Поток Цитометрический анализ митохондриальных реактивных видов кислорода в Мурин гематопоитических стволовых и прародителей клеток и MLL-AF9 Driven лейкемии

Резюме

Мы описываем метод использования многопараметрического потока цитометрии для обнаружения митохондриальных реактивных видов кислорода (ROS) в мурин здоровых гематопоиетических стволовых и прародителей клеток (HSPCs) и лейкозных клеток из мышиной модели острого миелоидного лейкоза (AML) обусловлен MLL-AF9.

Аннотация

Мы представляем циклометрический подход потока для анализа митохондриального ROS в различных живых костных мозгах (БМ) полученных стволовых и прародителей клеток населения от здоровых мышей, а также мышей с AML обусловлен MLL-AF9. В частности, мы описываем двухступенчатый процесс окрашивания клеток, в котором здоровые или лейкозные клетки БМ сначала окрашиваются флюорогенным красителем, который обнаруживает митохондриальные супероксиды, а затем окрашивает с флюрохром-связанных моноклональных антител, которые используются различать различные здоровые и злокачественные популяции гематопоиетических прародителей. Мы также предоставляем стратегию для приобретения и анализа образцов с помощью цитометрии потока. Весь протокол может быть выполнен в срок, как короткие, как 3-4 ч. Мы также подчеркиваем ключевые переменные, которые следует учитывать, а также преимущества и ограничения мониторинга производства ROS в митохондриальном отсеке живой гематопоитической и лейкозной стеблей и субпопуляций гененора с использованием флюорогенных красителей при цитометрии потока . Кроме того, мы представляем данные о том, что митохондриальные ROS изобилие варьируется между различными здоровыми HSPC субпопуляций и лейкемии прародителей и обсудить возможные применения этой техники в гематологических исследований.

Введение

Реактивные виды кислорода (ROS) являются высокореактивными молекулами, полученными из молекулярного кислорода. Наиболее четко определенным клеточным расположением производства ROS являются митохондрии, где электроны, проходящие через цепочку транспортировки электронов (ETC) во время окислительного фосфорилирования (OXPHOS), поглощаются молекулярным кислородом, ведущим к образованию специфического тип ROS называется^{супероксиды 1}. Благодаря действиям ряда ферментов, называемых супероксидными дисмутазами или СОД, супероксиды преобразуются в перекиси водорода, которые впоследствии нейтрализуются в воду такими ферментами, как каталаза или глутатион пероксидаза (GPX). Возмущения в механизмах РОСрегулирования могут привести к избыточному производству ROS, часто называемого окислительным стрессом, которые имеют вредные и потенциально смертельные клеточные последствия, такие как повреждение макромолекулы (т.е. ДНК, белок, липиды). Кроме того, окислительный стресс связан с несколькими патологиями, такими как диабет, воспалительные заболевания, старение и опухоли^2,3,4. Для поддержания редокс гомеостаза и предотвращения окислительного стресса, клетки обладают различными механизмами, регулирующими СЕБЯ^5.

Физиологические уровни некоторых ROS необходимы для правильного эмбрионального и взрослого гематопоезии⁶. Однако избыток ROS связан с повреждением ДНК, клеточной дифференциацией и истощением гематопоиетического стебля и бассейна-прародителя. Существует также доказательство того, что изменения в биологии Redox могут отличаться между лейкемией и здоровыми клетками. Например, уровни ROS, как правило, выше в острой миелоидной лейкемии (AML) клетки по сравнению с их здоровыми коллегами и другие исследования показали, что лейкемия стволовые клетки поддерживать низкий устойчивый уровень ROS для выживания^7,8. Важно отметить, что стратегии терапевтической капитализации на этих различиях Redox показали обещание в нескольких условиях рака человека^9,10. Таким образом, анализы, которые позволяют оценить уровни ROS в моделях мышей, могут улучшить наше понимание того, как эти виды способствуют клеточной физиологии и патогенеза заболеваний, а также потенциально обеспечивают платформу для оценки эффективности новые редокс-таргетинга противораковой терапии.

протокол

Все процедуры для животных, описанные в этом протоколе, были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) в онкологическом центре Фокс Чейз.

ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс протокола делится на 4 части, представленные на рисунке 1, и необходимые реагенты перечислены в таблице материалов.

1. Изоляция костного мозга (БМ)

ПРИМЕЧАНИЕ: MLL-AF9 лейкемии мышей были созданы, как описано ранее¹¹.

1. Восстановление моноядерных клеток костного мозга, как описано ранее^12,13,14,15, от диких мышей типа C57.Bl6 (которые выражают CD45.2 конгенический маркер), а также от C57. Bl6-SJL мышей (которые выражают CD45.1 конгенический маркер), которые были пересажены с MLL-AF9-выражения лейкозных клеток (CD45.2⁾).
   ПРИМЕЧАНИЕ: БМ может быть извлечена из мышей либо путем дробления^12,13 или промывки костей^14,15. Для экспериментов, представленных здесь, БМ был извлечен из здоровых и лейкозных мышей с помощью промывки.

2. Митохондриальный ROS фторгенный краситель окрашивания

1. После того, как моноядерные клетки костного мозга были извлечены из здоровых и / или лейкемии мышей, пятно аликот клеток с Trypan Blue и рассчитывать с помощью гемоцитометра, чтобы определить начальное число общих клеток БМ.
2. Центрифуги клетки на 300 х г в течение 5 мин. Аспирировать супернатант и resuspend гранулы в F-PBS (PBS дополнены 2% плода бычьей сыворотки и 1% пенициллина / стрептомицина коктейль) в концентрации 2 х 10⁶ клеток / мл.
3. Aliquot 200 л клеточной подвески на трубку в 9 одноцветных контрольных трубах с пометкой следующим образом:
   Нет пятна, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (только для здоровых HSPCs), CD45.2-APC (только для клеток лейкемии), CD34-FITC, Митохондриальный ROS dye и Live / мертвые пятна клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательно) Положительный контроль для индукции митохондриального ROS может быть подготовлен путем лечения 2 х 10⁵ клеток в 200 ЗЛ с 20 МКм Менадион натрия Бисульфит (MSB) для 1 ч при 37 градусах По Цельсия в 5% CO₂ инкубатора. Второй контроль, чтобы обратить вспять MSB-опосредованного индукции митохондриальной ROS может быть подготовлен путем лечения 2 х 10⁵ клеток в 200 QL с 20 МКм МСБ плюс 100 ММ N-ацетил-L-цистеин (NAC) для 1 ч при 37 кв С в 5% CO₂ инкубатора.
4. Aliquot оставшиеся клетки в трубке (экспериментальная трубка) и центрифуги на 300 х г в течение 5 мин.
5. Resuspend клетки в F-PBS с живым / мертвым пятном клетки в соответствии с инструкциями производителя. Инкубировать на льду в течение 30 мин. Не забудьте добавить живое/ мертвое пятно в одноцветную трубку управления.
6. Добавьте 1,0 мл комнатной температуры (RT) F-PBS как к одноцветным, так и к экспериментальным трубам, окрашенным живым/мертвым красителями. Центрифуга 5 мин при 300 х г на RT.
7. Отрежь 50 мкг митохондриального красителя ROS в 13 л диметилсулькоксида (DMSO) для получения раствора запаса 5 мм.
8. Разбавить митохондриальный краситель ROS до конечной концентрации 5 мкм в РТ F-PBS с верапамилом или без него (50 мкм).
9. Аспирируй от мытья живого/ мертвого пятна клетки. Добавьте 200 зЛ митохондриального красителя ROS, содержащего верапамил, к каждой экспериментальной трубке, а также митохондриальную трубку управления красителем ROS.
10. Вихрь смешать и инкубировать в течение 10 минут при 37 градусов по Цельсию в темноте.
11. Добавьте 1,0 мл RT F-PBS в митохондриальные росцветные одноцветные элементы управления и экспериментальные трубки. Центрифуга 5 мин при 300 х г на RT.
12. Отпрыгивайте супернатант и промойте клетки дополнительными 1,0 мл RT F-PBS. Центрифуга 5 мин при 300 х г на RT.

3. Линия Антитела Запятнание

1. Подготовка антител коктейли, перечисленные в таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти антитела коктейли были оптимизированы ранее^14,15,16.
2. Аспирировать супернатант из окончательного митохондриального ROS красителя мыть экспериментальных труб, содержащих здоровые БМ и добавить 200 л антитела коктейль #1 к каждой трубке. Вихрь смешать. Также подготовьте одноцветные контрольные трубки. Инкубировать в течение 60 минут на льду в темноте.
3. Аспирировать супернатант из окончательного митохондриального ROS красителя мыть экспериментальных труб, содержащих лейкемия БМ и добавить 200 л антитела коктейль #2 к каждой трубке. Вихрь смешать. Инкубировать в течение 60 минут на льду в темноте.
4. Вымойте 1,0 мл холодного F-PBS и центрифугу 5 мин при 300 х г на RT.
5. Resuspend клетки в 500 л холодных F-PBS и фильтровать клетки в потоке цитометр трубки с помощью фильтра 40 мкм, чтобы исключить агрегаты.

4. Поток Цитометрии Приобретение и анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько гематопоитических стволовых и прародителей подмножества редки, такие как долгосрочные гематопоиэтитические стволовые клетки. Таким образом, в идеале 3-5 миллионов событий должны быть собраны для каждой экспериментальной трубки во время приобретения цитометрии потока для достаточного анализа митохондриального ROS в различных подмножествах HSPC.

1. Используйте трубку управления без пятен, чтобы установить вперед (FSC-A) и боковые (SSC-A) рассеивания участков в зависимости от размера и сложности проанализированных популяций клеток.
2. Используйте без пятна и одноцветные трубки управления, чтобы компенсировать поток цитометра.
3. Выстрывайте посторонний мусор с переднего и бокового рассеяния(рисунок 2A,B, первая панель слева).
4. Ворота из дублетов с помощью двойного дискриминационного, таких как передний дискриминационный(Рисунок 2A, B, вторая панель слева).
5. Следуйте стратегии gating, предложенной на рисунке 2A,B, чтобы выбрать живые клетки, линии низких клеток и различных подмножества HSPC и лейкемии.
6. Для каждой группы, интересуемая, проанализируйте среднюю интенсивность флуоресценции (МФИ) канала TRPE (x-оси) в гистограммном графике для оценки различий в сигнале митохондриального ROS(рисунок 3A-C, левые панели). Уровни митохондриального ROS можно оценить на одноклеточном уровне, сравнив митохондриальные окрашивания ROS с конкретными маркерами линии в участке рассеяния.

Результаты

Представлен метод анализа ROS в митохондриях нескольких здоровых и MLL-AF9-выражения популяций декариата. Рисунок 1 отображает схематическое представление рабочего процесса протокола, которое состоит из 4 основных шагов: 1) изоляция БМ от мышей; 2) Окрашивание бМ клеток с флу?...

Обсуждение

Флюорогенные красители, которые были разработаны для обнаружения ROS часто оцениваются в фиксированных клетках с помощью микроскопии или в живых клетках цитометрии потока²². Поток цитометрической оценки митохондриального ROS в клетках БМ с использованием митохондриальных ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heat inactivated FBS	VWR Seradigm LIFE SCIENCE	97068-085	Media
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI	Media
PBS	Fisher Scientific	BP399-20	Buffer
15 mL conical tube	BD falcon	352096	Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube	BD falcon	352098	Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers	Fisher Scientific	22-363-547	Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer	Fisher Scientific	50-112-9751	Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite	Sigma aldrich	M5750	Pro-oxidant
NAC	Sigma aldrich	A7250	Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11	Biolegend	100310	Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5	eBioscience	15-0041-81	Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7	eBioscience	15-0081-81	Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5	Biolegend	115510	Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2	Biolegend	103210	Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5	Biolegend	108410	Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119	Biolegend	116210	Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1	Biolegend	103420	Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8	Biolegend	105825	Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7	Biolegend	108120	Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2	Biolegend	115909	Antibody
CD34 FITC clone RAM34	BD Bioscience	553733	Antibody
CD45.2 APC clone 104	Biolegend	1098313	Antibody
MitoSOX Red	ThermoFisher Scientific	M36008	Dye
Mitotracker Green	ThermoFisher Scientific	M7514	Dye
Live/dead Yellow Dye	ThermoFisher Scientific	L34967	Dye