הזרמת כדוריות הדם של מיני חמצן מיטוכונדריאלי מורטין בגזע ובתאי מחולל ולוקמיה מונחה AF9

Summary

אנו מתארים שיטה עבור שימוש בזרימה רב פרמטרים cy, לנסות לזהות מיני מיטוכונדריאלי מינים חמצן (ROS) ב מורטין גזע בריא המטבית ובתאי מחולל (HSPCs) ותאי לוקמיה ממודל העכבר של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) מונע על ידי MLL-AF9.

Abstract

אנו מציגים את הגישה cytometric הזרימה עבור ניתוח מיטוכונדריאלי של רוס החיים שונים מח עצם (BM)-גזע נגזר ואוכלוסיות תאים מחולל שונות עכברים בריאים, כמו גם עכברים עם AML מונע על ידי MLL-AF9. באופן ספציפי, אנו מתארים תהליך מכתים של שני שלבים, לפיו תאים בריאים או לוקמיה מוכתמים הראשון עם צבע פלואורוגנטי המזהה על-ידי מיטוכונדריאלי, ואחריו כתמים עם נוגדנים monoochrome מקושרים המקושרים המשמשים כדי להבחין בין אוכלוסיות שונות בריאות וממאירות של המטפאות. כמו כן, אנו מספקים אסטרטגיה לרכישת וניתוח הדגימות על-ידי הזרמת cy, try. הפרוטוקול כולו יכול להתבצע בתוך פרק זמן קצר כמו 3-4 h. אנו גם להדגיש את המשתנים מפתח לשקול, כמו גם את היתרונות ואת המגבלות של ניטור הייצור של ROS בתוך תא מיטוכונדריאלי של לחיות המטפאות לוקמיה גזע ומתת באמצעות צבעים fluorogenic על ידי הזרמת cy, . יתר על כן, אנו מציגים נתונים כי השפע מיטוכונדריאלי משתנה בין אוכלוסיות משנה בריאה HSPC בריא ו לוקמיה ושלתי ולדון ביישומים האפשריים של טכניקה זו במחקר המטקולוגי.

Introduction

מינים חמצן תגובתי (ROS) הם מולקולות תגובתי מאוד הנגזרות חמצן מולקולרי. המיקום הסלולארי המוגדר ביותר של הייצור של ROS הוא המיטוגיה, שם אלקטרונים העוברים דרך שרשרת התחבורה אלקטרון (וכו ') במהלך זירחון חמצוני (OXPHOS) נספגים על ידי חמצן מולקולרי המוביל היווצרות של מסוים סוג של רוס שנקרא סופרתחמוצות¹. באמצעות הפעולות של סדרה של אנזימים, שנקרא סופראוקסיד dismutases או sods, סופראוקסיד מומרים לתוך מימן, אשר מנוטרלים לאחר מכן לתוך מים על ידי אנזימים כגון קטלאז או peroxidases גלוטתיון (gpx). רטבאליות במנגנונים ROS-רגולטוריות יכול להוביל לייצור עודף של ROS, המכונה לעתים קרובות לחץ חמצוני, אשר יש תוצאות מזיקות וקטלניות פוטנציאל הסלולר כגון נזק מקרומולקולה (כלומר, DNA, חלבון, שומנים). יתר על כן, לחץ חמצוני קשורה מספר פתווגיות, כגון סוכרת, מחלות דלקתיות, הזדקנות וגידולים^2,3,4. כדי לשמור על הומאוסטזיס מחדש ולמנוע לחץ חמצוני, התאים בעלי מגוון של מנגנונים ROS-ויסות⁵.

רמות פיסיולוגיים של ROS מסוימים נחוצים עבור המטפיאה המתאימה ומבוגרים⁶. עם זאת, העודפים ROS קשורה עם נזק DNA, בידול הסלולר ותשישות של גזע המטפאות ובריכת מחולל קדמון. יש גם ראיות כי שינויים בביולוגיה החמצון עשוי להיות שונה בין לוקמיה ותאים בריאים. לדוגמה, רמות ROS נוטים להיות גבוהים יותר בלוקמיה של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) ביחס לעמיתיהם הבריאים שלהם ומחקרים אחרים הציעו כי תאי גזע לוקמיה לשמור על רמה נמוכה יציבה המדינה של רוס להישרדות^7,8. חשוב מכך, אסטרטגיות לקבלת הבדלי מחלות מבחינה רפואית בהבדלים הללו הראו הבטחה במספר הגדרות סרטן^{האדם 9,10}. לכן, בחני אומר כי לאפשר הערכה של רמות ROS בדגמי העכבר עשוי לשפר את ההבנה שלנו איך מינים אלה תורמים לפיזיולוגיה הסלולר מחלות פתוגנזה, כמו גם פוטנציאל לספק פלטפורמה להערכת האפקטיביות של הרומן נגד חמצון-מיקוד טיפולים נגד סרטן.

Protocol

כל ההליכים בעלי החיים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) במרכז הסרטן של פוקס צ'ייס.

הערה: תהליך העבודה של הפרוטוקול מחולק ל -4 חלקים כפי שמוצג באיור 1 והריאגנטים הנדרש מפורטים בטבלת החומרים.

1. מח עצם (BM) בידוד

הערה: MLL-AF9 עכברים לוקמיה נוצרו כמתואר בעבר¹¹.

1. שחזור מונו-גרעיני מח עצם בתאי, כפי שמתואר בעבר^12,13,14,15, מסוג פראי C57. Bl6 עכברים (אשר לבטא את התקליטור 45.2 congenic) כמו גם מ C57. עכברים Bl6-SJL (אשר מבטאים את סמן CD 45.1 congenic) כי כבר מושתלים עם MLL-AF9-ביטוי תאים לוקמיה (CD 45.2⁺).
   הערה: BM ניתן לשחזר מעכברים או על ידי ריסוק^12,13 או על ידי^{שטיפה עצמות 14,15}. עבור הניסויים המוצגים כאן, BM התאושש משני עכברים בריאים ולוקמיה דרך השטיפה.

2. מיטוכונדריאלי רוס Fluorogenic צביעת כתמים

1. ברגע מונו-גרעיני מוח העצם התאים התגלו מעכברים בריאים ו/או לוקמיה, כתם סדרת מחלקים של תאים עם טריקון כחול ולספור באמצעות הומוציטוטומטר כדי לקבוע את המספר ההתחלתי של התאים BM סך.
2. צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות. ומריף את הסופרנטאנט ולהשעות את הגלולה ב-F-PBS (PBS בתוספת 2% סרום העוברי העובר ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין קוקטייל) לריכוז של 2 x 10⁶ תאים/mL.
3. Aliquot 200 μL של השעיית תא לצינור לתוך 9 בודד צינורות בקרת צבע המסומנים כדלקמן:
   אין כתם, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (עבור HSPCs בריא בלבד), תקליטור 45.2-APC (עבור תאים לוקמיה בלבד), CD34-FITC, לצבוע מיטוכונדריאלי ולחיות/תא המתים כתם.
   הערה: אופציונלי שליטה חיובית אינדוקציה ROS מיטוכונדריאלי יכול להיות מוכן על ידי טיפול 2 x 10⁵ תאים ב 200 μl עם 20 Μm של נתרן ביסולפיט (msb) עבור 1 h ב 37 ° צ' ב 5% CO₂ חממה. פקד שני כדי להפוך את האינדוקציה MSB-בתיווך של מיטוכונדריאלי יכול להיות מוכן על ידי בטיפול 2 x 10⁵ תאים ב 200 μl עם 20 ΜM של msb פלוס 100 Μm N-מרחקסיל-L-cysteine (nac) עבור 1 h ב 37 ° c ב 5% שיתוף₂ אינקובטור.
4. מחבר את התאים הנותרים בצינור (צינור ניסיוני) ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.
5. השהה מחדש את התאים ב-F-PBS עם כתם חי/מת בהתאם להוראות היצרן. מודקון על הקרח 30 דקות. הקפד להוסיף כתם חי/מת לצינור הבקרה בצבע יחיד.
6. הוסף 1.0 mL של טמפרטורת החדר (RT) F-PBS לצינורות בצבע יחיד וניסיוני מוכתם עם צבע חי/מת. צנטריפוגה 5 דקות ב 300 x g ב RT.
7. השהה מחדש 50 μg של הצבע המודריאלי של רוס ב -13 μL של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי לקבל פתרון מניות של 5 מ"מ.
8. לדלל את הצבע מיטוכונדריאלי לריכוז הסופי של 5 μM ב RT F-PBS עם או בלי Verapamil (50 μM).
9. מוריד את הכתמים. מכתם התא החי/מת הוסף 200 μL של כתם מיטוכונדריאלי של צבע רוס המכיל Verapamil לכל שפופרת ניסיוני, כמו גם את הצינור מיטוכונדריאלי צבע יחיד בקרת שליטה.
10. מערבולת לערבב ו הדגירה עבור 10 דקות ב 37 ° c בחושך.
11. הוסף 1.0 מ ל של RT F-PBS כדי מיטוכונדריאלי רוס המוכתמת שליטה בצבע יחיד ושפופרות ניסיוני. צנטריפוגה 5 דקות ב 300 x g ב RT.
12. ושטוף את התאים עם 1.0 מ ל של RT F-PBS. צנטריפוגה 5 דקות ב 300 x g ב RT.

3. נוגדן השושלת כתמים

1. הכינו את משקאות הנוגדן המפורטים בטבלה 1.
   הערה: אלה קוקטיילים נוגדנים כבר אופטימיזציה בעבר^14,15,16.
2. מטפי את supernatant מן האחרון מיטוכונדריאלי לשטוף לצבוע של צינורות ניסיוני המכיל BM בריא ולהוסיף 200 μL של קוקטייל הנוגדן #1 לכל צינור. . מערבולת לערבב גם להכין את צינורות בקרת צבע אחד. דגירה של 60 דקות על קרח בחושך.
3. מטפי את supernatant משטיפת מיטוכונדריאלי הסופי של הצינורות הניסיוניים המכילים לוקמיה BM ולהוסיף 200 μL של קוקטייל הנוגדן #2 לכל צינור. . מערבולת לערבב דגירה של 60 דקות על קרח בחושך.
4. לשטוף עם 1.0 mL של קר F-PBS ו צנטריפוגה 5 דקות ב 300 x g ב RT.
5. להשעות את התאים ב500 μl של קר F-PBS ולסנן את התאים בצינור cytometer זרימה באמצעות מסנן 40 יקרומטר כדי לכלול את האגרגטים.

4. הזרמת הרכש והניתוח

הערה: מספר מערכות המשנה של גזע ומין המטפאות הן נדירות, כגון תאי גזע המטפאות לטווח ארוך. כך, באופן אידיאלי 3-5 מיליון אירועים יש לאסוף עבור כל צינור ניסיוני במהלך הרכישה cy, לנסות ניתוח מספיק של רוס מיטוכונדריאלי בקבוצות משנה HSPC שונים.

1. השתמש בצינור הבקרה ללא כתם כדי להגדיר את מחלקות הפיזור הפורוורד (FSC-A) והצד (האס-אס), המבוססות על הגודל והמורכבות של אוכלוסיית התאים שנותחה.
2. השתמש בצינורות בקרת הכתמים והצבע היחיד כדי לפצות על הזרימה של cytometer.
3. שער החוצה שרידים זרים מתוך החלקה קדימה ופיזור בצד (איור 2A, B, הפאנל הראשון משמאל).
4. השער החוצה כפולה באמצעות מבדיל כפול כגון מבדיל קדימה (איור 2א, ב, הפאנל השני משמאל).
5. בצע את אסטרטגיית השידור המוצעת באיור 2A,B כדי לבחור תאים חיים, השושלת הנמוכה תאים וערכות המשנה hspc ולוקמיה שונים.
6. עבור כל אוכלוסיית עניין, לנתח את עוצמת הקרינה החציוני (MFI) של ערוץ TRPE (x-ציר) בעלילה היסטוגרמה כדי להעריך את ההבדלים באות רוס מיטוכונדריאלי (איור 3a-C, שמאל חלוניות). רמות של מיטוכונדריאני יכול להיות מוערך ברמה תא יחיד על ידי השוואת כתמים ROS מיטוכונדריאלי לעומת סמנים ספציפיים השושלת בעלילה פיזור.

תוצאות

הציג הוא שיטה לניתוח ROS ב המיטו, בריאות מרובות ו-MLL-AF9-ביטוי של אוכלוסיות לוקמיה. איור 1 מציג תצוגה סכמטית של זרימת העבודה של הפרוטוקול, המורכבת מ-4 שלבים עיקריים: 1) בידוד מעכברים; 2) צביעת תאי מוניטור עם צבע פלואורוגנטי המזהה ROS מיטוכונדריאלי, במיוחד סופרתחמוצות; 3) לסמן את הנוגד...

Discussion

צבעים fluorogenic כי פותחו לאיתור של ROS מוערכים לעתים קרובות בתאים קבועים על ידי מיקרוסקופ או בתאים חיים על ידי הזרימה cy, try²². הערכת הערכה לזרימה של רוס מיטוכונדריאלי בתאי BM באמצעות צבעי fluorogenic מיטוכונדריאלי יש שני יתרונות עיקריים: 1) זוהי טכניקה מהירה ופשוטה המתאימה לניתוח תאים חיים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heat inactivated FBS	VWR Seradigm LIFE SCIENCE	97068-085	Media
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI	Media
PBS	Fisher Scientific	BP399-20	Buffer
15 mL conical tube	BD falcon	352096	Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube	BD falcon	352098	Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers	Fisher Scientific	22-363-547	Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer	Fisher Scientific	50-112-9751	Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite	Sigma aldrich	M5750	Pro-oxidant
NAC	Sigma aldrich	A7250	Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11	Biolegend	100310	Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5	eBioscience	15-0041-81	Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7	eBioscience	15-0081-81	Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5	Biolegend	115510	Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2	Biolegend	103210	Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5	Biolegend	108410	Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119	Biolegend	116210	Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1	Biolegend	103420	Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8	Biolegend	105825	Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7	Biolegend	108120	Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2	Biolegend	115909	Antibody
CD34 FITC clone RAM34	BD Bioscience	553733	Antibody
CD45.2 APC clone 104	Biolegend	1098313	Antibody
MitoSOX Red	ThermoFisher Scientific	M36008	Dye
Mitotracker Green	ThermoFisher Scientific	M7514	Dye
Live/dead Yellow Dye	ThermoFisher Scientific	L34967	Dye