ROS 수준의 평가를 허용하는 분석제는 이 종이 세포 생리학 및 질병 병인에 어떻게 기여하는지의 우리의 이해를 향상할 수 있을 뿐만 아니라 잠재적으로 의 효과를 평가하기 위한 발판을 제공할 수 있습니다 새로운 레독스 표적 항암 치료.

프로토콜

이 프로토콜에 설명된 모든 동물 절차는 폭스 체이스 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

참고: 프로토콜 워크플로는 그림 1에 나와 있는 대로 4부분으로 나뉘며 필요한 시약은 재료 표에나열되어 있습니다.

1. 골수 (BM) 격리

참고: MLL-AF9 백혈병 마우스는 앞서^11일기재한 바와 같이 생성되었다.

1. 앞서 설명한 바와 같이,^12,13,14,15,야생형 C57.Bl6 마우스(CD45.2 정성 마커를 발현)와 C57로부터 회수한다. MLL-AF9 발현 백혈병 세포로 이식된 Bl6-SJL 마우스(CD45.1 동시 마커)(CD45.2+).
   참고: BM은^12,13을 분쇄하거나 뼈^14,15를플러시하여 마우스에서 회복 할 수 있습니다. 여기에 제시된 실험을 위해, BM은 플러싱을 통해 건강한 및 백혈병 마우스 둘 다에서 회복되었다.

2. 미토콘드리아 ROS 형광염료 염색

1. 일단 단핵 골수 세포가 건강한 및/또는 백혈병 마우스에서 회복되면, Trypan Blue로 세포의 별칭을 얼룩지게 하고 총 BM 세포의 시작 수를 결정하기 위해 혈세포계를 사용하여 계산합니다.
2. 세포를 300 x g에서 5 분 동안 흡인하고 F-PBS (2 % 태아 소 혈청과 1 % 페니실린 / 스트렙 토마이신 칵테일로 보충 된 PBS)에서 펠릿을 2 x 10⁶ 세포 / mL의 농도로 다시 중단시요.
3. 다음과 같이 표시된 9개의 단색 제어 튜브로 튜브당 세포 현탁액의 Aliquot 200 μL:
   얼룩 없음, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (건강한 HSPC전용), CD45.2-APC (백혈병 세포전용), CD34-FITC, 미토콘드리아 ROS 염료 및 라이브/죽은 세포 얼룩.
   참고: (선택 사항) 미토콘드리아 ROS의 유도에 대한 양성 대조군은 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 20 μL에서 200 μL에서 2 x 10⁵ 세포를 메나디온 나트륨 비설핏(MSB)으로 처리함으로써 제조될 수 있다. 미토콘드리아 ROS의 MSB 매개 유도를 역전시키는 제2 대조군은 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 MSB 플러스 100 μM 플러스 100 μM N-아세틸-L-시스테인(NAC)으로 2x10 5 세포에서 2 x 10⁵ 세포를 처리함으로써 제조될 수 있다.
4. 5 분 동안 300 x g에서 튜브 (실험 튜브) 및 원심 분리기에 남아있는 세포를 알리쿼트.
5. 제조업체의 지침에 따라 라이브/데드 셀 얼룩으로 F-PBS의 셀을 다시 일시 중단합니다. 30 분 동안 얼음에 배양. 단색 제어 튜브에 살아있는 / 죽은 얼룩을 추가해야합니다.
6. 실온(RT) F-PBS 1.0mL를 살아있는/죽은 염료로 얼룩진 단일 색상 및 실험 용 튜브에 추가합니다. RT에서 300 x g에서 5 분.
7. 50 μg의 미토콘드리아 ROS 염료를 13 μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 재중단하여 5 mM 스톡 용액을 얻었다.
8. 미라파밀(50 μM)의 유무에 관계없이 RT F-PBS에서 미토콘드리아 ROS 염료를 5 μM의 최종 농도로 희석한다.
9. 살아있는/ 죽은 세포 얼룩의 세척을 흡인합니다. 각 실험 튜브뿐만 아니라 미토콘드리아 ROS 염료 단색 제어 튜브에 베라파밀을 함유하는 미토콘드리아 ROS 염료 얼룩 200 μL을 첨가한다.
10. 소용돌이를 혼합하고 어둠 속에서 37°C에서 10분 동안 배양한다.
11. 미토콘드리아 ROS 염색 단색 제어 및 실험 튜브에 RT F-PBS 1.0 mL을 추가합니다. RT에서 300 x g에서 5 분.
12. 상한체에서 흡인하고 RT F-PBS의 추가 1.0 mL로 세포를 세척합니다. RT에서 300 x g에서 5 분.

3. 계보 항체 염색

1. 표 1에열거된 항체 칵테일을 준비한다.
   참고: 이러한 항체 칵테일은 이전에^{14,15,16으로}최적화되었습니다.
2. 건강한 BM을 함유하는 실험튜브의 최종 미토콘드리아 ROS 염료 세척으로부터 상판을 흡인하고 각 튜브에 #1 항체 칵테일의 200 μL을 첨가한다. 혼합 하는 소용돌이. 또한 단색 제어 튜브를 준비합니다. 어둠 속에서 얼음에 60 분 동안 배양.
3. 백혈병 BM을 포함하는 실험 튜브의 최종 미토콘드리아 ROS 염료 세척으로부터 상판을 흡인하고 각 튜브에 #2 항체 칵테일의 200 μL을 첨가한다. 혼합 하는 소용돌이. 어둠 속에서 얼음에 60 분 동안 배양.
4. 1.0 mL의 차가운 F-PBS와 RT에서 300 x g에서 원심 분리기 5 분으로 씻으소서.
5. 차가운 F-PBS의 500 μL에서 세포를 재중단하고 응집체를 배제하기 위해 40 μm 필터를 사용하여 유동 세포계 튜브에서 세포를 필터링합니다.

4. 유세포 분석 수집 및 분석

참고: 몇몇 조혈 줄기 및 전구체 부세트는 장기 조혈 줄기 세포와 같은 희소합니다. 따라서, 이상적으로는 다양한 HSPC 서브세트에서 미토콘드리아 ROS의 충분한 분석을 위해 유세포분석 수집 동안 각 실험관에 대해 3-5백만 개의 이벤트를 수집해야 한다.

1. 무얼룩 제어 튜브를 사용하여 분석된 셀 집단의 크기와 복잡성에 따라 전방(FSC-A) 및 측면(SSC-A) 산란플롯을 설정합니다.
2. 유세포계를 보정하기 위해 얼룩 없음 및 단색 제어 튜브를 사용합니다.
3. 전방 및 측면 산란 플롯에서 외부 파편을 게이트 아웃(그림 2A, B,왼쪽에서 첫 번째 패널).
4. 전방 판별기(그림2A, B,왼쪽에서 두 번째 패널)와 같은 이중 판별체를 사용하여 더블을 게이트아웃합니다.
5. 도 2A,B에서 제안된 게이팅 전략을 따라 살아있는 세포, 계보 저세포 및 다양한 HSPC 및 백혈병 서브세트를 선택한다.
6. 관심 있는 각 집단에 대해, 히스토그램 플롯에서 TRPE 채널(x축)의 중간 형광 강도(MFI)를 분석하여 미토콘드리아 ROS 신호의 차이를 평가하였다(그림3A-C,좌측 패널). 미토콘드리아 ROS의 수준은 산란플롯에서 특정 계보 마커 대 미토콘드리아 ROS 염색을 비교하여 단일 세포 수준에서 평가될 수 있다.

결과

제시된 것은 다중 건강 및 MLL-AF9 발현 백혈병 전구 집단의 미토콘드리아에서 ROS를 분석하는 방법이다. 그림 1은 4개의 주요 단계로 구성된 프로토콜 워크플로우의 개략적 보기를 표시합니다: 1) 마우스로부터의 BM 격리; 2) 미토콘드리아 ROS, 특히 과산화물을 인식하는 형광성 염료로 BM 세포를 염색하는 단계; 3) 다양한 건강 및 백혈병 조혈 인구를 묘사하기 위해 표면 마커 항체...

토론

ROS의 검출을 위해 개발된 형광 염료는 현미경 검사법또는 살아있는 세포에서 유세포분석법^22에의해 고정된 세포에서 자주 평가된다. 미토콘드리아 ROS 형광 염료를 사용하여 BM 세포에서 미토콘드리아 ROS의 유세포측정 평가는 두 가지 주요 장점을 가지고 있습니다: 1) 살아있는 세포 분석에 적합한 빠르고 간단한 기술이며 2) 희귀를 구별하고 분석할 수 있습니다. 표면 마커 염색?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heat inactivated FBS	VWR Seradigm LIFE SCIENCE	97068-085	Media
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI	Media
PBS	Fisher Scientific	BP399-20	Buffer
15 mL conical tube	BD falcon	352096	Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube	BD falcon	352098	Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers	Fisher Scientific	22-363-547	Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer	Fisher Scientific	50-112-9751	Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite	Sigma aldrich	M5750	Pro-oxidant
NAC	Sigma aldrich	A7250	Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11	Biolegend	100310	Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5	eBioscience	15-0041-81	Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7	eBioscience	15-0081-81	Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5	Biolegend	115510	Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2	Biolegend	103210	Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5	Biolegend	108410	Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119	Biolegend	116210	Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1	Biolegend	103420	Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8	Biolegend	105825	Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7	Biolegend	108120	Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2	Biolegend	115909	Antibody
CD34 FITC clone RAM34	BD Bioscience	553733	Antibody
CD45.2 APC clone 104	Biolegend	1098313	Antibody
MitoSOX Red	ThermoFisher Scientific	M36008	Dye
Mitotracker Green	ThermoFisher Scientific	M7514	Dye
Live/dead Yellow Dye	ThermoFisher Scientific	L34967	Dye